甜柿果實(shí)總黃酮提取工藝的優(yōu)化及其抗氧化研究

楊谷良，龍　濤，韓　露，王藝雅，李士明*

（1.黃岡師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，湖北黃岡438000；2.黃岡師范學(xué)院大別山特色資源開(kāi)發(fā)湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北黃岡438000）

甜柿果實(shí)總黃酮提取工藝的優(yōu)化及其抗氧化研究

楊谷良1，2，龍濤2，韓露1，王藝雅1，李士明1，2*

（1.黃岡師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，湖北黃岡438000；2.黃岡師范學(xué)院大別山特色資源開(kāi)發(fā)湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北黃岡438000）

為確定羅田甜柿果實(shí)中總黃酮的最佳提取工藝條件及其抗氧化性，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)Box-Behnken組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)、響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，得到柿果總黃酮提取的最佳條件：提取時(shí)間2.5 h，提取溫度75℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)75%，液料比13∶1（mL∶g）。在此條件下，柿果總黃酮的提取率為2.27%。柿果總黃酮對(duì)1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除率為89.72%，證實(shí)柿果具有一定抗氧化性。

柿子；總黃酮；響應(yīng)面法；抗氧化性

柿子（Diospyruskaki Thunb.）屬于柿屬柿科落葉果樹［1］，原產(chǎn)于我國(guó)長(zhǎng)江流域及其以南地區(qū)，在我國(guó)至少有2 200年的栽培歷史［2］。2011年，我國(guó)柿樹栽培面積己達(dá)1.09×107畝，柿果產(chǎn)量達(dá)到3.259×109kg［3］。柿果中含有機(jī)酸、鞣質(zhì)、多酚、糖類、維生素C、食用纖維、三萜酸，類胡蘿卜素以及類黃酮等多種有機(jī)物，具有抗腫瘤、抗衰老、降血壓、降血脂、降膽固醇、軟化血管、健膚美容等生理作用［4］。柿葉和柿果等被加工成了柿葉茶［5］、柿子醋［6］、柿酒［7］、醋酸飲料［8］等。韓衛(wèi)娟等［9］研究了15份柿葉中總黃酮含量的年動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)柿葉中總黃酮的含量為12.06～58.20 mg/g。黃酮類物質(zhì)具有抗氧化、清除自由基和鰲合二價(jià)陽(yáng)離子等廣泛的生物學(xué)效應(yīng)［10］，林國(guó)榮等［11］也報(bào)道柿黃酮具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、擴(kuò)張血管等生理功能。

黃酮的提取方法很多，如索式提取法、加熱提取法、有機(jī)溶劑提取法、酶法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法等［12］。其中，有機(jī)溶劑提取法具有黃酮提取效率高、提取方法簡(jiǎn)便、不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)。董江濤等［13］采用響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取柿葉中的總黃酮，柿葉黃酮的提取率達(dá)到6.15%。王恒超等［14］確定了微波輔助法提取柿黃酮最佳提取條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、微波功率600W、提取時(shí)間150 s、料液比1∶30（g∶m L），黃酮提取量達(dá)到42.4 mg/g。周吳萍等［15］發(fā)現(xiàn)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，料液比為1∶60（g∶m L），提取溫度為90℃，提取時(shí)間45 m in，總黃酮的提取率可達(dá)7.59%。本研究利用乙醇溶液提取柿果實(shí)黃酮類化合物，通過(guò)1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除實(shí)驗(yàn)，確定提取柿果實(shí)總黃酮的最佳提取工藝并探討柿果總黃酮抗氧化活性，以期為柿子的綜合開(kāi)發(fā)利用提供一定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

甜柿果實(shí)：于2015年10月，在黃岡市羅田縣甜柿種植基地采集的近成熟果實(shí)。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DPPH：美國(guó)Sigma公司；無(wú)水乙醇、Al（NO3）3、NaOH、NaNO2、NaH2PO4、Na2HPO4、維生素C、甲醇、鹽酸（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

