預處理對玉米秸稈纖維結(jié)構(gòu)特性和酶解效率的影響

趙晶，張福蓉，陳明，徐晨，權(quán)春善，范圣第

（1.大連民族大學生命科學學院，國家民委-教育部生物化工重點實驗室，遼寧大連116600；2.大連工業(yè)大學生物工程學院，遼寧大連116034）

趙晶1，張福蓉1，陳明2*，徐晨1，權(quán)春善1，范圣第1

（1.大連民族大學生命科學學院，國家民委-教育部生物化工重點實驗室，遼寧大連116600；2.大連工業(yè)大學生物工程學院，遼寧大連116034）

為研究不同溫度下NaOH預處理對玉米秸稈纖維結(jié)構(gòu)特性和酶解得率的影響，為確定纖維原料堿法預處理的適宜條件提供理論依據(jù)，采用稀NaOH溶液對玉米秸稈分別在60、80、105℃下預處理，測定了預處理前后纖維原料的化學組成和酶解得率，并采用掃描電鏡（SEM）、X射線衍射儀（XRD）和傅里葉變換紅外光譜儀（IR）對預處理前后玉米秸稈的纖維結(jié)構(gòu)進行了表征。結(jié)果表明：NaOH預處理能夠有效脫除玉米秸稈中木質(zhì)素，增加纖維素和半纖維素比例，提高纖維素結(jié)晶度，產(chǎn)生的潤漲作用導致纖維束狀結(jié)構(gòu)疏松。NaOH 80℃預處理1 h后，玉米秸稈中纖維素結(jié)晶度達到63.7%，60 h的酶解得率達到71.4%；堿處理溫度進一步升高則會充分暴露纖維表面紋孔，同時使纖維素分子內(nèi)氫鍵重新形成，容易進一步損失半纖維素，降低纖維素的潤漲程度，從而降低酶解效率。80℃條件下堿處理能夠有效改善玉米秸稈纖維結(jié)構(gòu)，提高其轉(zhuǎn)化利用效率。

玉米秸稈；NaOH預處理；化學組成；纖維結(jié)構(gòu)；酶水解

趙晶，張福蓉，陳明，等.NaOH預處理對玉米秸稈纖維結(jié)構(gòu)特性和酶解效率的影響［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報，2016，35（7）：1407-1412.

ZHAO Jing，ZHANG Fu-rong，CHEN Ming，et al.Effect of NaOH pretreatments on cellulosic structure and enzymatic hydrolysis of corn stover［J］.Journal of A gro-Environment Science，2016，35（7）：1407-1412.

化石燃料資源日益枯竭引發(fā)能源短缺，溫室氣體排放導致環(huán)境問題加劇，開發(fā)利用清潔可再生能源受到廣泛關(guān)注［1］。乙醇、丁醇等生物質(zhì)能源被認為是傳統(tǒng)化石燃料的最佳替代品［2-3］。目前乙醇等生物質(zhì)能源的生產(chǎn)主要以糧食淀粉為原料，存在生產(chǎn)成本高、原料供應(yīng)有限等問題［4-5］。玉米秸稈在我國是一類量大而集中的木質(zhì)纖維廢棄物，年產(chǎn)量高達2.5億t，目前因缺乏對其有效利用，而多采用直接燒掉或棄置于農(nóng)田的處理方式，既浪費資源又污染環(huán)境。利用玉米秸稈為原料替代糧食來生產(chǎn)生物質(zhì)能源或化學品，不僅能夠?qū)崿F(xiàn)資源的有效利用，還可以解決環(huán)境問題，具有巨大的產(chǎn)業(yè)化潛力。

