動態(tài)發(fā)酵合成球形細(xì)菌纖維素條件研究

章　翠，畢繼才，陳華美，王艷梅，劉四新，李從發(fā)*

（海南大學(xué)食品學(xué)院，海南?？?70228）

動態(tài)發(fā)酵合成球形細(xì)菌纖維素條件研究

章翠，畢繼才，陳華美，王艷梅，劉四新，李從發(fā)*

（海南大學(xué)食品學(xué)院，海南?？?70228）

細(xì)菌纖維素（BC）是優(yōu)良的新型生物材料，尤其以球形BC為代表，在各領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。目前，動態(tài)發(fā)酵產(chǎn)BC多以不規(guī)則團(tuán)塊狀、星球狀、絲狀為主，應(yīng)用范圍較局限。故通過控制生產(chǎn)條件，獲得均勻度較高的球形BC有著迫切的需要。在動態(tài)發(fā)酵時(shí)，以椰凍駒形桿菌（Komagataeibacter nataicola）Y19作為生產(chǎn)菌株，以中等大小BC的質(zhì)量及數(shù)量百分比為考察指標(biāo)，研究轉(zhuǎn)速、發(fā)酵液液深及發(fā)酵容器直徑引起的供氧效率及剪切力變化對動態(tài)發(fā)酵產(chǎn)球形BC合成規(guī)律的影響。結(jié)果表明，供氧效率提高、剪切力增大時(shí)，可使球形顆粒變小，顆粒數(shù)量增加。在發(fā)酵容器直徑為6.0 cm，液深為2.40～2.75 cm，轉(zhuǎn)速為130 r/m in時(shí)，中球BC質(zhì)量與數(shù)量百分比均＞40%，均勻度最佳。

球形細(xì)菌纖維素；球粒細(xì)菌纖維素形貌；動態(tài)發(fā)酵

細(xì)菌纖維素（bacterial cellulose，BC）具有高化學(xué)純度、高聚合度［1］、高結(jié)晶度、吸水性好、持水力強(qiáng)、良好的生物相容性、超精細(xì)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和生物降解［2-4］等優(yōu)于植物纖維素的特點(diǎn)，使其在生物醫(yī)藥、化妝品［5］、造紙、食品工業(yè)等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景［6-8］。而球形BC則具有更大的比表面積及更多的納米級空隙，賦予其更高的細(xì)胞親和性［9］及吸附能力，HU M等［10］在球粒型BC上培養(yǎng)人成骨細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其能快速地吸附和生長，具有良好生物相容性。ZHU H X等［11］還報(bào)道了用球形BC吸附牛血清白蛋白和鉛離子（Pb+）的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其不僅吸附好，而且洗脫率高，洗脫率分別達(dá)到92.1%和75.2%，顯示了良好的重復(fù)利用的特點(diǎn)。

BC主要有靜態(tài)培養(yǎng)和動態(tài)培養(yǎng)兩種發(fā)酵方式［12］。靜態(tài)發(fā)酵時(shí)可在發(fā)酵液表面收獲凝膠態(tài)膜狀纖維素產(chǎn)物。但具有諸多缺點(diǎn)，如所需勞動力大，生產(chǎn)效率低［13］，且發(fā)酵占用空間大、發(fā)酵周期長、易感染雜菌、產(chǎn)品質(zhì)量無法得到保證等。目前，動態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素主要包括搖瓶培養(yǎng)、攪拌式反應(yīng)器、氣升罐、轉(zhuǎn)盤式反應(yīng)器等［14］。動態(tài)法產(chǎn)生的細(xì)菌纖維素分散在發(fā)酵液中，產(chǎn)量較低，且所產(chǎn)BC形態(tài)各異，多以星球狀、不規(guī)則團(tuán)塊狀、無規(guī)則顆粒狀或絲狀為主，以及少數(shù)的球形BC。目前球形BC在各領(lǐng)域的應(yīng)用價(jià)值較高，但由于生產(chǎn)的不穩(wěn)定性［15］，限制了其廣泛的應(yīng)用。只有優(yōu)化發(fā)酵條件，獲得大小適中、規(guī)則均勻又?jǐn)?shù)量多、產(chǎn)量高的球粒型BC，才能獲得更大的應(yīng)用前景及應(yīng)用價(jià)值。CZAJA W等［9］發(fā)現(xiàn)通過控制合適的振蕩條件，利用木醋桿菌（Acetobacter xylinum）NQ-5可獲得直徑Φ=5 mm的球形纖維素產(chǎn)物，并推測在動態(tài)培養(yǎng)過程中，振蕩產(chǎn)生的剪切力，使產(chǎn)生的纖維絲相互交織，并折疊成球形顆粒。YANG H等［16］通過控制木醋桿菌（A.xylinum）JCM 9730（ATCC 700178）動態(tài)發(fā)酵時(shí)搖床轉(zhuǎn)速、錐形瓶及裝液量等條件，可獲得接近球形的細(xì)菌纖維素顆粒。殷智超［17］研究發(fā)現(xiàn)動態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)過程中，通氣量過大，細(xì)菌數(shù)量增多，但纖維素產(chǎn)量卻極低。而適當(dāng)提高發(fā)酵中期的通氣量，可以克服發(fā)酵過程中粘度增加對溶氧量的影響，從而獲得較高的BC產(chǎn)量。

