響應(yīng)面法優(yōu)化淮山中總黃酮提取工藝的研究

許靜雅，蘇小軍，2，李清明，李文佳，吳　倩，郭時(shí)印*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南長沙410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)湖南省作物種質(zhì)創(chuàng)新與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙410128）

響應(yīng)面法優(yōu)化淮山中總黃酮提取工藝的研究

許靜雅1，蘇小軍1，2，李清明1，李文佳1，吳倩1，郭時(shí)印1*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南長沙410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)湖南省作物種質(zhì)創(chuàng)新與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙410128）

該研究結(jié)合有機(jī)溶劑浸提法與超聲波提取技術(shù)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化淮山中總黃酮的提取工藝。結(jié)果表明，總黃酮的最佳提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，輔助浸提時(shí)間64 min，液料比11∶1（m L∶g）。在此最佳工藝條件下，淮山中總黃酮提取率為1.87 mg/g，比單純使用超聲波提取淮山中總黃酮的提取率（1.23 mg/g）提高了50%左右。

淮山；黃酮類化合物；響應(yīng)面法；提取

淮山（Dioscoreaopposita）廣泛存在于我國大部分地區(qū)，資源豐富，《本草綱目》中記載山藥能“益腎氣、健脾胃、止瀉痢、化癱涎、潤毛皮”。關(guān)于淮山中生物活性成分的研究報(bào)道主要集中在多糖、薯蕷皂苷、尿囊素等［1］，研究內(nèi)容包括提?。?-4］、分離純化［5-6］、活性作用［7-9］等。黃酮類化合物是在植物生長過程中經(jīng)過長期自然選擇產(chǎn)生的一類次級代謝產(chǎn)物［10］，它具有高度的化學(xué)反應(yīng)性，因此具有重要的藥理作用，包括抗癌、抗菌、抗糖尿病及并發(fā)癥、抗炎癥、抗氧化等功效［11-13］。

植物中黃酮類化合物的提取方法主要有傳統(tǒng)提取技術(shù)（如水提法、有機(jī)溶劑浸提法等）以及新型提取技術(shù)（如酶解法、超聲波提取法、超臨界萃取法等）［14］。傳統(tǒng)的提取方法（如水提法等）通過長時(shí)間的提取確實(shí)可以有效提取黃酮類化合物，但提取時(shí)間較長；新型提取技術(shù)（如超聲波提取法）明顯縮短了提取時(shí)間，卻有可能出現(xiàn)提取率相對較低、提取不完全的現(xiàn)象。若將傳統(tǒng)提取技術(shù)與新型提取技術(shù)相結(jié)合，既可縮短提取工藝所需時(shí)間，又可提高黃酮類化合物的提取率。

本研究以湖南所產(chǎn)的淮山為試驗(yàn)材料，采用有機(jī)溶劑浸提與超聲波提取相結(jié)合的方法提取淮山中的總黃酮。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析優(yōu)化［15］淮山中總黃酮有機(jī)溶劑浸提輔助超聲波提取的工藝條件。旨在為淮山資源中總黃酮的開發(fā)利用提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

淮山：湖南婁底市售；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度99%）：中國食品藥品檢定研究院；無水乙醇、九水合硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

Sartorius BS224S型電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；WFJ700型可見分光光度計(jì)：尤尼柯（上海）儀器有限公司；LD5-2A離心機(jī)：北京京立離心機(jī)有限公司；DHA-9246A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；FW 135型高速萬能粉碎機(jī)：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；KQ5200型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)105℃烘干至恒質(zhì)量后，精密稱取20 mg于25 m L容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇溶液定容，得質(zhì)量濃度為0.8 mg/m L蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。

準(zhǔn)確吸取0.5m L、1.0m L、1.5m L、2.0m L、2.5m L、3.0m L標(biāo)準(zhǔn)溶液分別于6個(gè)25 m L具塞試管中，用體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇溶液補(bǔ)足至10m L，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%NaNO21m L，靜置6min后，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%Al（NO3）31 m L，反應(yīng)6 min后，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%NaOH 5 m L，最后用體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇溶液定容至刻度。在波長510 nm處測定其吸光度值，以吸光度值（A）和對應(yīng)的質(zhì)量濃度（C）進(jìn)行線性回歸，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為A=9.243 8C-0.069 3，R2=0.999。

1.3.2淮山中總黃酮的提取和測定

精密稱取1 g淮山粉末置于50 m L具塞試管中，加入適量體積分?jǐn)?shù)的乙醇，振蕩后浸提一段時(shí)間，再置于超聲波清洗器中超聲波提取60min。提取后經(jīng)3000 r/min離心15min，取上清液待測。根據(jù)1.3.1方法測定吸光度值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)回歸方程計(jì)算提取液中總黃酮的質(zhì)量濃度，樣品中總黃酮提取率計(jì)算公式如下：

