酶法提取金針菇菇腳可溶性膳食纖維的工藝優(yōu)化

李明華，孟秀梅，陸正清*，陳　軍

（江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學院生物與化學工程學院，江蘇淮安223003）

酶法提取金針菇菇腳可溶性膳食纖維的工藝優(yōu)化

李明華，孟秀梅，陸正清*，陳軍

（江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學院生物與化學工程學院，江蘇淮安223003）

以金針菇菇腳為原料，對纖維素酶法提取可溶性膳食纖維的工藝條件進行了優(yōu)化。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，考察了液料比、加酶量和酶解時間對可溶性膳食纖維提取率的影響，通過響應面法確定最佳提取工藝。結(jié)果表明，在物料粒度80目、液料比19∶1（m L∶g）、加酶量42 U/g、酶解時間2 h的條件下，金針菇菇腳可溶性膳食纖維的提取率最高，為14.45%。說明應用響應面法優(yōu)化纖維素酶法提取可溶性膳食纖維的工藝是一種行之有效的方法。

金針菇菇腳；可溶性膳食纖維；纖維素酶；響應面法

金針菇，學名毛柄金錢菌（Flammulina velutipes），是我國最早進行人工栽培的食用菌之一，產(chǎn)量僅次于香菇、黑木耳和平菇，位居第四位。金針菇富含蛋白質(zhì)、多糖、膳食纖維以及多種氨基酸、維生素和鐵、鋅、硒等微量元素，具有很高的藥用食療價值［1］。金針菇除了直接鮮食外，還以其為原料加工成金針菇面條、飲料、果凍、酸奶等食品［2-5］。

在金針菇生產(chǎn)及加工過程中，產(chǎn)生了大量的菇腳、菌柄等下腳料，這些下腳料含有豐富的蛋白質(zhì)、膳食纖維和多糖等物質(zhì)，但往往不經(jīng)過處理即直接丟棄，既污染了環(huán)境又造成了極大的資源浪費。因此，充分利用金針菇加工副產(chǎn)物勢在必行。近年來，已有少量從金針菇下腳料提取生物活性物質(zhì)的報道，如應用微波或超聲輔助法浸提多糖［6-8］、應用堿提工藝提取蛋白質(zhì)［9-10］等。此外，黃家莉等［11-12］應用堿提法提取了金針菇菇腳中不可溶性膳食纖維（insoluble dietary fiber，IDF）和可溶性膳食纖維（soluble dietary fiber，SDF）。膳食纖維具有優(yōu)良的生理保健功能［13-15］，在維持膳食平衡方面發(fā)揮著重要作用，被稱為人類“第七大營養(yǎng)素”。應用堿提法提取膳食纖維除了會產(chǎn)生大量的廢水外，制備的產(chǎn)品顏色較深，不適合食品、藥品工業(yè)的進一步加工［16］。因此，本研究以金針菇菇腳為原料，應用纖維素酶法提取SDF，并采用響應面法優(yōu)化其提取工藝參數(shù)，以期為金針菇下腳料的充分利用提供一定的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

金針菇菇腳：新鮮金針菇購于農(nóng)貿(mào)市場，清雜后將菇腳與子實體切分后備用；復合蛋白酶（1.5 AU/g）：丹麥諾維信（中國）投資有限公司；纖維素酶（15 000 U/g）：上海滬試實驗室器材股份有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

WR-1恒溫水浴振蕩器：上海思爾達科學儀器有限公司；DGG-9246A電熱鼓風干燥箱：北京恒泰豐科試驗設(shè)備有限公司；R-205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海申勝生物技術(shù)有限公司；北京中興偉業(yè)儀器有限公司；AL104電子分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；TDL-60B低速離心機：上海安亭科學儀器廠。