目前對于球形BC的均勻度的評價(jià)還較少，余敏華等［14］以0.5～0.8 cm顆粒的產(chǎn)率為考察指標(biāo)，對顆粒的均勻度進(jìn)行較為簡單的判斷。由于細(xì)菌纖維素濕質(zhì)量稱量時(shí)誤差較大，故本實(shí)驗(yàn)產(chǎn)量均以干質(zhì)量進(jìn)行評價(jià)，首先按所合成纖維素球粒的規(guī)格大小對產(chǎn)物進(jìn)行分類，以中球質(zhì)量及數(shù)量百分作為均勻度的考察指標(biāo)，并通過分析不同發(fā)酵條件下不同規(guī)格球形BC百分比的變化趨勢，研究發(fā)酵條件對動態(tài)產(chǎn)球形BC顆粒大小的影響情況，為動態(tài)發(fā)酵合成球形BC未來實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1材料

椰凍駒形桿菌（Komagataeibacter nataicola）Y 19，海南大學(xué)食品學(xué)院食品生物技術(shù)研究室保藏。

發(fā)酵椰子水：選取市售成熟椰子，取破殼后的椰子水，用八層紗布濾去雜質(zhì)后，置于10 L的潔凈塑料桶中，在室溫條件下進(jìn)行預(yù)發(fā)酵7 d的處理，再以干凈礦泉瓶分裝、置于-20℃冷柜凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2試劑

椰子水、蔗糖為市售；MgSO4、（NH4）2SO4、KH2PO4、NaOH、酵母提取物、一水合檸檬酸：廣州化學(xué)試劑廠；蛋白胨（生化試劑）：湛江市光華化學(xué)廠；無水葡萄糖：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。試驗(yàn)所用試劑均為分析純。

1.1.3培養(yǎng)基

斜面試管培養(yǎng)基：（NH4）2SO43 g/L，MgSO40.3 g/L，KH2PO40.3 g/L，新鮮椰子水50%（V/V），瓊脂2.0%～2.5%，pH 5.0，加糖至可溶性固形物（糖度）50 g/L。

液體發(fā)酵種子培養(yǎng)基：（NH4）2SO43g/L，MgSO40.3g/L，KH2PO40.3 g/L，預(yù)發(fā)酵椰子水70%（V/V），pH3.8，加糖至可溶性固形物（糖度）50 g/L。

HS（Hestrin Schramm）培養(yǎng)基：蛋白胨5 g/L，葡萄糖20 g/L，酵母提取物5 g/L，Na2HPO4·12H2O 2.7 g/L，一水合檸檬酸1.15 g/L，pH 6.0。

上述培養(yǎng)基均于121℃滅菌20 min。

1.2儀器與設(shè)備

Y 5-840-1超凈工作臺：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；ZHWY-2112B恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智成分析儀器制造有限公司；G154DW立式自動壓力蒸汽滅菌器；致微（廈門）儀器有限公司；PB303-N電子精密天平；上海安亭科技儀器廠。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1細(xì)菌纖維素的動態(tài)發(fā)酵

將斜面保藏菌株Y 19活化后接一環(huán)菌苔于液體發(fā)酵種子培養(yǎng)基（裝液量40m L/100m L）中，30℃靜置培養(yǎng)24h制成種子液。按2%接種量接入HS培養(yǎng)基（裝液量80m L/200m L）中，30℃、130 r/min，搖床培養(yǎng)7 d。