PB2002-10 Metter-Toledo Group電子天平：梅特勒-托利多國(guó)際有限公司；GZX-9240MBE電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；722S可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海棱光技術(shù)有限公司；RE-5220旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；HH-8電子恒溫水浴鍋：深圳國(guó)華儀器廠。

1.3方法

1.3.1柿果總黃酮的提取工藝

甜柿果實(shí)→除核→切片→烘干（65℃）→粉碎過(guò)80目篩→乙醇溶液浸泡提取→過(guò)濾→減壓蒸餾→總黃酮粗提物

1.3.2蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.1 mg/m L）0、1.00 m L、2.00 m L、3.00 m L、4.00 m L、5.00 m L分別置于25 m L容量瓶中，依次加入5 m L體積分?jǐn)?shù)60%乙醇，1.0 m L 5%NaNO2，搖勻，放置5 min，加入1.0 m L 10% Al（NO3）3，搖勻，放置5 min，加入10 m L 4%NaOH，搖勻，再用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇定容，搖勻，放置15 m in，在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度值。以吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，蘆丁質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3柿果總黃酮提取單因素試驗(yàn)

設(shè)置提取時(shí)間：1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0h；提取溫度：70℃、75℃、80℃、85℃、90℃；乙醇體積分?jǐn)?shù)：60%、70%、80%、90%、100%；液料比：9∶1、11∶1、13∶1、15∶1、17∶1（m L∶g）。取一定量的柿果粉末，經(jīng)乙醇浸泡提取并過(guò)濾后，減壓蒸餾得提取物，提取物經(jīng)體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶解后，定容至100 m L。取上述溶液5 m L，用體積分?jǐn)?shù)50%乙醇定容至50 m L后，取1 m L，加入0.15 m L濃度為5%的NaNO3溶液，充分搖勻后，靜置6 m in，然后加入2 m L含量為4%的NaOH溶液，加入體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇至總體積25 m L，搖勻后靜置15 min，測(cè)量波長(zhǎng)510 nm處的吸光度值A(chǔ)。根據(jù)下面的公式計(jì)算出總黃酮提取率：

式中：y為通過(guò)回歸方程計(jì)算出的蘆丁含量，mg；50和20為稀釋倍數(shù)；N為100除以100 g柿鮮果干燥后的干粉質(zhì)量；w為所稱取干粉的質(zhì)量，mg。

1.3.4柿果總黃酮提取工藝的優(yōu)化

表1　響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以提取時(shí)間（A）、提取溫度（B）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）和液料比（D）為評(píng)價(jià)因素，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，因素與水平如表1所示。

1.3.5柿果總黃酮清除DPPH自由基能力的測(cè)定

參照鄭朋朋等［16］的方法。分別取0.1 m L不同質(zhì)量濃度（50μg/m L、100μg/m L、150μg/m L、200μg/m L、250μg/m L）的總黃酮提取液，加入5 m L 100 μmol/L的DPPH甲醇溶液，充分混勻并避光靜置30 min后，測(cè)定波長(zhǎng)517 nm處的吸光度值，以提取溶劑為空白對(duì)照，以VC為陽(yáng)性對(duì)照。DPPH清除率的計(jì)算公式如下：

式中：A0為空白溶液吸光度值；Ax為加入樣品后的體系吸光度值；Ax0為樣品本底吸光度值。

2　結(jié)果與分析

2.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

以蘆丁質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)、波長(zhǎng)510 nm處的吸光度（y）值為縱坐標(biāo)繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，所得線性回歸方程為y=1.218 1x-0.004 3，相關(guān)系數(shù)R2= 0.996 4。表明在一定范圍內(nèi)，吸光度值與蘆丁質(zhì)量濃度間的線性關(guān)系良好。

圖1　蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

2.1.1提取時(shí)間對(duì)柿果總黃酮提取率的影響

圖2　提取時(shí)間對(duì)柿果總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction rate of flavonoids in persimmon

