雷公藤內(nèi)酯通過下調(diào)CⅡTA抑制BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞MHCⅡ表達(dá)

金　銜，　曾常茜，　臧麗麗，　路　遙，　曹　巖，　鄒颯楓

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雷公藤內(nèi)酯通過下調(diào)CⅡTA抑制BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞MHCⅡ表達(dá)

金銜1，曾常茜2，臧麗麗1，路遙2，曹巖3，鄒颯楓1

目的觀察雷公藤內(nèi)酯對海人酸活化的BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞MHCⅡ分子表達(dá)的影響，并探討其相關(guān)的分子機(jī)制。方法將BV-2細(xì)胞隨機(jī)分為對照組、海人酸組、雷公藤內(nèi)酯組，免疫組化方法檢測雷公藤內(nèi)酯對海人酸活化的BV-2細(xì)胞MHCⅡ和CⅡTA蛋白的影響。結(jié)果對照組MHCⅡ陽性BV-2細(xì)胞為(0.059±0.005)，海人酸組MHCⅡ陽性BV-2細(xì)胞為(0.893±0.038)，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理二者存在顯著性差異(P<0.05)。雷公藤內(nèi)酯組MHCⅡ陽性BV-2細(xì)胞率(0.089±0.013)，與海人酸組比較二者存在顯著性差異(P<0.05)；對照組C ⅡTA陽性BV-2細(xì)胞為(0.043±0.003)，海人酸組CⅡTA陽性BV-2細(xì)胞為(0.692±0.015)，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理二者存在顯著性差異(P<0.05)。雷公藤內(nèi)酯組CⅡTA陽性BV-2細(xì)胞為(0.057±0.009)，與海人酸組比較存在顯著性差異(P<0.05)。結(jié)論雷公藤內(nèi)酯可以抑制海人酸活化的BV-2細(xì)胞MHCⅡ表達(dá)，其機(jī)制可能與下調(diào)BV-2細(xì)胞CⅡTA表達(dá)有關(guān)。

雷公藤內(nèi)酯；癲癇；小膠質(zhì)細(xì)胞；MHC Ⅱ；CⅡTA

癲癇是由多種原因引起的神經(jīng)元反復(fù)同步化異常放電所致的突然性、反復(fù)性和短暫性的運動、感覺、意識、精神、植物神經(jīng)等功能異常的腦部疾病，典型的臨床表現(xiàn)為癲癇持續(xù)狀態(tài)。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，癲癇發(fā)病率為千分之一，患病率為 3.6～7.0‰，其中約20%～30%藥物治療無法控制。癲癇發(fā)作可導(dǎo)致腦神經(jīng)元選擇性損傷甚至死亡，是癲癇頻發(fā)和難治的主要原因之一[1]。主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ類分子(major histocompatibility complex classⅡ molecules，MHCⅡ)在抗原提呈、CD4+T細(xì)胞激活及特異性免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用。MHCⅡ類分子表達(dá)失調(diào)與多種疾病有關(guān)，在癲癇發(fā)作的急性期，大多數(shù)大鼠黑質(zhì)區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞被激活并表達(dá)MHCⅡ類分子。

雷公藤內(nèi)酯(triptolide,TP)是從雷公藤中分離得到的內(nèi)萜二酯類化合物，是雷公藤中最具代表性的成分之一，是雷公藤抗炎及發(fā)揮免疫抑制作用的主要成分[2,3]。本實驗以海人酸活化的BV-2細(xì)胞作為研究對象，觀察雷公藤內(nèi)酯對海人酸活化的BV-2細(xì)胞MHCⅡ類分子表達(dá)的影響，并進(jìn)一步探討其分子機(jī)制，旨在為雷公藤內(nèi)酯抗癲癇的研究與開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1　材料和方法

1.1材料BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞由中國醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室惠贈，海人酸購自Sigma公司，雷公藤內(nèi)酯購自北京優(yōu)尼康公司，DMEM高糖培養(yǎng)基購自Gibco公司，胎牛血清購自Hyclone公司，胰蛋白酶購自Anersco公司。大鼠抗小鼠MHCⅡ抗體、兔抗小鼠CⅡTA抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司，兔抗大鼠IgG-HRP抗體、羊抗兔IgG-HRP抗體購自北京中杉金橋公司。

1.2方法

1.2.1BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞的分組及培養(yǎng)將BV-2細(xì)胞隨機(jī)對照組、海人酸組、雷公藤內(nèi)酯組。對照組：BV-2細(xì)胞加入新鮮DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；海人酸組：BV-2細(xì)胞用終濃度為100 nmol海人酸的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h；雷公藤內(nèi)酯組：先用終濃度為10 nmol雷公藤內(nèi)酯的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h，棄掉培養(yǎng)基后，再加入終濃度為100 nmol海人酸的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h。