1.3.2轉(zhuǎn)速對動態(tài)發(fā)酵合成球形BC的影響

在HS培養(yǎng)基（裝液量80m L/200m L）中接種后，分別在50 r/min、80 r/min、110 r/min、120 r/min、130 r/min、170 r/min、200 r/m in，30℃動態(tài)培養(yǎng)7 d，測定BC產(chǎn)量。

1.3.3培養(yǎng)基液體深度對動態(tài)發(fā)酵合成球形BC的影響

裝液量分別為30 m L/200 m L、40 m L/200 m L、50 m L/ 200m L、60m L/200m L、70m L/200m L、80m L/200m L、90m L/ 200 m L、100 m L/200 m L、110 m L/200 m L、120 m L/200 m L、130m L/200m L、140m L/200m L液體培養(yǎng)基，使液深呈現(xiàn)梯度，其依次為1.00 cm、1.35 cm、1.70 cm、2.05 cm、2.40 cm、2.75 cm、3.10 cm、3.45 cm、3.80 cm、4.15cm、4.50 cm，30℃、130 r/m in動態(tài)培養(yǎng)7 d，測定BC產(chǎn)量。

1.3.4容器直徑對動態(tài)發(fā)酵合成球形BC的影響

選用不同型號的燒杯，其杯身直徑分別為4.0cm、4.9 cm、6.0 cm、6.8 cm、8.2 cm、9.0 cm、10.5 cm。液深為2.8 cm，30℃、130 r/m in動態(tài)培養(yǎng)7 d，測定BC產(chǎn)量。

1.3.5細(xì)菌纖維素產(chǎn)量測定

從培養(yǎng)基中取出纖維素，蒸餾水沖洗后，用0.1 mol/L NaOH溶液80℃浸泡30 min，再用蒸餾水沖洗，如此反復(fù)，直至纖維素膜呈乳白色半透明，然后使用0.5%乙酸浸泡以中和NaOH，再用蒸餾水沖洗至中性，將其置于無菌去離子水中，備用。以上處理均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。將空白平板置于85℃干燥箱烘干至恒質(zhì)量，記錄質(zhì)量為W1，而后將清洗過的BC置于平板上，烘干至恒質(zhì)量，記錄質(zhì)量為W2，所產(chǎn)BC干質(zhì)量為（W2-W1），本實(shí)驗(yàn)均采用干質(zhì)量來描述細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量。

1.3.6球形BC的描述和評價(jià)方法

不同大小的球形BC有不同的應(yīng)用途徑，根據(jù)所需大小的球形BC，可設(shè)定不同規(guī)格，現(xiàn)認(rèn)為球形BC直徑在0.5～0.8 cm范圍時(shí)大小適中。本實(shí)驗(yàn)以獲得直徑為0.5～0.8 mm之間球形BC為目標(biāo)，將獲得的BC，于水中先后過0.8 cm和0.5 cm孔徑鐵制分類篩，將球形BC按照顆粒直徑大小分為3個(gè)規(guī)格：小球BC直徑（Φ＜0.5 cm）、中球BC直徑（0.5≤Φ＜0.8 cm）和大球BC直徑（Φ≥0.8 cm）。

為反映所合成球形BC顆粒的均勻程度，以3種直徑的BC顆粒在全部BC產(chǎn)物中質(zhì)量及數(shù)量占比來描述。當(dāng)中球BC質(zhì)量及數(shù)量百分比達(dá)40%以上，認(rèn)為大小均勻一致，其占百分比越高，均勻度越高。不同大小球形BC占總BC產(chǎn)量及數(shù)量百分比的計(jì)算公式如下：

式中：m1為所有小球的干質(zhì)量，g；m2為所有中球的干質(zhì)量，g；m3為所有大球的干質(zhì)量，g；m為總BC產(chǎn)量干質(zhì)量，g。

式中：N為所產(chǎn)BC總顆粒數(shù)；N1為小球BC的顆粒數(shù)；N2為中球BC的顆粒數(shù)；N3為大球BC顆粒數(shù)。

2　結(jié)果與分析

動態(tài)發(fā)酵合成的BC根據(jù)發(fā)酵條件而呈多樣化形態(tài)，只有大小適中、規(guī)則均勻又?jǐn)?shù)量多、產(chǎn)量高的球粒型BC能有更大的應(yīng)用價(jià)值。前期實(shí)驗(yàn)表明動態(tài)發(fā)酵合成球形BC的產(chǎn)量、外觀形貌、均勻程度等與菌株、接種量、轉(zhuǎn)速、裝液量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵容器、以及外援添加物等關(guān)系密切，本實(shí)驗(yàn)著重研究了影響搖瓶培養(yǎng)的供氧效率及剪切力的幾個(gè)因素如搖床轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)液深度及發(fā)酵容器直徑對動態(tài)發(fā)酵條件合成球形BC的產(chǎn)量和質(zhì)量情況，尤其是均勻度的情況。