玉米秸稈富含纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，采用酶解技術(shù)將纖維素和半纖維素降解成可發(fā)酵性糖，可用于發(fā)酵制備生物燃料和化學品［6］。木質(zhì)纖維原料中木質(zhì)素和半纖維素對纖維素的包裹作用以及纖維素的高結(jié)晶度，阻礙了纖維素酶的可及性，因此在酶解前采取適宜的預處理，是提高纖維原料酶解效率的關(guān)鍵［7-8］。目前對玉米秸稈常用的預處理方法包括蒸汽爆破、酸法預處理、堿法預處理等，其中堿法預處理工藝相對簡單，能夠有效脫除木質(zhì)素，預處理效果顯著，應(yīng)用較為廣泛［9-11］。Chen等［12］比較了用稀酸、石灰、氨水/稀酸、稀堿4種不同化學試劑對玉米秸稈進行預處理，結(jié)果表明稀堿預處理對于纖維殘渣酶解效率的提高最為有效；He等［13］對玉米秸稈采用NaOH溶液潤漲聯(lián)合濕法球磨的預處理技術(shù)，發(fā)現(xiàn)能夠有效脫除木質(zhì)素，提高酶解得率；周殿芳等［14］采用NaOH溶液中加入雙氧水對玉米秸稈進行浸泡處理，以木質(zhì)素脫除率為衡量指標優(yōu)化了預處理條件；姚曉琰等［15］利用稀NaOH溶液處理玉米秸稈，以去除木質(zhì)素、減少半纖維素和纖維素的損失為目的，對其處理條件進行優(yōu)化，進一步研究發(fā)現(xiàn)尿素與NaOH的混合溶液對木質(zhì)素去除效果更顯著；鄭明霞等［16］比較了NaOH和Ca（OH）2常溫下堆漚處理對玉米秸稈中纖維素結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果表明NaOH預處理表現(xiàn)出更好的纖維素潤漲能力和反應(yīng)性。上述玉米秸稈的堿法預處理多集中于工藝條件的優(yōu)化，從纖維微觀結(jié)構(gòu)變化的角度來探究堿法預處理改善玉米秸稈酶解效率的機制則鮮有報道。

本研究對玉米秸稈在不同溫度下進行NaOH預處理，比較了預處理前后玉米秸稈的成分、纖維結(jié)構(gòu)和酶解得率的變化，分析纖維結(jié)構(gòu)特性的變化對酶解效率的影響，旨在初步揭示堿處理技術(shù)對玉米秸稈預處理的內(nèi)在機制，以期為玉米秸稈的高效資源化利用提供理論依據(jù)。

1　材料和方法

1.1材料

原料：實驗所用玉米秸稈樣品采自遼寧省大連市郊區(qū)，自然風干后粉碎，過40目篩，備用。

試劑：Cellic CTec2復合纖維素酶購自Novozymes公司，該酶制劑中含有纖維素酶、纖維二糖酶、木聚糖酶等酶活力。

主要儀器：日本Shimadzu IRPrestige-21傅里葉變換紅外光譜儀；日本Shimadzu XRD-6000 X射線衍射儀；日本Hitachi S-4800掃描電子顯微鏡；美國GE Ultrospec 4300 pro紫外可見分光光度計；天津泰斯特儀器有限公司FZ102微型植物試樣粉碎機；太倉市科教器材廠HZ-8802S水浴恒溫振蕩器。

1.2玉米秸稈的NaOH預處理

稱取一定量粉碎后的玉米秸稈，按1：8的固液比（W/V）加入質(zhì)量濃度為2%（W/V）的NaOH溶液，攪拌均勻，分別在60、80、105℃下處理1 h，反應(yīng)結(jié)束后抽濾，殘渣水洗至中性，取樣測含水量及進行主要成分（纖維素、半纖維素和木質(zhì)素）分析。

1.3掃描電鏡分析

將NaOH預處理前后的玉米秸稈樣品分別烘干、粉碎、過篩，用導電雙面膠帶固定在樣品臺上，采用Hitachi S-4800掃描電子顯微鏡進行分析，觀察玉米秸稈內(nèi)部纖維素束的微觀結(jié)構(gòu)形態(tài)變化。

1.4X射線衍射光譜分析

NaOH預處理前后的玉米秸稈樣品烘干、粉碎，過200目篩，采用Shimadzu XRD-6000 X射線衍射儀對樣品進行分析，操作條件為：Cu靶，電壓40 kV，電流30 mA，掃描范圍10°～50°，掃描速度6°·min-1。利用MID Jade 5.0軟件，使用分峰擬合法分析并計算纖維素的結(jié)晶度（CrI）和結(jié)晶峰I002/I101比例（圖1）［17］。