1.3實驗方法

1.3.1SDF提取工藝流程

金針菇菇腳→清洗→干燥→粉碎→過篩→蛋白酶水解→滅酶→纖維素酶水解→抽濾取上清液→減壓濃縮→醇沉過夜→離心分離→醇洗→真空干燥→SDF成品

1.3.2操作要點

取新鮮的金針菇菇腳，清除雜質(zhì)，用自來水沖洗干凈，瀝干后置于鼓風干燥箱80℃烘干，然后將其粉碎，過分樣篩。取5 g菇腳粉加入20倍質(zhì)量的純凈水，調(diào)pH至6.0后加0.1%復合蛋白酶，在恒溫振蕩器中40℃酶解，通過雙縮脲試劑檢測直至無紫紅色產(chǎn)生為止，以除去蛋白質(zhì)。除蛋白后，將懸濁液pH調(diào)至4.6，加熱至60℃保持20 min滅酶，冷卻。在冷卻至50℃的混合液中加入適量的纖維素酶，然后在50℃恒溫水浴振蕩器中酶解一定時間后抽濾，濾液減壓濃縮，再按1∶4（V/V）的比例加入無水乙醇，靜置過夜后，5 000 r/m in離心10 min，最后經(jīng)過5倍體積無水乙醇洗滌后，真空干燥即得SDF成品。

1.3.3SDF提取率計算方法

將制備的SDF充分干燥后，準確稱其質(zhì)量，SDF提取率計算公式如下：

1.3.4SDF提取的單因素試驗

按照商品纖維素酶的使用說明，在最適反應溫度和pH條件下，分別考察物料粒度（50目、60目、70目、80目、90目、100目）、液料比（10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1（m L∶g））、加酶量（25 U/g、30 U/g、35 U/g、40 U/g、45 U/g、50 U/g）和酶解時間（1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h）對SDF提取率的影響。

1.3.5SDF提取的響應面工藝優(yōu)化

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以液料比、加酶量和酶解時間為變量，以SDF提取率（Y）為響應值，應用Design Expert 8.0軟件設(shè)計3因素3水平響應面分析試驗，然后按照試驗方案進行試驗，優(yōu)化提取工藝，確定最佳工藝參數(shù)。

1.3.6SDF持水力測定

準確稱取0.5 g粉碎至60目的SDF粉末于50 m L離心管中，加入25m L純凈水，室溫下均勻攪拌60 min后，4 000 r/min離心10 min，除去上清液，稱量樣品濕質(zhì)量，計算SDF的持水力，持水力計算公式如下：

1.3.7SDF膨脹力測定

準確稱取0.5 g粉碎至60目的SDF于15 m L刻度試管中，記錄干樣體積，加入10 m L純凈水，振蕩均勻后，室溫靜置24 h，記錄膨脹后的體積，計算SDF的膨脹力，膨脹力計算公式如下：

2　結(jié)果與分析

2.1單因素對SDF提取率的影響

2.1.1物料粒度對SDF提取率的影響

物料粒度對SDF提取率的影響如圖1所示。由圖1可知，隨著物料粒度的減小，SDF提取率逐漸提高，在物料粒度為80目時，提取率基本達到最大。這是因為物料顆粒越小，其表面積就越大，與酶的接觸越充分，被降解的纖維素越多，相應可溶性SDF含量越高。但進一步減小物料的粒度，SDF的提取率并沒有明顯的提高?？紤]到物料顆粒越細，對原料粉碎及酶解后抽濾難度越大，因此在后續(xù)研究中，均以過80目篩的物料為研究對象。

圖1　物料粒度對SDF提取率的影響Fig.1 Effect of the material size on the extraction rate of soluble dietary fiber

2.1.2液料比對SDF提取率的影響

圖2　液料比對SDF提取率的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on the extraction rate of soluble dietary fiber

液料比對SDF提取率的影響如圖2所示。由圖2可知，液料比對SDF提取率的影響比較顯著。液料比越高，反應體系黏度越低，越有利于底物的水解及SDF的擴散，反應越充分，在液料比為20∶1（m L∶g）時，SDF提取率最高，達13.18%。但在反應體系中，纖維素酶添加量一定，過高的液料比反而會降低酶的濃度，不利于底物與酶的接觸，從而降低底物的水解率，使SDF提取率呈下降趨勢。另外，液料比越大，后期的真空濃縮工作量越大，耗能越高，因此，為了保證試驗效果、降低工作量和減少耗能，液料比選擇20∶1（m L∶g）為宜。