2.1轉(zhuǎn)速對動態(tài)發(fā)酵產(chǎn)球形BC合成情況的影響

2.1.1轉(zhuǎn)速對動態(tài)發(fā)酵產(chǎn)球形BC形貌的影響

轉(zhuǎn)速對球形BC具有顯著的影響，通過改變動態(tài)發(fā)酵時(shí)的轉(zhuǎn)速，可提高動態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)的供氧效率及剪切力，從而獲得一系列的球形BC，結(jié)果如圖1所示。通過對球形BC形貌、產(chǎn)量分析，大小數(shù)量比率等數(shù)據(jù)，探究供氧效率及剪切力對球形BC合成的影響。

圖1　不同轉(zhuǎn)速條件下產(chǎn)球形BC的形貌Fig.1 Morphology of sphere-like BC at different rotate speeds

由圖1可知，轉(zhuǎn)速80～200 r/min時(shí)，所產(chǎn)的BC顆粒均為實(shí)心光球，但大小數(shù)量有所變化。從表觀上可以看出，轉(zhuǎn)速為200 r/min時(shí)是細(xì)小的顆粒，中間由一根絲狀體串聯(lián)成串，有零星的球狀顆粒散落在外；隨著轉(zhuǎn)速的增加，供氧效率的提高，球形顆粒直徑呈明顯的減小趨勢，顆粒數(shù)逐漸增加，當(dāng)轉(zhuǎn)速為80 r/min時(shí)顆粒數(shù)較少，單球直徑最大可達(dá)3 cm，而在50 r/min時(shí)為團(tuán)塊狀BC。

2.1.2轉(zhuǎn)速對動態(tài)發(fā)酵產(chǎn)球形BC均勻度的影響

（1）轉(zhuǎn)速對BC總產(chǎn)量和不同大小球形BC質(zhì)量百分比的影響

轉(zhuǎn)速升高，供氧效率升高，但BC產(chǎn)量逐步下降，其原因可能是溶解氧過高時(shí)菌體不斷分裂，能源物質(zhì)主要被用于自身生長，而產(chǎn)纖維素的代謝途徑被抑制或是還未滿足某種代謝條件而未順利進(jìn)行，甚至可能是由于菌體對剪切力敏感性較強(qiáng)，轉(zhuǎn)速的提高，剪切力變大，從而使菌體生長及生產(chǎn)穩(wěn)定性變差且容易突變［17］。

圖2　轉(zhuǎn)速對BC總產(chǎn)量和不同大小球形BC質(zhì)量百分比的影響Fig.2 Effect of rotate speed on total yield o f BC and qua lity percent of sphere-like BC w ith different sizes

由圖2可知，當(dāng)供氧效率增高時(shí)，小球BC質(zhì)量百分比隨之升高，在轉(zhuǎn)速＞170 r/min之后，所產(chǎn)球形BC均為直徑＜5 cm的小顆粒；與之相對的大球BC質(zhì)量百分比在轉(zhuǎn)速80 r/min時(shí)達(dá)到最高值93.5%，而后隨供氧效率的增加快速減小，直至質(zhì)量百分比為0。只有在轉(zhuǎn)速為130 r/min時(shí)，中球BC質(zhì)量百分比達(dá)到最高40.29%，形貌均勻一致。其他轉(zhuǎn)速下所產(chǎn)中球BC質(zhì)量百分比均＜40%。

（2）轉(zhuǎn)速對BC總產(chǎn)量和不同大小球形BC數(shù)量百分比的影響

由圖3可知，隨著轉(zhuǎn)速升高，供氧效率提高，大球BC數(shù)量百分比從最高75.00%降至0，小球BC數(shù)量百分比不斷增高，從0升高至100%，中球BC數(shù)量百分比由0先升高至48.96%而又后降至0，在轉(zhuǎn)速為130 r/min時(shí)，中球數(shù)量百分比達(dá)到最高為48.96%。