1.5紅外光譜分析

NaOH預處理前后的玉米秸稈樣品烘干、粉碎后取少量，加入約為樣品質(zhì)量100倍的KBr于瑪瑙研缽，混合研磨后壓片，采用Shimadzu IRPrestige-21傅里葉變換紅外光譜儀進行分析。

1.6玉米秸稈的酶水解

酶水解在250mL三角瓶中進行，以NaOH預處理前后的玉米秸稈為底物，底物濃度為80 g·L-1，用0.05 mol·L-1檸檬酸緩沖液調(diào)節(jié)pH值為4.8，按20 FPU·g-1底物的用量加入CellicCTec2復合纖維素酶，反應(yīng)混合物總體積為100 mL，在50℃條件下振蕩水解，水浴恒溫振蕩器轉(zhuǎn)速為120 r·min-1，定時取樣，離心，測定上清液中還原糖含量。酶解得率（Y）按下式計算：

式中：m為上清液中還原糖總量，g；m1為底物中纖維素質(zhì)量，g；m2為底物中半纖維素質(zhì)量，g。

圖1　纖維素的X射線衍射圖譜Figure 1 X-ray diffraction pattern of cellulose

1.7分析方法

1.7.1纖維原料成分分析

玉米秸稈原料及NaOH預處理后纖維殘渣中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等成分含量按文獻［18］所述方法進行分析。

1.7.2酶活力測定

濾紙酶活力（Filter paper activity，F(xiàn)PA）和纖維二糖酶活力（Cellbiase，CB）按照IUPAC推薦的國際標準方法測定［19］。一個濾紙酶活力國際單位（FPU）等于酶促反應(yīng)中每分鐘生成1 μmol葡萄糖（以還原糖計，DNS法測定）的酶量；一個纖維二糖酶活力國際單位（CBU）等于標準反應(yīng)條件下每分鐘生成2 μmol葡萄糖（葡萄糖試劑盒測定）的酶量。

1.7.3總還原糖的測定

采用DNS（3，5-二硝基水楊酸）法測定［19］。

2　結(jié)果與討論

2.1NaOH預處理前后玉米秸稈成分分析

NaOH預處理前后玉米秸稈的成分分析如表1所示?？梢钥闯?，玉米秸稈經(jīng)不同溫度堿液預處理后，纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的含量發(fā)生了明顯變化，隨著NaOH預處理溫度的升高，木質(zhì)素得以有效脫除，纖維素和半纖維素比例增加。前人研究發(fā)現(xiàn)，纖維原料中的木質(zhì)素對纖維素酶與底物的接觸形成立體阻礙，同時還能夠非特異性吸附纖維素酶，是阻礙纖維原料酶解過程進行的重要因素［20］。表1顯示，玉米秸稈經(jīng)105℃堿液預處理后，木質(zhì)素百分含量由19.3%降低至5.9%，堿法預處理有利于改善玉米秸稈的酶水解。105℃預處理前后，纖維素百分含量由38.7%升高至66.2%，半纖維素百分含量由21.7%升高至25.1%。纖維素百分含量升高了1.7倍，而半纖維素百分含量僅升高1.2倍，表明在堿處理過程中半纖維素有部分損失。