1.2.2免疫組化法檢測BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞MHCⅡ和CⅡTA蛋白表達(dá)取對數(shù)生長期的BV-2細(xì)胞接種于內(nèi)放置有蓋玻片的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃培養(yǎng)24 h，棄去孔中培養(yǎng)基，PBS緩沖液洗滌細(xì)胞兩次，按上述方法將BV-2細(xì)胞隨機(jī)分為3組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸棄培養(yǎng)基，PBS緩沖液洗滌細(xì)胞兩次后，用75%的乙醇在4 ℃固定15 min?？諝飧稍?0 min，PBS沖洗3次，5 min/次，3% H2O2孵育15 min，PBS沖洗3次，5 min/次，正常羊血清室溫封閉20 min。大鼠抗小鼠MHCⅡ抗體、兔抗小鼠CⅡTA抗體1∶300稀釋，4 ℃孵育過夜，PBS沖洗3次，5 min/次。兔抗大鼠IgG-HRP抗體、羊抗兔IgG-HRP抗體室溫孵育30 min，PBS沖洗3次，5 min/次。DAB顯色，在顯微鏡下觀察染色效果，待細(xì)胞著色后立即吸棄染色液，自來水沖洗，蘇木素復(fù)染30 s，自來水沖洗，中性樹膠封片，鏡下觀察。

2　結(jié)　果

2.1雷公藤內(nèi)酯對海人酸活化的BV-2細(xì)胞MHCⅡ蛋白表達(dá)的影響對照組MHCⅡ蛋白陽性BV-2細(xì)胞為(0.059±0.005)，海人酸組MHCⅡ陽性BV-2細(xì)胞為(0.893±0.038)，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理二者存在顯著性差異(P<0.05)。雷公藤內(nèi)酯組MHCⅡ蛋白陽性BV-2細(xì)胞為(0.089±0.013)，與海人酸組比較存在顯著性差異(P<0.05)(見圖1)。

2.2雷公藤內(nèi)酯對海人酸活化的BV-2細(xì)胞CⅡTA蛋白表達(dá)的影響對照組CⅡTA蛋白陽性BV-2細(xì)胞為(0.043±0.003)，海人酸組CⅡTA陽性BV-2細(xì)胞為(0.692±0.015)，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理兩組存在顯著性差異(P<0.05)。雷公藤內(nèi)酯組CⅡTA蛋白陽性BV-2細(xì)胞為(0.057±0.009)，與海人酸組比較存在顯著性差異(P<0.05)(見圖2)。

3　討　論

研究發(fā)現(xiàn)，靜止?fàn)顟B(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞不表達(dá)或者微量表達(dá)MHCⅡ類分子，海人酸活化小膠質(zhì)細(xì)胞高度表達(dá)MHCⅡ類分子，具有抗原提呈功能，通過免疫應(yīng)答誘導(dǎo)神經(jīng)元死亡[4～6]。在持續(xù)性癲癇后1 d錐體細(xì)胞層CA3區(qū)有明顯的神經(jīng)退行性變，持續(xù)性癲癇發(fā)作后4～8 d，MHCⅡ陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞明顯增加。將微量的破傷風(fēng)毒素注入大鼠形成癲癇樣癥狀，在癲癇發(fā)作的急性期大多數(shù)大鼠黑質(zhì)區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞被激活并表達(dá)MHCⅡ類分子。癲癇患者和癲癇小鼠模型腦海馬中CD8+T 細(xì)胞數(shù)量明顯比CD4+T 數(shù)量多，CD4+T 細(xì)胞傾向于浸潤到腦皮質(zhì)，而CD8+T細(xì)胞傾向于浸潤到大腦海馬。細(xì)胞毒性CD8+T 細(xì)胞介導(dǎo)攻擊神經(jīng)元是癲癇發(fā)病的關(guān)鍵機(jī)制[7,8]。

本實驗用雷公藤內(nèi)酯預(yù)處理大鼠及BV-2細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MHCⅡ蛋白陽性表達(dá)的BV-2細(xì)胞數(shù)量明顯降低，表明雷公藤內(nèi)酯能抑制海人酸活化的BV-2細(xì)胞MHCⅡ類分子的表達(dá)，從而起到保護(hù)神經(jīng)元的作用。

CⅡTA基因是瑞士科學(xué)家Mach在1993年研究MHCⅡ類分子缺陷的裸淋巴細(xì)胞綜合征(Bare lymphocyte syndrome,BLS)患者時發(fā)現(xiàn)的一種基因。人類CⅡTA基因位于16號染色體(16 p13，13)，全長4543 bp。研究發(fā)現(xiàn)，MHCⅡ類分子的表達(dá)受到極為嚴(yán)格的調(diào)控，調(diào)控MHC-Ⅱ類分子基因主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，MHC-Ⅱ反式激活蛋白(class II transactivator，CⅡTA)是MHC Ⅱ類分子轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵控制因素，CⅡTA對于MHCⅡ類分子的表達(dá)是必要條件，并且是一個主要的限速因素[9]。CⅡTA是一種非DNA結(jié)合蛋白，不能直接與MHC-Ⅱ基因結(jié)合的啟動子直接結(jié)合而發(fā)揮作用。CREB、RFX5、RFXANK、NF-YB及NF-YC等轉(zhuǎn)錄因子相互作用形成了一個稱為MHC增強(qiáng)體的結(jié)構(gòu)，這是MHC-Ⅱ表達(dá)所必需的。MHC增強(qiáng)體結(jié)構(gòu)為CⅡTA的招募提供了合適的作用面，CⅡTA分子C端和中部能夠與該增強(qiáng)體結(jié)合，然后通過CⅡTA分子的N端的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)發(fā)揮激活MHC-Ⅱ類基因的作用[10]。