結(jié)果表明，轉(zhuǎn)速為130 r/min時(shí)，此時(shí)供氧量最為合適，均勻度最好，所產(chǎn)中球BC產(chǎn)量與數(shù)量百分比均達(dá)到最高值分別為40.29%與48.96%，符合均勻度設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)，認(rèn)為其均勻度較佳。因此，轉(zhuǎn)速為130 r/min時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)為宜。

圖3　轉(zhuǎn)速對BC總產(chǎn)量和不同大小球形BC數(shù)量百分比的影響Fig.3 Effect of rotate speed on total yield of BC and quantity percent of sphere-like BC with different sizes

2.2液深對動態(tài)發(fā)酵產(chǎn)球形BC合成情況的影響

2.2.1液深對動態(tài)發(fā)酵產(chǎn)球形BC形貌的影響

培養(yǎng)基液體深度對動態(tài)合成球形BC情況的影響結(jié)果見圖4。由圖4可知，從表觀形貌發(fā)現(xiàn)，所產(chǎn)的球形BC均為實(shí)心球，但大小、數(shù)量及外觀變化較大。液深為1.00 cm時(shí)，供氧效率較高，為細(xì)小的顆粒，球形顆粒外還零星分布著小刺毛；隨著溶液深度的增加，供氧效率降低，球形顆粒變大，刺毛逐步減少，當(dāng)液深達(dá)2.05 cm后，均為光滑的球形顆粒。顆粒數(shù)隨液體深度的增加呈先增加后減少的趨勢。

圖4　動態(tài)發(fā)酵時(shí)不同液深條件下產(chǎn)生的球形BC的形態(tài)Fig.4 Morphology of sphere-like BC in d ifferent liquid depth during dynam ic fermentation

2.2.2液深對動態(tài)發(fā)酵產(chǎn)球形BC均勻度的影響

（1）液深對BC總產(chǎn)量和不同大小球形BC質(zhì)量百分比的影響

由圖5可知，隨著液深升高，BC產(chǎn)量在液深1.35 cm后，產(chǎn)量呈減小的趨勢，其原因是在同一發(fā)酵容器中，球形BC產(chǎn)量、形貌、大小及數(shù)量與液體深度有關(guān)，液體中的含氧量會隨著液深的增加而降低［18］，從而抑制了菌體的生長繁殖，產(chǎn)量降低。而在液深為1.00 cm時(shí)，供氧效率最高，但BC產(chǎn)量1.35 cm時(shí)較低，其可能是由于培養(yǎng)基量較少，營養(yǎng)不足，從而導(dǎo)致產(chǎn)量較低。當(dāng)供氧效率下降時(shí)，小球BC質(zhì)量百分比隨之下降，當(dāng)液深達(dá)到3.45 cm以后，小球BC質(zhì)量百分比均＜5%；與之相對的大球BC質(zhì)量百分比隨著液深的增加占比不斷升高，大球BC質(zhì)量百分比保持在80%以上。在液深為2.40 cm、2.75 cm時(shí)，中球BC質(zhì)量百分比分別為40.96%、43.05%，質(zhì)量百分比均達(dá)到40%以上，可認(rèn)為其所產(chǎn)BC形貌均勻度較好。

圖5　液深對BC總產(chǎn)量和不同大小球形BC質(zhì)量百分比的影響Fig.5 Effect of liquid depth on total yield of BC and quality percent of sphere-like BC with different sizes

（2）對BC總產(chǎn)量和不同大小球形BC數(shù)量百分比的影響

圖6　液深對BC總產(chǎn)量和不同大小球形BC數(shù)量百分比的影響Fig.6 Effect of liquid depth on total yield of BC and quantity percent of sphere-like BC w ith differen t sizes

由圖6可知，在液深為1.00～1.70 cm，供氧效率較高，此時(shí)所產(chǎn)均為小球，隨著供氧效率的降低，小球BC數(shù)量百分比由100%逐漸下降至8.06%，大球BC數(shù)量百分比由0逐漸上升至64.40%，而中球BC數(shù)量百分比先由0%增加至48.96%而后減少至27.54%，在液深為2.40～4.15 cm時(shí)，中球BC數(shù)量占比均超過40%。

