Mdx小鼠骨骼肌中炎癥反應(yīng)和mpeg1的表達(dá)

崔紅穎，　要萌萌，　宋學(xué)琴，　吳紅然，　陳雪曉，　陳秀曉，　王　雪，　宋　平

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Mdx小鼠骨骼肌中炎癥反應(yīng)和mpeg1的表達(dá)

崔紅穎1，要萌萌2，宋學(xué)琴1，吳紅然1，陳雪曉1，陳秀曉2，王雪3，宋平4

目的探討mdx小鼠不同時期骨骼肌的炎性病理改變，觀察mpeg1在mdx小鼠及對照鼠中的表達(dá)。方法選取雄性C57BL/10ScSn-Dmdmdx/JNju鼠為實(shí)驗組，對照組為雄性C57BL/6ScSn小鼠，根據(jù)年齡分為2 w、4 w、8 w、12 w 4個亞組。通過HE染色、MGT染色、ACP染色觀察骨骼肌光鏡下的形態(tài)學(xué)改變，總結(jié)mdx小鼠骨骼肌炎性病理變化。通過RNA提取，基因芯片的檢測及mpegl的qRT-PCR檢測，觀察mpeg1的表達(dá)情況。結(jié)果常規(guī)組織染色中，2 w的mdx小鼠肌肉偶見高度濃染的肌纖維，未見肌細(xì)胞壞死，炎癥細(xì)胞浸潤，4 w可見巨噬細(xì)胞吞噬現(xiàn)象散在分布，8 w時炎細(xì)胞浸潤灶融合成片，12 w時炎性病灶面積減??；利用基因芯片技術(shù)篩選出mdx小鼠中有關(guān)炎癥反應(yīng)的基因30余個，結(jié)果顯示與2 w相比，炎癥反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)量均增加，在8 w時達(dá)到峰值，12 w有所下降，但較2 w時仍有升高；qRT-PCR結(jié)果顯示從4 w開始，mdx小鼠中mpeg1的含量逐漸增加，8 w時含量最高。結(jié)論(1)炎癥反應(yīng)參與mdx小鼠疾病的發(fā)生發(fā)展：從2 w開始出現(xiàn)，8 w達(dá)到高峰，12 w趨于平穩(wěn)；(2)Mpeg1在mdx小鼠炎癥反應(yīng)中發(fā)揮了一定的作用。

Duchenne肌營養(yǎng)不良；Mdx小鼠；炎癥反應(yīng)；病理特點(diǎn)；基因芯片；Mpeg1

Duchenne型肌營養(yǎng)不良(duchenne muscular dystrophy，DMD)是一種X連鎖隱性遺傳性疾病，為編碼dystrophin蛋白的基因發(fā)生缺失、插入和點(diǎn)突變，導(dǎo)致dystrophin蛋白的功能缺失引起肌纖維的變性和壞死[1]，在各類肌營養(yǎng)不良中發(fā)病率最高，約為1/3500男嬰[2]，該病起病隱襲，發(fā)病年齡偏小，且病死率高，受到廣泛關(guān)注。目前關(guān)于DMD的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，涉及到很多常見的機(jī)制，例如鈣離子內(nèi)流、炎癥細(xì)胞浸潤、促炎和促進(jìn)纖維化細(xì)胞因子的激活、各種蛋白水解酶的活化、自噬的缺陷和細(xì)胞凋亡[3]等。有研究顯示局部的炎癥反應(yīng)是肌肉纖維化和脂肪組織滲透的觸發(fā)點(diǎn)，最終導(dǎo)致肌細(xì)胞纖維化并由脂肪組織替代，失去功能[4]。研究證實(shí)，巨噬細(xì)胞在一般肌肉損傷所導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮了主要的作用[5]。巨噬細(xì)胞表達(dá)基因1(Maerophage expressed gene 1，mpeg1)是首個被發(fā)現(xiàn)高表達(dá)于人類和鼠科動物巨噬細(xì)胞內(nèi)的基因[6]，其編碼的蛋白為穿孔素2(perforin-2)， mpegl基因在炎癥反應(yīng)中起著一定的作用。mdx小鼠與DMD患者有相同的遺傳基礎(chǔ)，已經(jīng)被廣泛用于DMD研究的各個領(lǐng)域[7]。在mdx小鼠疾病發(fā)展過程中，炎癥反應(yīng)是否一成不變、巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是否參與其中是我們感興趣的。本實(shí)驗欲通過組織化學(xué)染色方法觀察mdx小鼠不同骨骼肌的炎性病理改變，利用基因芯片技術(shù)篩選與炎癥相關(guān)基因在疾病不同時期的動態(tài)表達(dá)，進(jìn)一步通過qRT-PCR技術(shù)觀察mpegl在mdx小鼠及對照鼠中的表達(dá)。探討巨噬細(xì)胞相關(guān)性炎癥在mdx小鼠中的作用，為DMD提供新的治療靶點(diǎn)。