由圖2可知，在整個(gè)提取過(guò)程中，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，柿果總黃酮的含量不斷增加。當(dāng)提取時(shí)間＜2.5 h時(shí)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，總黃酮含量快速增加。這是因?yàn)殡S著時(shí)間的延長(zhǎng)，總黃酮逐漸被浸提出來(lái)。當(dāng)提取時(shí)間繼續(xù)增加時(shí)，總黃酮含量的增加趨勢(shì)逐漸減緩，這是由于隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，大部分總黃酮被提取出來(lái)，而且，原料中的淀粉和蛋白質(zhì)等物質(zhì)也更多地釋放出來(lái)，提取液的黏度增大，增加后續(xù)離心、濃縮、過(guò)濾等的難度，提取效率降低。因此，2.5 h為適宜的提取時(shí)間。

2.1.2提取溫度對(duì)柿果總黃酮提取率的影響

圖3　提取溫度對(duì)柿果總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of extraction tem perature on extraction rate of flavonoids in persimm on

由圖3可知，當(dāng)提取溫度＜75℃時(shí)，柿果總黃酮的提取率隨著提取溫度的升高而不斷增加。當(dāng)提取溫度＞75℃時(shí)，隨著提取溫度的升高，柿果總黃酮的提取率反而出現(xiàn)下降。因此，選擇75℃的提取溫度最為適宜。

2.1.3乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)柿果總黃酮提取率的影響

圖4　乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)柿果總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of e thanol concentration on extraction rate of flavonoids in persimmon

由圖4可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%～70%，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，柿果總黃酮的提取率逐漸升高，但是，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)＞70%以后，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，總黃酮含量逐漸降低?？紤]到提取效率和提取成本，選擇體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇為宜。

2.1.4液料比對(duì)柿果總黃酮提取率的影響

圖5　液料比對(duì)柿果總黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of liquid-solid ratio on extraction rate of flavonoids in persimm on

由圖5可知，當(dāng)液料比9∶1～13∶1（m L∶g），隨著液料比的增加，柿果總黃酮的提取率逐漸增加，當(dāng)液料比＞13∶1（m L∶g）時(shí)，柿果總黃酮的提取率開(kāi)始下降，這是由于當(dāng)液料比達(dá)到13∶1（m L∶g）時(shí)，柿粉末與提取液能夠充分接觸。進(jìn)一步增大液料比，不會(huì)促進(jìn)柿果總黃酮溶出，反而增加了后續(xù)離心、濃縮和過(guò)濾的難度，降低了柿果總黃酮的提取率。因此，液料比以13∶1（m L∶g）最適宜。

2.2響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

通過(guò)Design-Expert軟件，以柿果總黃酮提取率（Y）為響應(yīng)值，選取提取溫度（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、液料比（C）和提取時(shí)間（D）4個(gè)因素，對(duì)柿果黃酮的提取條件進(jìn)行了響應(yīng)面分析。對(duì)各因素進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合后，得到柿果總黃酮提取率（Y）對(duì)A、B、C和D的二次多項(xiàng)回歸方程：

由表3可知，該回歸模型的F值為7.09，P=0.0004＜0.01，達(dá)到極顯著水平；失擬項(xiàng)的F值為15.40，P=0.069 0＞0.05，影響不顯著；方程的決定系數(shù)R2=0.996 3，表明響應(yīng)值的變化有99.63%來(lái)源于所選變量，說(shuō)明該模型擬合結(jié)果良好，試驗(yàn)誤差小。對(duì)交互作用顯著的因素進(jìn)行分析，得到響應(yīng)曲面及等高線圖（見(jiàn)圖6）。

由圖6可知，因素對(duì)柿果總黃酮提取率的影響，以提取溫度最顯著，表現(xiàn)為曲線較陡，而提取時(shí)間的影響相對(duì)較小，表現(xiàn)為曲線較為平滑。

根據(jù)響應(yīng)面分析結(jié)果，乙醇浸提法提取柿果黃酮的最佳工藝條件為提取時(shí)間2.73 h，提取溫度74.32℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)74.13%，液料比12.87 m L/g。在此條件下柿果黃酮的提取率為2.271%。