結(jié)果表明，在液深為2.40～4.15 cm時(shí)，中球數(shù)量百分比均超過40%，但結(jié)合中球BC質(zhì)量百分比發(fā)現(xiàn)，在液深3.10～4.15 cm時(shí)質(zhì)量百分比低于40%，故確定在液深為2.40～2.75 cm時(shí)均勻度最佳。

2.3發(fā)酵容器直徑對動態(tài)發(fā)酵產(chǎn)球形BC合成情況的影響

2.3.1發(fā)酵容器直徑對動態(tài)發(fā)酵產(chǎn)球形BC形貌的影響

在不同發(fā)酵容器直徑下獲得一系列球形BC結(jié)果見圖7。

圖7　動態(tài)發(fā)酵時(shí)不同發(fā)酵容器直徑產(chǎn)生的球形BC的形態(tài)Fig.7 Morphology of sphere-like BC in different fermentation vessel diameter during dynam ic fe rm enta tion

由圖7可知，從形貌上觀察，所產(chǎn)的球形BC均為實(shí)心球，但大小、數(shù)量、外觀變化較大。液深一定時(shí)，發(fā)酵容器直徑越大，供氧效率越快，所產(chǎn)BC顆粒越小。隨著球形顆粒的變小，BC球數(shù)量逐步增加。

2.3.2發(fā)酵容器直徑對動態(tài)發(fā)酵產(chǎn)球形BC均勻度的影響（1）對BC總產(chǎn)量和不同大小球形BC質(zhì)量百分比的影響

圖8　容器直徑對BC總產(chǎn)量和不同大小球形BC質(zhì)量百分比的影響Fig.8 Effect of vesse l diam eter on BC total yield and quality percent of sphere-like BC w ith different sizes

由圖8可知，隨著發(fā)酵容器直徑的增加，表面積增大，氣液接觸面積變大，氧氣溶入液體培養(yǎng)基的速度也會越大，即其溶氧量也會越大［18］，此時(shí)小球BC質(zhì)量百分比隨之上升，當(dāng)杯身直徑達(dá)到9.0 cm后，均為小球BC，質(zhì)量百分比達(dá)100%；而大球BC質(zhì)量百分比隨著杯身直徑的增加而降低，直至質(zhì)量百分比為0。在容器直徑為6.0 cm和6.8 cm時(shí)，中球BC質(zhì)量百分比均超過40%，分別為41.29%和43.24%，所產(chǎn)BC均勻度較好。但BC產(chǎn)量隨發(fā)酵容器直徑呈減少的趨勢，其原因可能是發(fā)酵容器直徑的增加會帶來高剪切力，從而影響產(chǎn)量。

（2）對BC總產(chǎn)量和不同大小球形BC數(shù)量百分比的影響

圖9　容器直徑對BC總產(chǎn)量和不同大小球形BC數(shù)量百分比的影響Fig.9 Effect o f vessel d iam ete r on BC total yield and quantity percent of sphere-like BC w ith different sizes

由圖9可知，隨著容器直徑的增加，溶氧量增加，大球BC數(shù)量百分比逐漸降低，小球BC數(shù)量百分比不斷增加，中球BC數(shù)量百分比先增大后減小，在容器直徑為4.9～6.8 cm之間時(shí)，中球數(shù)量百分比均超過40%，在直徑為6.0 cm時(shí)，中球BC數(shù)量百分比達(dá)到最大值53.51%。

結(jié)果表明，根據(jù)不同直徑球形BC數(shù)量百分比，在容器直徑為4.9～6.8 cm時(shí)，中球占比較高，但容器直徑為4.9 cm時(shí)，其中球BC質(zhì)量占比只有27.78%，故容器直徑在6.0 cm與6.8cm時(shí)，所產(chǎn)BC均勻度較好，但在6.0 cm時(shí)產(chǎn)量是6.8 cm的1.4倍，考慮到產(chǎn)量因素，在容器直徑為6.0 cm時(shí)最佳。

2.4最優(yōu)條件下生產(chǎn)穩(wěn)定性分析

在上述最優(yōu)條件下（發(fā)酵容器直徑為6.0 cm，液深為2.40～2.75 cm，轉(zhuǎn)速為130 r/min時(shí)）重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，表1結(jié)果表明椰凍駒形桿菌（Komagataeibacternataicola）Y19產(chǎn)量較為穩(wěn)定，且中球BC質(zhì)量與數(shù)量百分比均＞40%，均勻度較佳，故通過上述發(fā)酵條件的優(yōu)化，能夠獲得較為穩(wěn)定的生產(chǎn)。