2.1.3加酶量對SDF提取率的影響

加酶量對SDF提取率的影響如圖3所示。由圖3可知，SDF提取率隨著纖維素酶添加量的增大逐漸提高，在加酶量為40 U/g時，SDF提取率達到最大13.23%；繼續(xù)增加纖維素酶添加量，SDF提取率不再提高，反而有所下降。這是因為市售的纖維素酶多為復合酶，具有內(nèi)切、外切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶活性，既可以降解纖維素轉(zhuǎn)變?yōu)镾DF，也可將之進一步降解為不能被乙醇沉淀的纖維二塘和單糖［16］，同時該類小分子糖又會抑制纖維素酶內(nèi)切酶活性。因此，加酶量過大，反而導致SDF提取率逐漸下降。因此選擇加酶量40 U/g為宜。

圖3　加酶量對SDF提取率的影響Fig.3 Effect of enzyme addition on the extraction rate of so luble dietary fiber

2.1.4酶解時間對SDF提取率的影響

圖4　酶解時間對SDF提取率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis time on the extraction rate of soluble dietary fiber

酶解時間對SDF提取率的影響如圖4所示。由圖4可知，酶解時間顯著影響SDF提取率，隨著酶解時間的延長，SDF提取率先升后降。在酶解前期，反應體系中底物濃度高而可溶性多糖含量低，有利于酶促反應的進行，且反應時間越長，酶解越充分，SDF的提取率就越高，且在酶解3 h時達到最高，為13.45%。繼續(xù)延長反應時間，酶在高溫下逐漸失活，且SDF更多的被酶解為小分子的糖，導致提取率逐漸降低。因此選擇酶解時間3 h為宜。

2.2響應面優(yōu)化試驗結(jié)果與分析

2.2.1數(shù)學模型的建立與顯著性分析

單因素試驗結(jié)果表明，在纖維素酶的最適反應溫度和pH條件下，液料比、加酶量和酶解時間均對SDF提取率影響顯著，因此以以上3個因素作為變量，以SDF提取率（Y）為響應值，設(shè)計響應面優(yōu)化試驗，確定SDF提取的最佳反應條件。響應面試驗因素與水平見表1，試驗設(shè)計及結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表1　響應面設(shè)計試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

表2　響應面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiment

將表2的試驗結(jié)果采用Design Expert 8.0軟件進行多元回歸擬合，得到關(guān)于SDF提取率對液料比、加酶量和酶解時間的二次多元回歸方程：

Y=14.45-0.094A-0.069B-0.1C+0.012AB-0.003AC-0.2BC-0.16A2-0.17B2-0.087C2

表3　回歸模型方差分析Table 3 Va riance ana lysis of regression m odel

由SDF提取率的二次回歸模型方差分析（表3）可知，模型P=0.000 3＜0.01，達到了極顯著水平，模型P=0.000 3＜ 0.01，達到了極顯著水平，且失擬項P=0.906 8＞0.05，不顯著，說明模型預測值與實際值擬合較好，可用回歸方程代替實驗真實值對試驗結(jié)果進行分析。另外，該模型的決定系數(shù)R2=0.964 6，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.919 1，變異系數(shù)為0.41，說明模型擬合度較好，試驗誤差小，可用該模型預測SDF在不同工藝條件下的提取率。由方差分析結(jié)果還可以看出，各因素對SDF提取率的影響大小依次為：酶解時間＞液料比＞加酶量；方程中一次項A、C，二次型A2、B2和交互項BC對SDF提取率影響極顯著，B和C2影響顯著，這表明除了一次項外，二次項和交互項對SDF提取率也有影響。