式中：C為淮山黃酮類化合物提取液質(zhì)量濃度，mg/m L；V為黃酮類化合物提取液體積，m L；m為淮山粉末質(zhì)量，g。

1.3.3單因素試驗(yàn)［16］

選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、輔助浸提時(shí)間、液料比進(jìn)行單因素試驗(yàn)，分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)（40%、50%、60%、70%、80%）、輔助浸提時(shí)間（0、30 min、60 min、90 min、120 m in）、液料比（6∶1、8∶1、10∶1、12∶1、14∶1、16∶1（m L∶g））3因素對淮山中總黃酮提取率的影響。

1.3.4響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，運(yùn)用Design-Expert 8.0.6.1軟件設(shè)計(jì)3因素5水平響應(yīng)面試驗(yàn)?？疾煲掖俭w積分?jǐn)?shù)、輔助浸提時(shí)間、液料比3因素間交互作用對淮山中總黃酮提取率的影響，并建立得率和各影響因素間的數(shù)學(xué)模型，試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1　總黃酮提取工藝響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for total flavono ids extrac tion technology optim ization

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)

2.1.1乙醇體積分?jǐn)?shù)對淮山中總黃酮提取率的影響

不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對淮山中總黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)升高，總黃酮提取率先升高后下降，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，總黃酮提取率到達(dá)峰值，為1.838 mg/g；而乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)升高，總黃酮提取率出現(xiàn)較明顯下降，這可能與不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液極性不同相關(guān)。因此，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)60%為宜。

圖1　乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction yield of total flavonoids

2.1.2輔助浸提時(shí)間對淮山中總黃酮提取率的影響

不同輔助浸提時(shí)間對淮山中總黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，總黃酮提取率隨著輔助浸提時(shí)間的增加而提升，至60 m in時(shí)達(dá)到峰值，為1.788 mg/g；隨著輔助浸提時(shí)間繼續(xù)增加，總黃酮提取率趨于平穩(wěn)，稍有下降的趨勢，可能是淮山中總黃酮已經(jīng)提取完全，再繼續(xù)增加浸提時(shí)間，對總黃酮提取的影響較小。因此，選擇輔助浸提時(shí)間60 m in為宜。

2.1.3液料比對淮山中總黃酮提取率的影響

不同液料比對淮山中總黃酮提取量的影響，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，隨著液料比增加，總黃酮提取率迅速提升，當(dāng)液料比為10∶1（m L∶g）時(shí)達(dá)到峰值，為1.793 mg/g；而液料比繼續(xù)增加，總黃酮的提取率趨于平穩(wěn)，可能是因?yàn)榇藭r(shí)原料與溶劑已經(jīng)充分接觸，再增加液料比對總黃酮的提取影響不顯著。因此，選擇液料比10∶1（m L∶g）為宜。

圖3　液料比對總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of liqu id-solid ratio on the extraction yield of total flavonoids

2.2響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1試驗(yàn)結(jié)果與分析

表2　總黃酮提取工藝響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results o f response surface experiments for total flavonoids extraction technology optim ization

通過淮山中總黃酮提取的單因素考察，選用乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，輔助浸提時(shí)間1 h，液料比10∶1（m L∶g）為響應(yīng)面試驗(yàn)零點(diǎn)，以總黃酮提取率（Y）為考察指標(biāo)，進(jìn)行3因素5水平響應(yīng)面試驗(yàn)，設(shè)計(jì)23次試驗(yàn)，其中析因試驗(yàn)14次，中心組合試驗(yàn)重復(fù)9次。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。

2.2.2回歸模型分析

響應(yīng)面數(shù)據(jù)方差分析結(jié)果見表3。利用Design-Expert 8.0.6.1軟件對表3中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到總黃酮提取率的模型二次多項(xiàng)回歸方程：

表3　響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of response surface experim ents results

由表3可知，該模型的P值＜0.000 1，表明該模型是極顯著的，失擬項(xiàng)P=0.278 5＞0.05，表明試驗(yàn)誤差較小，方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.985 0，說明此方程模擬結(jié)果具有較高可信度。所選3個(gè)因素中輔助浸提時(shí)間（X2）與液料比（X3）對淮山中總黃酮提取率的影響顯著，乙醇體積分?jǐn)?shù)（X1）對總黃酮提取率的影響不顯著（P=0.655 4＞0.05）；乙醇體積分?jǐn)?shù)（X1）與輔助浸提時(shí)間（X2）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（X1）與液料比（X3）的交互作用不顯著，而輔助浸提時(shí)間（X2）與液料比（X3）交互作用顯著（P=0.028 0＜0.05）；3個(gè)因素的二次項(xiàng)均為極顯著，且由F值與P值可知，3個(gè)因素對淮山中總黃酮提取率的影響為：液料比（X3）＞輔助浸提時(shí)間（X2）＞乙醇體積分?jǐn)?shù)（X1）。