1　材料與方法

1.1小鼠選取雄性C57BL/10ScSn．Dmdmdx/JNju鼠(購于南京大學(xué)模式動物研究所)為實(shí)驗組，對照組為雄性C57BL/6ScSn小鼠，根據(jù)年齡分為2 w、4 w、8 w、12 w。每組各時間點(diǎn)選取6只，3只用于常規(guī)組織化學(xué)染色，3只用于基因芯片檢測和qRT-PCR測定。操作過程標(biāo)準(zhǔn)，符合NIH指南。

1.2肌肉標(biāo)本采集實(shí)驗動物經(jīng)10%水合氯醛腹腔麻醉，分別剪取股四頭肌、腓腸肌、脛骨前肌、肱二頭肌、心肌，取材的新鮮骨骼肌標(biāo)本，用于組織切片染色的，在經(jīng)液氮冷卻的異戊烷中速凍，行連續(xù)切片，設(shè)置厚度為8 μm；用于RNA提取的，在液氮中速凍后，存于超低溫冰箱待用。

1.3肌肉組織常規(guī)化學(xué)染色分別對冰凍切片行HE染色、MGT染色、ACP染色，觀察其光鏡下的形態(tài)學(xué)變化。

1.4基因芯片及qRT-PCR

1.4.1利用Triozl法提取總RNA后，制作基因芯片:(1)Qiangen Mini Kit純化總RNA;(2)cDNA的合成;(3)cRNA合成;(4)Qiangen Mini Kit純化cRNA;(5)cRNA濃度的測定;(6)cRNA樣品熒光標(biāo)記;(7)Qiangen Mini Kit純化熒光標(biāo)記的cRNA;(8)cRNA樣品片段化和芯片雜交;(9)芯片洗滌掃描。

1.4.2Mpeg1基因的qRT-PCR目的基因引物的合成Mpeg1、GAPDH引物序列依據(jù)文獻(xiàn)報道由北京賽百盛生物工程公司提供。Mpegl引物序列：上游：5’-TGA TGC GAA AGT CAC CAA CT-3’，下游：5’-CAG GTT CTT CTG CTC CAG GT-3’；GAPDH引物序列：上游：5’-ATG ACA TCA AGA AGG TGG TG-3’，下游：5’-CAT ACC AGG AAA TGA GCT TG-3’。大致操作過程為：行逆轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增時PCR反應(yīng)體系(20 μl)，內(nèi)含第一鏈產(chǎn)物 2 μl，上、下游引物各2 μl，2×Power qPCR RreMix 10 μl，ROX 0.4 μl，并用蒸餾水補(bǔ)至終體積。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃ 15 s，59 ℃ 30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。于每個循環(huán)的第3步收集熒光信號。

2　結(jié)　果

2.1常規(guī)組織化學(xué)方法利用此方法我們觀察到2 w的mdx小鼠股四頭肌、腓腸肌、脛骨前肌和肱二頭肌中肌細(xì)胞大小基本一致，偶見高度濃染的肌纖維，未見肌細(xì)胞壞死，炎癥細(xì)胞浸潤；4 w可見巨噬細(xì)胞吞噬現(xiàn)象散在分布，偶見小灶樣分布；8 w時炎細(xì)胞浸潤灶融合成片，12 w時炎性病灶面積減?。籱dx小鼠心肌中未見到變性、壞死和炎細(xì)胞浸潤；同齡對照鼠各骨骼肌中未見上述病理改變(見圖1～圖4)。

2.2基因芯片技術(shù)對mdx小鼠股四頭肌進(jìn)行mRNA測定所得結(jié)果按P<0.05、Foldchange>2.0和Foldchange<-2.0篩選出有關(guān)炎癥反應(yīng)的基因數(shù)個，結(jié)果顯示與2 w相比，炎癥反應(yīng)相關(guān)基因隨疾病進(jìn)展表達(dá)量增加，在8 w時達(dá)到峰值，12 w有所下降，但較2 w時仍有升高，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見表1)。