2.2.2響應面及等高線分析

響應面及等高線圖能夠直觀地反映出各因素間交互作用對響應值的影響程度，曲面越陡，等高線越密集，影響越顯著［17］。液料比、加酶量和酶解時間交互作用對SDF提取率影響的響應面和等高線見圖5。由圖5可知，加酶量和酶解時間的交互作用對SDF提取率的影響極顯著，而料液比與加酶量、料液比與酶解時間的交互作用影響不顯著，這與表3中的分析結(jié)果相一致。

圖5　液料比、加酶量和酶解時間交互作用對SDF提取率影響的響應面及等高線Fig．5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between liquid-solid ratio，enzyme addition and enzymolysis time on so luble dietary fiber extraction rate

2.3提取工藝驗證試驗

經(jīng)過軟件分析可知，當液料比為19.06∶1（m L∶g），加酶量為41.78 U/g，酶解時間為2.02 h時，應用纖維素酶提取金針菇菇腳SDF提取率最高，達到14.50%。為便于實際操作，分別選取液料比、加酶量和酶解時間為19∶1（m L∶g）、42 U/g和2 h，在此條件下進行提取試驗，以驗證模型預測的準確性。結(jié)果表明，3次平行試驗中SDF提取率的平均值為14.45%，與理論預測值相差不大，且高于堿提法金針菇菇腳SDF的提取率［12］。由此可見，應用響應面法優(yōu)化酶法提取金針菇菇腳SDF的工藝條件是準確和可行的。

2.4SDF性質(zhì)測定

膳食纖維分子中含有大量的親水基團，具有較高的持水力和膨脹力，該性能為衡量膳食纖維品質(zhì)優(yōu)劣的兩個重要指標，持水力和膨脹力越大，其生理活性和加工特性越好［18］。經(jīng)測定，本實驗從金針菇菇腳制備的SDF持水力為3.52 g/g，膨脹力為5.64 m L/g，均高于胡春曉等［19］提取的香菇柄SDF的持水力和膨脹力，持水力高于但膨脹率低于吳素蕊等［12］提取的金針菇菇腳SDF。

3　結(jié)論

在纖維素酶法提取金針菇菇腳SDF的過程中，液料比、加酶量和酶解時間均對SDF提取率有顯著影響。在物料粒度為80目時，通過響應面優(yōu)化試驗，得到了金針菇菇腳SDF最佳提取工藝參數(shù)，即液料比19∶1（m L∶g），加酶量42 U/g，酶解時間2 h，在此工藝條件下，金針菇菇腳SDF提取率為14.45%，與理論值基本相符。與堿提法相比，纖維素酶法條件溫和、提取率高、產(chǎn)品品質(zhì)好，為綜合利用金針菇下腳料提供了理論依據(jù)。

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Optim ization of enzymatic extraction conditions for soluble dietary fiber from Flammulina velutipes feet

LI M inghua，MENG Xiumei，LU Zhengqing*，CHEN Jun
（School of Biological and Chem ical Engineering，Jiangsu Food&Pharmaceutical Science College，Huai′an 223003，China）

Using the Flammulina velutipes feet as raw material，the cellulase extraction conditions of soluble dietary fiber were optim ized.On the basis of single factor experiments，the effects of liquid-solid ratio，enzyme addition and enzymolysis time on extraction rate of soluble dietary fiber were investigated.And the optimum extraction conditions were optim ized by response surface methodology.The results showed that the optimum conditions were particle size 80 mesh，liquid-solid ratio 19∶1（m l∶g），enzyme 42 U/g and enzymolysis time 2 h.Under the conditions，the extraction rate of soluble dietary fiber in F.velutipes feet was up to 14.45%，which indicated that it was a very effective method to optim ize cellulase extraction conditions for soluble dietary fiber by response surface methodology.

Flammulina velutipes feet；soluble dietary fiber；cellulase；response surface methodology

TS201．1

0254-5071（2016）05-0119-05

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．05．025

2016-03-14

食用藥用真菌產(chǎn)業(yè)科技公共服務(wù)平臺（HAP201414）

李明華（1977-），男，講師，博士，研究方向為天然產(chǎn)物活性成分。

陸正清（1967-），男，教授，碩士，研究方向為發(fā)酵食品。