2.2掃描電鏡分析

NaOH預處理前后玉米秸稈樣品的掃描電鏡圖像如圖2所示?？梢钥闯?，未處理的玉米秸稈樣品微觀上呈纖維束狀結(jié)構(gòu)，放大觀察可以看出其表面粗糙，表明附著在纖維細胞上的非纖維雜質(zhì)較多，可能包括粘結(jié)物（木質(zhì)素、半纖維素、膠類物質(zhì)）、蠟質(zhì)層、灰分、有機溶劑抽提物、薄壁細胞等；經(jīng)60℃NaOH處理的玉米秸稈掃描電鏡圖像顯示，樣品表面的粗糙程度有所改善，這是由于纖維細胞表面雜質(zhì)部分溶解于堿液并被除去所致；隨著堿處理溫度升高至80℃，纖維細胞表面雜質(zhì)在堿液中的溶解性增強，呈現(xiàn)出一定的流動狀態(tài)，較多的非纖維雜質(zhì)被除去，部分雜質(zhì)返吸附在纖維細胞表面，形成纖維表面的沉淀物；經(jīng)105℃NaOH處理后，纖維細胞表面較為光滑，紋孔較為均勻地暴露在細胞表面。可以推斷，隨著預處理條件愈加劇烈，堿水解的潤脹作用對原料形態(tài)產(chǎn)生破壞力亦愈大，纖維胞間層的非纖維雜質(zhì)基本被除去，纖維束狀結(jié)構(gòu)變得更為疏松，更有利于預處理后的纖維原料進行酶水解。然而，紋孔的暴露會使得纖維細胞中的半纖維素通過紋孔流失，從而降低玉米秸稈向可發(fā)酵糖轉(zhuǎn)化的利用效率。陳尚钘等［21］利用掃描電鏡觀察了蒸汽爆破預處理前后玉米秸稈的纖維結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)爆破處理后的纖維呈現(xiàn)分絲和細纖維化現(xiàn)象；Zhao等［22］對NaOH/尿素低溫預處理前后的云杉木屑進行掃描電鏡觀察，同樣發(fā)現(xiàn)預處理后的云杉木屑纖維束結(jié)構(gòu)變得松散。可見，不同的預處理方法對木質(zhì)纖維原料的纖維束結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的破壞作用程度不等。

表1　NaOH預處理前后玉米秸稈的成分分析（絕干重計，%）Table 1 Composition of raw and NaOH-pretreated corn stover samples（dry based，%）

圖2　NaOH預處理前后玉米秸稈電鏡掃描圖Figure 2 Scanning electron micrographs of raw and NaOH-pretreated corn stover samples

2.3X射線衍射分析

纖維素是由D-吡喃葡萄糖以β-1，4糖苷鍵連接而成的高聚物，根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)排列是否緊密和規(guī)則，將纖維素分為結(jié)晶區(qū)和無定形區(qū)，纖維素的結(jié)晶度是指結(jié)晶區(qū)占纖維素整體的百分比，反映了纖維素聚集時形成結(jié)晶的程度［17］。

不同溫度NaOH預處理前后，玉米秸稈經(jīng)X射線衍射圖譜基本相似（圖3）。根據(jù)分峰擬合法分析，未處理玉米秸稈纖維素的結(jié)晶度為52.8%，經(jīng)過NaOH預處理后纖維素的結(jié)晶度均有所升高，且隨著預處理溫度的升高，纖維素的結(jié)晶度逐漸增大（表2）。這是因為高溫NaOH溶液處理脫除了原料中的木質(zhì)素和部分半纖維素，同時纖維素的無定形區(qū)受到堿液的潤脹作用被破壞，使得結(jié)晶區(qū)的比例增加所致。預處理溫度由80℃升至105℃，結(jié)晶度的增加放緩。由表2可知，對于未處理的玉米秸稈原料，纖維素結(jié)晶區(qū)002和101晶面衍射峰強度比例（I002/I101）為1.845，隨著預處理溫度的升高，該比例逐漸降低，但105℃預處理與80℃預處理的物料相比，I002/I101比值略有回升，可見不同溫度堿預處理使得纖維素結(jié)晶結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定變化。Victor等［23］對松果進行堿法預處理，預處理前后樣品的X射線衍射圖譜與本文圖3所示形狀基本一致，但預處理前后樣品的結(jié)晶度和I002/I101具體數(shù)值并未給出；鄭明霞等［16］對玉米秸稈采用NaOH常溫下堆漚處理，提取預處理前后樣品中的纖維素進行X射線衍射分析，利用Segal公式計算纖維素結(jié)晶度，計算方法與本文采用的分峰擬合法不同，但同樣發(fā)現(xiàn)經(jīng)過堿處理后纖維素的結(jié)晶度有所升高。