表1　最優(yōu)條件下生產(chǎn)穩(wěn)定性分析Table 1 Ana lysis of production stability under the op timum conditions

3　討論

轉(zhuǎn)速提高、發(fā)酵液液深降低及發(fā)酵容器直徑增大，均可使動態(tài)發(fā)酵時(shí)的供氧效率與剪切力提高。供氧效率增高，會提高BC合成的效率及產(chǎn)量，但過高的剪切力又會影響B(tài)C產(chǎn)量，YANG H等［16］也發(fā)現(xiàn)提高試驗(yàn)轉(zhuǎn)速，顆粒直徑減小同時(shí)顆粒表面的“刺突”狀纖維絲增多，使顆粒間相互連結(jié)。楊雪霞等［19］報(bào)道了發(fā)酵罐培養(yǎng)時(shí)，對比轉(zhuǎn)速較快的六葉平漿，采用轉(zhuǎn)速較低的框式槳進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量最高。朱宏陽等［20］以解淀粉芽孢桿菌2F-7為考察菌株，以三角瓶為發(fā)酵容器，裝液量從50/250 m L～100 m L/ 250 m L時(shí)，發(fā)現(xiàn)BC顆粒產(chǎn)率升高，且顆粒直徑逐漸增大，當(dāng)裝液量為70 m L/250 m L顆粒均勻度最佳。因此需要尋找到剪切力與供氧效率之間平衡點(diǎn)［21］。

4　結(jié)論

通過本研究發(fā)現(xiàn)隨著供氧效率的增加，剪切力增大，大球BC質(zhì)量及數(shù)量百分比降低，小球BC質(zhì)量及數(shù)量百分比升高，中球BC數(shù)量及質(zhì)量百分比呈先增高后降低的趨勢，故供氧效率與剪切力合適時(shí)，才能獲得合適大小的球形BC且產(chǎn)量較高。實(shí)驗(yàn)以中球BC質(zhì)量及數(shù)量百分比為評價(jià)指標(biāo)，探索了轉(zhuǎn)速，液深及發(fā)酵容器直徑條件引起的供氧效率及剪切力變化對動態(tài)發(fā)酵產(chǎn)球形BC均勻度的影響，可以得出在轉(zhuǎn)速為130 r/min時(shí)，液深為2.40～2.75 cm，發(fā)酵容器直徑為6.0 cm時(shí)，中球BC質(zhì)量與數(shù)量百分比均＞40%，能獲得形貌均勻一致、大小適中的球形BC。本實(shí)驗(yàn)為動態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)球形BC提供了參考，為進(jìn)一步擴(kuò)大生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。

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Culture conditions for the sphere-like bacterial cellulose by dynamic fermentation

ZHANG Cui，BI Jicai，CHEN Huamei，WANG Yanmei，LIU Sixin，LI Congfa*
（College of Food Science and Technology，Hainan University，Haikou 570228，China）

Bacterial cellulose（BC），especially sphere-like BC，as an excellent new biological material had been w idely applied in various fields.At present，the BC produced by dynamic fermentation was mainly irregular crumb，star shaped and filiform，and the application scope was lim ited. Therefore，it is urgent to obtain sphere-like BC w ith high uniformity by controlling the production conditions.During the dynamic fermentation，using Komagataeibacter nataicola Y19 as production strains，quality and quantity percent of sphere-like BC w ith medium size as the investigation indexes，the effects of the changes of supplying oxygen efficiency and shear force caused by rotate speed，fermented liquid depth and fermentation vessel diameter on the synthesis law of sphere-like BC were discussed.The results showed that the particle size of sphere-like BC was decreased and the quantity of sphere-like BC was increased w ith increasing the supplying oxygen efficiency and shear force.In the conditions of fermentation vessel diameter 6.0 cm，fermented liquid depth 2.40-2.75 cm and rotation speed 130 r/m in，the quality and quantity percent of sphere-like BC w ith medium size was more than 40%，and the uniform ity was up to the high set.

sphere-like bacterial cellulose；morphology of sphere-like bacterial cellulose；dynamic fermentation

TQ920．1

0254-5071（2016）05-0037-06

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．05．008

2016-03-08

海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助（314048）；?？谑袩釒мr(nóng)產(chǎn)品深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（2013-45）

章翠（1990-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)閼?yīng)用微生物技術(shù)。

李從發(fā)（1967-），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。