2.2.3響應(yīng)面分析

響應(yīng)面三維圖可直觀反映各因素對淮山中黃酮類化合物提取率的影響及因素間的交互作用大小。等高線形狀反映了各因素交互作用的強(qiáng)弱。等高線趨于圓形時(shí)，兩交互作用相對較弱，趨于橢圓形是則較強(qiáng)。為進(jìn)一步了解3因素間的交互作用，更加直觀地反映各因素對響應(yīng)值的影響，采用Design-Expert 8.0.6.1軟件繪制乙醇體積分?jǐn)?shù)、輔助浸提時(shí)間和料液比交互作用對總黃酮提取率影響的響應(yīng)面及等高線，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)（X1）與輔助浸提時(shí)間（X2）的交互作用、乙醇體積分?jǐn)?shù)（X1）與液料比（X3）的交互作用的等高線趨近于正圓型，而輔助浸提時(shí)間（X2）與液料比（X3）交互作用的等高線則偏橢圓形。在響應(yīng)面圖中，等高線越趨近于正圓形，交互作用越小；等高線越趨近橢圓形，交互作用越大，所以各因素交互作用大小為：X2X3＞X1X2＞X1X3，與表3分析結(jié)果吻合。根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果對總黃酮提取率進(jìn)行回歸分析預(yù)測，得最優(yōu)提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)60.15%，輔助浸提時(shí)間63.4 min，液料比10.94∶1（m L∶g），預(yù)測最佳工藝條件下，淮山中總黃酮的提取率為1.882 mg/g。

圖4　乙醇體積分?jǐn)?shù)、輔助浸提時(shí)間和液料比交互作用對黃酮類化合物提取率影響的響應(yīng)面及等高線Fig．4 Response surface plots and contour line of effects of interactions between ethanol concentration，auxiliary extraction time and liquid-material ratio on the extraction yield of flavonoids

2.2.4最佳提取工藝條件的預(yù)測與驗(yàn)證

考慮實(shí)際操作，將提取工藝條件調(diào)整為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，輔助浸提時(shí)間64 min，液料比11∶1（m L∶g）。采用調(diào)整優(yōu)化后的提取工藝條件，在此條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，淮山中總黃酮平均提取率為1.870 mg/g，與預(yù)測值1.882 mg/g之間的偏差僅為0.63%，實(shí)際值與預(yù)測值較接近，表明本響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)合理可行，該回歸方程能夠反應(yīng)各因素與總黃酮提取率的影響。

3　結(jié)論

本研究采用乙醇輔助浸提與超聲波提取相結(jié)合的方法，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析優(yōu)化設(shè)計(jì)，確定提取淮山中總黃酮的最佳工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，輔助浸提時(shí)間64 min，液料比11∶1（m L∶g），此時(shí)淮山中總黃酮的提取率為1.870 mg/g，相對單純使用超聲提取淮山中總黃酮的提取率（1.226 mg/g）提高了50%左右，且整體提取時(shí)間適中。傳統(tǒng)提取方法和新型技術(shù)相結(jié)合對淮山中總黃酮的利用及工業(yè)化生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)作用。

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Optim ization of extraction technology of total flavonoids from Chinese yam by response surface methodology

XU Jingya1，SU X iaojun1，2，LI Qingm ing1，LI Wenjia1，WU Qian1，GUO Shiyin1*
（1.College of Food Science and Technology，Hunan Agriculture University，Changsha 410128，China；2.Hunan Provincial Key Laboratory for Crop Germplasm Innovation and U tilization，Hunan Agriculture University，Changsha 410128，China）

Combined w ith organic solvent extraction and ultrasonic extraction technology，on the basis of single factor experiments，the extraction technology of flavonoids in Chinese yam was optim ized by response surface methodology.Results indicated that the optimum extraction conditions were ethanol concentration 60%，auxiliary extraction time 64 min，liquid-solid ratio 11：1（m l：g）.Under the conditions，the extraction yield of total flavonoids in Chinese yam was 1.87 mg/g，which was about 50%higher than that（1.23 mg/g）by ultrasonic extraction.

Chinese yam；flavonoids；response surface methodology；extraction

TS20

0254-5071（2016）05-0115-04

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．05．024

2016-03-11

湖南省自然科學(xué)基金（2015JJ4028），湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目（XCX14080）

許靜雅（1988-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)闋I養(yǎng)與食品衛(wèi)生。

郭時(shí)?。?975-），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称窢I養(yǎng)。