表2　柿果總黃酮提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of response surface ana lysis for persimm on flavonoids extraction process optim ization

表3　響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of response surface methodology results

圖6　提取時(shí)間、溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比對(duì)柿果總黃酮提取率影響的響應(yīng)曲面和等高線Fig．6 Response surface p lots and contour line of effects of extrac tion tim e，tem perature，ethanol concentration and liquid-solid ratio on persimmon flavonoids extraction rate

2.3驗(yàn)證試驗(yàn)

為了檢驗(yàn)響應(yīng)面法得到結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化的提取條件進(jìn)行乙醇浸提法提取柿果總黃酮的試驗(yàn)?？紤]到實(shí)際操作情況，將試驗(yàn)條件修正為提取時(shí)間2.5 h，提取溫度75℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)75%，液料比13∶1（m L∶g）。在此條件下測(cè)試3次，柿果總黃酮的平均提取率為2.269%，實(shí)際值與理論值相近，可見(jiàn)該模型可以很好地反映各因素對(duì)柿果黃酮提取率的影響，同時(shí)也證明了用該方法研究柿果黃酮提取率的可行性。

2.4清除DPPH自由基的能力

圖7　不同質(zhì)量濃度柿果總黃酮與VC清除DPPH自由基能力Fig.7 The scavenging capacity of different content of persimmon flavonoids and VC on DPPH free radical

由圖7可知，隨著柿果總黃酮質(zhì)量濃度的增加，DPPH自由基清除率逐漸增強(qiáng)。當(dāng)柿果總黃酮的質(zhì)量濃度增加至0.25 mg/m L時(shí)，自由基清除率達(dá)到最大36.02%。和相同質(zhì)量濃度的對(duì)照VC相比，柿果總黃酮的自由基清除率更強(qiáng)。結(jié)果說(shuō)明柿果總黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化能力。

3　結(jié)論

通過(guò)對(duì)提取時(shí)間、提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比進(jìn)行單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，得到柿果總黃酮提取的最佳條件：提取時(shí)間2.5 h，提取溫度75℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)75%，液料比13∶1（m L∶g）。在此條件下，柿果黃酮的提取率為2.269%。建立的回歸方程擬合度良好，預(yù)測(cè)值檢測(cè)值基本一致。體外的抗氧化研究結(jié)果表明，柿果總黃酮具有較強(qiáng)的清除DPPH自由基能力，具有一定的抗氧化活性。

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Optim ization of extraction technology of total flavonoids from persimmon fruit and its antioxidant activities

YANG Guliang1，2，LONG Tao2，HAN Lu1，WANG Yiya1，LI Shim ing1，2*
（1.College of Life Science，Huanggang Normal University，Huanggang 438000，China；2.Hubei Collaborative Innovation Center for the
Characteristic Resources Exploitation of Dabie Mountains，Huanggang Normal University，Huanggang 438000，China）

In order to optim ize extraction conditions of flavonoids from the fruit of Luotian non-astringent persimmon and its antioxidant activities，on the basis of single factor experiments，the optimum extraction conditions of persimmon flavonoids were obtained by Box-Behnken experiments and response surface methodology.The optimum extraction conditions were extraction time 2.5 h，temperature 75℃，ethanol concentration 75%，liquid-solid ratio1 13∶1（m l∶g）.Under the conditions，the extraction ratio of persimmon flavonoids was 2.27%，and the scavenging capacity of persimmon flavonoids on 2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl（DPPH）free radical was 89.72%，which confirmed that persimmon had certain antioxidant activities. Key words：persimmon；total flavonoids；response surface methodology；antioxidant activity

R285

0254-5071（2016）05-0081-05

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．05．017

2016-02-23

湖北省自科基金（2006ABA 186）；湖北省自科基金青年項(xiàng)目（Q200727004）；國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（31500995）作者簡(jiǎn)介：楊谷良（1974-），男，副教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)業(yè)資源開(kāi)發(fā)與利用。

李士明（1963-），男，教授，博士，研究方向?yàn)楣δ苁称放c健康、疾病預(yù)防。