在小鼠造血祖細(xì)胞中由于缺少Ⅱ類分子轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵因子CⅡTA，即使用IFN-γ等細(xì)胞因子刺激后小鼠造血祖細(xì)胞表面也不表達(dá)MHCⅡ類分子[11]。無論在小鼠還是在人體中，CⅡTA的表達(dá)水平直接影響著MHCⅡ的表達(dá)量，而MHCⅡ的表達(dá)水平與T淋巴細(xì)胞的活化相關(guān)。用人類白蛋白治療劑預(yù)處理小鼠單核細(xì)胞，MHCⅡ、CⅡTA和H-2M基因表達(dá)增加，使抗原提呈細(xì)胞激活T細(xì)胞的能力增強(qiáng)[12]。Nikodemova M等[13]研究發(fā)現(xiàn)，二甲胺四環(huán)素可通過下調(diào)實驗性過敏性腦炎大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞CⅡTA轉(zhuǎn)錄，降低MHCⅡ表達(dá)水平，進(jìn)而使臨床癥狀減輕及病程縮短。本實驗通過免疫組化方法研究發(fā)現(xiàn)，海人酸組CⅡTA陽性表達(dá)的BV-2細(xì)胞與對照組比較顯著增加，而雷公藤內(nèi)酯組CⅡTA陽性表達(dá)的BV-2細(xì)胞與海人酸組比較顯著降低，表明雷公藤內(nèi)酯可能是通過下調(diào)CⅡTA表達(dá)而降低MHCⅡ類分子表達(dá)。

綜上所述，雷公藤內(nèi)酯可以明顯降低海人酸活化的BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞過表達(dá)MHCⅡ類分子，其作用機(jī)制可能是通過下調(diào)CⅡTA而進(jìn)一步調(diào)控MHCⅡ類分子的表達(dá)。

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注：對照組(a)，海人酸組(b)，雷公藤內(nèi)酯組(c)；放大倍數(shù)：×200

圖1雷公藤內(nèi)酯對海人酸活化的BV-2細(xì)胞MHC Ⅱ蛋白表達(dá)的影響

Triptolide inhibited the expression of MHC Ⅱ through downregulating the expression of CⅡTA in kainic acid-activated BV-2 microglia

JINXian,ZENGChangqian,ZANGLili,etal.

(DepartmenofNeurologyofDalianCentralHospital,Dalian116033,China)

ObjectiveTo observe the effect of triptolide on the expression of MHC Ⅱ in kainic acid-activated BV-2 microglia and investigate the related moleculsr molecular mechanism.MethodBV-2 cells were divided into control group,kainic acid group and triptolide group.Immunohistochemistry techniques were used to detect the effect of triptolide on the expressions of MHCⅡ and CⅡTA of kainic acid-activated BV-2 cells.ResultThe MHCⅡ-positive BV-2 cells in control group was (0.059±0.005).The MHC Ⅱ-positive BV-2 cells in kainic acid group was (0.893±0.038) and there was obvious difference compared with that of control group (P<0.05).The MHCⅡ-positive BV-2 cells in triptolide group was (0.089±0.013) and there was obvious difference compared with the kainic acid group (P<0.05).The CⅡTA-positive BV-2 cells in control group was (0.043±0.003).The CⅡTA-positive BV-2 cells in kainic acid group was (0.692±0.015) and there was obvious difference compared with that of the control group (P<0.05).The CⅡTA-positive BV-2 cells in triptolide group was (0.057±0.009) and there was obvious difference compared with that of the kainic acid group (P<0.05).ConclusionTriptolide could inhibit the expression of MHCⅡ in kainic acid-activated BV-2 cells,the mechanism may be related to downregulating the expression of CⅡTA in kainic acid-activated BV-2 cells.

Triptolide;Epilepsy;Microglia;MHCⅡ;CⅡTA

注：對照組(a)，海人酸組(b)，雷公藤內(nèi)酯組(c)；放大倍數(shù)：×200

1003-2754(2016)08-0729-03

2016-04-12；

2016-08-02

2013年度遼寧省科學(xué)技術(shù)計劃項目(2013225086)

(1.大連市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 大連 116033;2.大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院，遼寧省生物有機(jī)重點實驗室，遼寧 大連 116622；3.大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院，遼寧 大連 116021)

鄒颯楓，E-mail：dlzsf62@163.com

R742.1

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