2.4紅外光譜分析

圖3　NaOH預處理前后玉米秸稈X射線衍射圖譜Figure 3 X-ray diffraction spectra of raw and NaOH-pretreated corn stover samples

表2　NaOH預處理前后玉米秸稈X射線衍射圖譜分析Table 2 X-ray diffraction spectrum analysis of raw and NaOH-pretreated corn stover samples

采用傅里葉變換紅外光譜對NaOH預處理前后玉米秸稈進行分析，結(jié)果見圖4。對于木質(zhì)纖維原料，波數(shù)3420 cm-1為纖維素分子內(nèi)形成氫鍵的羥基伸縮振動，1431、1164 cm-1為纖維素的特征峰，1736 cm-1為半纖維素的特征峰，1600、1510 cm-1為木質(zhì)素的特征峰［16，21］。由圖4可知，NaOH預處理前后玉米秸稈的紅外圖譜形狀較為相似，差別主要在于某些特征峰吸收強度的變化。與未處理樣品相比，60℃堿液預處理后，3420 cm-1處吸收峰強度明顯減弱，表明堿處理導致纖維素分子內(nèi)形成的氫鍵部分斷裂，使得纖維素內(nèi)聚力減小，纖維素發(fā)生潤脹和溶解，改善了預處理后原料的酶水解性能，然而，隨著預處理溫度升高，3420 cm-1處吸收峰強度逐漸回升，表明纖維素分子內(nèi)氫鍵重新形成，纖維素的潤脹程度逐漸降低，可能由于纖維素結(jié)晶度的增加所致；1431、1164 cm-1處吸收峰在不同溫度NaOH預處理前后變化不大，表明纖維素結(jié)構(gòu)經(jīng)堿處理后差異不大。與未處理樣品的紅外光譜相比，玉米秸稈經(jīng)NaOH預處理后1736 cm-1處半纖維素特征吸收峰強度有所減弱，但特征峰仍明顯存在，可見半纖維素在堿處理過程中雖有損失，但仍然得到一定程度保留；NaOH預處理后1600、1510 cm-1處木質(zhì)素的特征峰基本消失，說明經(jīng)過堿處理后玉米秸稈中的木質(zhì)素結(jié)構(gòu)受到較大破壞，得以有效脫除。陳尚钘等［21］對蒸汽爆破預處理前后玉米秸稈進行紅外光譜分析，發(fā)現(xiàn)蒸汽爆破處理后半纖維素的特征峰基本消失，而木質(zhì)素的特征峰變化并不明顯，說明半纖維素易受到蒸汽爆破處理的破壞而發(fā)生降解，而木質(zhì)素受到的破壞程度較小，紅外光譜圖分析表明，蒸汽爆破處理和堿法預處理對玉米秸稈的作用機理存在較大差異。

圖4　NaOH預處理前后玉米秸稈的紅外光譜圖Figure 4 Infrared spectra of raw and NaOH-pretreated corn stover samples

2.5NaOH預處理對玉米秸稈酶解效率的影響

以NaOH預處理前后的玉米秸稈為底物，加入纖維素酶進行酶水解，底物酶解得率隨時間變化的趨勢如圖5所示?？梢钥闯觯搭A處理玉米秸稈的酶解得率較低，60 h酶解得率僅為11.1%，而NaOH預處理后玉米秸稈的酶解得率顯著增加，經(jīng)60、80℃和105℃NaOH預處理后玉米秸稈60 h的酶解得率分別為67.1%、71.4%和64.4%。預處理前后玉米秸稈纖維結(jié)構(gòu)表征闡述了酶解得率變化的機制：未預處理玉米秸稈具有致密復雜的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，阻礙了纖維素酶與底物的接觸，因此酶解效率很低；堿處理能夠有效脫除原料中的木質(zhì)素，解除其對纖維素酶的空間位阻作用，引起纖維原料潤脹，纖維束結(jié)構(gòu)變得松散，增加了纖維素酶與底物的接觸面積，從而提高了酶解效率。預處理溫度中以80℃NaOH預處理酶解得率最高，105℃預處理酶解得率最低，可能是因為預處理溫度過高導致纖維素結(jié)晶度升高，不利于纖維素酶與底物的接觸；同時，高溫處理使纖維表面紋孔充分暴露，使原料中半纖維素損失較高，從而降低了酶水解液中戊糖含量，導致酶解得率偏低。姚曉琰［15］和Nlewem［24］等的研究均發(fā)現(xiàn)，纖維原料堿法預處理過程中反應(yīng)強度的增加能夠提高木質(zhì)素的脫除率，同時也造成更多的纖維素和半纖維素損失，導致總糖得率下降?？梢妼τ衩捉斩挼膲A法預處理并非反應(yīng)條件越劇烈預處理效果越好，堿處理過程適度降低反應(yīng)強度，有利于己糖戊糖同步獲取，提高酶解效率。