2.3利用qRT-PCR技術(shù)對mpeg1基因進(jìn)行定量分析結(jié)果顯示在2 w時，mdx小鼠與對照鼠之間mpeg1的含量無差別；從4 w開始，mdx小鼠中mpeg1的含量逐漸增加，8 w時含量最高，與對照鼠同周齡間差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但mdx小鼠4 w、8 w、12 w之間表達(dá)量差別無統(tǒng)計學(xué)意義；而對照鼠各周齡間差別無統(tǒng)計學(xué)意義(見圖5)。

A～D:mdx小鼠;E～H:對照小鼠

圖1各年齡組股四頭肌HE染色(×400)

表1　各年齡組mdx小鼠中與炎癥相關(guān)的部分基因表達(dá)量的Foldchange值相互比較

基因結(jié)果按Foldchange>2.0和Foldchange<-2.0進(jìn)行篩選，P<0.05

A～D:mdx小鼠；E～H:對照小鼠

A～D:mdx小鼠；E～H:對照小鼠

A～D:mdx小鼠；E～H:對照小鼠

圖5mdx小鼠及對照鼠各年齡組股四頭肌mpeg1基因的qRT-PCR分析(★P<0.05 mdx vs C57BL/6;*P<0.05 vs mdx 2 w)

3　討　論

有研究證實(shí)，mdx小鼠病理改變開始于3 w，壞死/再生現(xiàn)象出現(xiàn)在6 w左右，并持續(xù)至12 w[8]。本實(shí)驗選取2 w、4 w、8 w、12 w雄性mdx小鼠為實(shí)驗鼠，分別取股四頭肌、腓腸肌、脛骨前肌、肱二頭肌和心肌進(jìn)行HE、MGT、ACP等常規(guī)染色。

HE染色結(jié)果顯示2 w時上述各肌肉組織中肌細(xì)胞大小基本一致(見圖1、圖2)(部分肌肉組織圖未展示)，可見肌分裂和中央核現(xiàn)象，偶見高度濃染的肌纖維，又稱不透明肌纖維。不透明肌纖維被認(rèn)為是肌纖維變性的一種形式，并非DMD的特異性病理表現(xiàn)，也可見于其他類型的肌肉損傷[9]。這說明mdx小鼠2 w時病理改變已存在。從4 w開始，可見肌纖維大小明顯不等，肌分裂現(xiàn)象，肌纖維變性壞死，炎癥細(xì)胞浸潤，吞噬細(xì)胞清除壞死肌纖維，肌纖維再生從壞死周邊開始。吞噬細(xì)胞中因含大量的溶酶體酶，所以ACP酶染色陽性，呈紅染色，運(yùn)用ACP酶染色能夠清晰的觀察到炎性吞噬病灶的大小。在ACP染色中(見圖4)，2 w時觀察不到陽性現(xiàn)象;4 w時吞噬細(xì)胞散在分布，偶見小灶樣分布；8 w時散在分布的陽性細(xì)胞和小灶樣及融合成大片狀的病灶共存，炎癥反應(yīng)達(dá)到高峰；12 w時大片狀陽性病灶消失，僅可見炎細(xì)胞散在或成堆分布于肌纖維間，較8 w時減弱。MGT染色可見線粒體數(shù)量較人的骨骼肌增多(見圖3)，這一現(xiàn)象在其他模型鼠也可觀察到，并無特異性。此外，在本實(shí)驗中，我們沒有觀察到mdx小鼠心肌細(xì)胞存在炎癥細(xì)胞的浸潤及其他病理改變，并且隨年齡增長心肌細(xì)胞變化不大(圖未展示)。mdx小鼠股四頭肌、腓腸肌、脛骨前肌和肱二頭肌之間，也沒有觀察到明顯不同的病理改變，這一現(xiàn)象與DMD患者的近端肌無力為主、肢帶肌明顯受累所不同。DMD患者壽命短暫且是致死性的，而mdx小鼠的臨床表現(xiàn)輕微且基本上不影響壽命，這些差異表明還有其他機(jī)制參與其中，如mdx小鼠dystrophy蛋白被功能相近的urtrophy蛋白代替所致[10]。

為了更好地理解炎癥在疾病進(jìn)展中的作用，我們對炎癥反應(yīng)在mdx小鼠中的動態(tài)表達(dá)進(jìn)行了深入的研究。本實(shí)驗運(yùn)用基因芯片技術(shù)對mdx小鼠從mRNA水平進(jìn)行了動態(tài)監(jiān)測，篩選出表達(dá)量變化有統(tǒng)計學(xué)意義的基因，其中參與炎癥反應(yīng)不同方面的基因(見表1)按功能分為細(xì)胞因子及細(xì)胞因子受體、內(nèi)皮細(xì)胞特異表達(dá)基因、淋巴細(xì)胞和骨髓細(xì)胞marker、趨化因子及其受體、補(bǔ)體系統(tǒng)相關(guān)基因等。它們雖然從不同方面參與炎癥反應(yīng)，但整體趨勢相同，即隨著疾病進(jìn)展，表達(dá)量逐漸增加，在8 w時達(dá)峰值，12 w時表達(dá)有所下降，這與我們觀察到的病理特點(diǎn)一致。

巨噬細(xì)胞是炎癥灶內(nèi)的主要浸潤細(xì)胞。那么巨噬細(xì)胞在mdx小鼠疾病過程中有何變化？Mpeg1是首個被發(fā)現(xiàn)高表達(dá)于人類和鼠科動物巨噬細(xì)胞內(nèi)的基因，其編碼的蛋白是穿孔素2(perforin-2)，在斑馬魚中轉(zhuǎn)入mpeg1基因后巨噬細(xì)胞系反應(yīng)明顯增加，說明mpeg1特異性表達(dá)于巨噬細(xì)胞內(nèi)[6]。通過對mpeg1基因的觀測，可以間接反應(yīng)巨噬細(xì)胞的變化。我們的實(shí)驗證實(shí)，在mdx小鼠體內(nèi)，隨疾病進(jìn)展，mpeg1的表達(dá)量逐漸增加，8 w時表達(dá)量最高，12 w時下降，但仍較4 w時高，說明巨噬細(xì)胞系統(tǒng)與炎癥反應(yīng)的變化趨勢相同。Mpeg1調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞在炎癥反應(yīng)中的具體作用機(jī)制尚不清楚，如何抑制mpeg1的表達(dá)，減少巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有待于進(jìn)一步研究。

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The inflammation and the expression of mpeg1 in mdx mice skeletal muscle

CUIHongying,YAOMengmeng,SONGXueqin,etal.

(DepartmentofNeurology,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China)

ObjectiveIn this study，We hope to observe the inflammation changes in skeletal muscles of mdx mice in different periods，furthermore observe the dynamic expression of macrophage expressed gene 1.MethodsMale C57BL/1 0ScSn-Dmdmdx/JNju mice were used as the experimental group，male C57BL/6ScSn mice were used as the control group，all mice were divided according to age 2 week，4 week，8 week and 12 week.The frozen sections of muscles were stained with three routine methods，including HE staining，MGT staining and ACP staining，which were used to observe the morphological and inflammatory pathology changes.Then we extracted RNA for qRT-PCR detection of mpeg1 and gene chip testing.ResultsIn histological staining，We occasionally observed highly stain of muscle fibers in 2 w of mdx mice muscle cells，no necrosis，no inflammatory cells infiltration，We found scattered macrophage phagocytosis in muscles of age 4 w，a host of inflammatory cells integrated into groups at age 8 w，the area of inflammatory lesions was reduced at age 12 w;We screened more than 30 genes related to inflammation Using using gene chip technology，the results showed a peak at 8 w，while at 12 w declined;the qRT-PCR results showed that the expression of mpeg1 gradually increased from 4 w，and reached the highest level at 8 w.ConclusionInflammation involved in the development of the mdx mice：beginning to emerge from 2 week，peak at 8 week，stabilized at 12 week;Mpeg1 plays a certain role in the inflammatory response in mdx mice.

Duchenne muscular dystrophy;Mdx mice;Inflammation;Pathological character;Gene chip;Mpeg 1

1003-2754(2016)08-0711-04

2016-04-20；

2016-05-29

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北省神經(jīng)病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室，河北 石家莊 050000；2.邢臺市人民醫(yī)院，河北 邢臺 054000；3.中國人民解放軍260醫(yī)院，河北 石家莊 050000；4.河北省人民醫(yī)院，河北 石家莊 050000)

宋學(xué)琴，E-mail：sxq5679@163.com

R746.2

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