圖5　NaOH預處理前后玉米秸稈酶水解的時間進程Figure 5 Time course of enzymatic hydrolysis of raw and NaOH-pretreated corn stover samples

3　結(jié)論

（1）稀堿預處理技術(shù)能夠充分改變玉米秸稈化學組成和結(jié)構(gòu)特性。玉米秸稈經(jīng)稀堿預處理后，木質(zhì)素和非纖維雜質(zhì)被有效脫除，纖維素和半纖維素的比例增加；纖維素結(jié)晶度增加，纖維原料潤脹，纖維束狀結(jié)構(gòu)疏松。

（2）經(jīng)稀NaOH溶液80℃預處理1h后，玉米秸稈60h的酶解得率達到71.4%，較未處理原料提高了5.4倍，堿預處理溫度進一步升高，酶解得率反而降低。80℃為玉米秸稈NaOH預處理的適宜溫度。

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Effect of NaOH pretreatments on cellulosic structure and enzymatic hydrolysis of corn stover

ZHAO Jing1，ZHANG Fu-rong1，CHEN Ming2*，XU Chen1，QUAN Chun-shan1，F(xiàn)AN Sheng-di1
（1.College of Life Science，Dalian Nationalities University，Key Laboratory of Biochemical Engineering of State Ethnic Affairs Commission-Ministry of Education，Dalian 116600，China；2.School of Biological Engineering，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034，China）

Corn stover biomass is an important source of bioenergy.However，lignin in corn stover profoundly reduces its enzymatic degradation.Here the influences of sodium hydroxide pretreatments under different temperatures（60℃，80℃and 105℃）on cellulosic structure characteristics and enzymatic hydrolysis yields of corn stover were investigated.The cellulosic structures of raw and alkali-pretreated corn stover were characterized using Scanning Electron Microscopy（SEM），X-ray Diffractometer（XRD）and Fourier Transform Infrared Spectrometer（FTIR）.Results showed that alkaline pretreatments of corn stover effectively removed lignin，and increased the ratios of cellulose and hemicellulose and the crystallinity of cellulose，resulting in more porous cellulosic structure.After pretreatments with dilute NaOH solution under 80℃for 1 h，the crystallinity of cellulose of corn stover residues reached to 63.7%and the yield of enzymatic hydrolysis to 71.4%after 60 h.High pretreatment temperature caused exposure of pits on fiber surface and reformation of hydrogen bonds in cellulose molecules，causing further losses of hemicellulose，reduction of cellulose swelling degree and decrease of enzymatic hydrolysis yield. The present findings suggest that alkaline pretreatment under 80℃would be the optimum condition for improving the structural characteristics and facilitating the conversion to saccharides from cellulose.

corn stover；NaOH pretreatment；chemical composition；cellulosic structure；enzymatic hydrolysis

X712

A

1672-2043（2016）07-1407-06

10.11654/jaes.2016.07.025

2015-12-14

遼寧省自然科學基金項目（2014026011）；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費項目（DC201502020407）

趙晶（1982—），女，博士，講師，從事農(nóng)林廢棄物處理及資源化研究。E-mail：zhaojing@dlnu.edu.cn

陳明E-mail：chenming@dlpu.edu.cn