脂肪酶Candida sp. 99-125催化羥基酸甲酯縮聚合成脂肪族聚酯

孫 芹, 方 正, 郭 凱

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脂肪酶99-125催化羥基酸甲酯縮聚合成脂肪族聚酯

孫 芹, 方 正, 郭 凱

(南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院, 江蘇 南京 211816)

采用游離脂肪酶99-125為催化劑，無(wú)溶劑體系中成功地將幾種羥基酸酯轉(zhuǎn)化為脂肪族聚酯。選取單體6-羥基己酸甲酯作為縮聚反應(yīng)模板體系, 考察了包括酶量、單體純度、溫度和表面活性劑等條件對(duì)反應(yīng)的影響。結(jié)果表明,純度大于 95% 的單體即可在無(wú)溶劑條件下合成脂肪酶族聚酯。吐溫40和吐溫80有使分子量分布變窄和提高重均分子量的能力。脂肪酶催化劑重復(fù)利用能力優(yōu)異，經(jīng) 5 批次反應(yīng)后, 其相對(duì)活性保持在 90% 以上。在最優(yōu)條件下，脂肪酶對(duì)長(zhǎng)鏈單體表現(xiàn)出很高的選擇性。通過(guò)改變單體的碳鏈長(zhǎng)度，可使脂肪族聚酯的重均分子量從3200到10000。

脂肪酶99-125；6-羥基己酸甲酯；縮聚；無(wú)溶劑

1 前 言

脂肪族聚酯(PHA)是一種可進(jìn)行多種形式生物降解并具有良好的生物相容性的高聚物，因此它有著廣泛地應(yīng)用價(jià)值，尤其是在醫(yī)藥和環(huán)保方面[1,2]。傳統(tǒng)的脂肪族聚酯的合成方法通常采用Al、Zn 和稀土金屬的氧化物或有機(jī)化合物為催化劑進(jìn)行合成[3,4]，所以在合成出的聚合物中容易存在殘留的有毒金屬化合物。近年來(lái)，人們?cè)絹?lái)越關(guān)注用酶催化合成脂肪族聚酯。酶法是一種新型的環(huán)境友好的綠色化學(xué)技術(shù)，且具有很多獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，如溫和的反應(yīng)條件、良好的回收能力，高區(qū)域選擇性[5,6]。聚己內(nèi)酯(PCL)是一種脂肪族直鏈聚酯，由于其單體簡(jiǎn)單易得，常被人們當(dāng)作模板反應(yīng)進(jìn)行研究。然而，用酶法催化己內(nèi)酯開環(huán)聚合仍有一些局限性，如豬胰脂酶(PPL)催化-己內(nèi)酯開環(huán)聚合需要的反應(yīng)96~120 h[7]。

實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)脂肪酶99-125能夠催化-己內(nèi)酯開環(huán)聚合[8]，但是所需的反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)，且分子量分布較寬(w/n= 2.2)。作者曾用該脂肪酶催化長(zhǎng)鏈的油酸和烷基醇在無(wú)溶劑體系下進(jìn)行酯化，反應(yīng)效果較好[9]。于是可認(rèn)為該酶對(duì)長(zhǎng)鏈線型底物親和性較好，繼而考慮用它催化長(zhǎng)鏈線型羥基酸類單體進(jìn)行縮聚。但是反應(yīng)中不斷產(chǎn)生的水需要高溫或高壓等極其嚴(yán)格的反應(yīng)條件才能除去。希望尋求一種簡(jiǎn)單易行的反應(yīng)方式來(lái)考察脂肪酶99-125的催化能力。羥基酸酯，其重復(fù)單元與羥基酸相同，僅以甲氧基將端羧基封端，既具備了可降解的性能，還表現(xiàn)出更高的熱穩(wěn)定性，適當(dāng)調(diào)節(jié)其相對(duì)分子質(zhì)量，可以改變力學(xué)性能，使其適用于不同醫(yī)療領(lǐng)域，具有廣泛的應(yīng)用前景[10]。而用脂肪酶99-125催化長(zhǎng)鏈線型羥基酸甲酯合成脂肪族直鏈聚酯的的反應(yīng)并未有過(guò)相關(guān)報(bào)道。

酶催化羥基酸甲酯聚合反應(yīng)被認(rèn)為是先進(jìn)行快速地酯交換(Scheme 1)，其次是中間聚合物分子量增加，最后緩慢聚合達(dá)到最大分子量[11,12]。

本文報(bào)道了在無(wú)溶劑體系下采用脂肪酶99-125催化羥基酸甲酯聚合(Scheme 2)。以6-羥基己酸甲酯為模板考察了酶量、溫度、反應(yīng)時(shí)間和表面活性劑等反應(yīng)條件的影響?？疾觳煌兼滈L(zhǎng)度的單體，發(fā)現(xiàn)隨著碳鏈的增長(zhǎng)，反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率提高。單體15-羥基十五烷酸甲酯在最優(yōu)條件下反應(yīng)24 h，聚合物分子量就可達(dá)到10000 (w)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 酶和試劑

2-羥基乙酸甲酯，-戊內(nèi)酯，-己內(nèi)酯，10-羥基癸酸甲酯，環(huán)十五內(nèi)酯、三乙胺和甲醇鈉等試劑都是安耐吉的。脂肪酶99-125(酶活：10000 U×g-1)由北京化工大學(xué)譚天偉課題組提供。

其他所有的試劑都是分析純的。

2.2 酶催化反應(yīng)過(guò)程

將0.1 g脂肪酶99-125，1.0 g 6-羥基己酸甲酯加入到三口圓底燒瓶中，液面下通N2，攪拌反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，得到的混合物加入二氯甲烷溶解后過(guò)濾，濾液加入冷甲醇純化，得到白色固體PHA。濾渣為脂肪酶99-125，可重復(fù)使用[13]。

2.3 表征

單體的純度由氣相分析：安捷倫氣相色譜儀7890A；氫火焰離子檢測(cè)器。

單體結(jié)構(gòu)分析通過(guò)核磁與質(zhì)譜。采用Bruker AV-400 型核磁共振儀進(jìn)行1H-NMR譜分析，d-氯仿為溶劑。質(zhì)譜采用Agilent 6520 Q-TOF LC/MS。

產(chǎn)物的重均分子量(w)由SEC獲得，核磁輔證，分子量分布(w/n或)通過(guò)SEC獲得。通過(guò)端基分析法和凝膠過(guò)濾色譜法測(cè)得，凝膠滲透色譜采用 Water201 型SEC，THF 為流動(dòng)相，流速1.0 mL×min-1。聚苯乙烯為標(biāo)樣。待測(cè)聚合物預(yù)先在25℃下減壓干燥24 h。

產(chǎn)物的產(chǎn)率通過(guò)稱重計(jì)算得到，公式：

產(chǎn)率(%)=稱得產(chǎn)物(g)÷理論產(chǎn)物(g)×100%，理論產(chǎn)物(g)=114×底物量(g)÷146

3 結(jié)果與分析

3.1 單體的制備

5-羥基戊酸甲酯(99%)是通過(guò)δ-戊內(nèi)酯開環(huán)得到[14]。1H-NMR(400 MHz, CDCl3)：H 3.64 (3H, s, OCH3), 3.61 (2H, t,6.4 Hz, CH2OH), 2.33 (2H, t,7.2 Hz, CH2COOCH3), 2.06(1H,S,OH), 1.72~1.65(2H, m, CH2CH2OH), 1.60~1.53 (2H,m,CH2CHCOOCH3); MS:155.0673(+Na)。6-羥基己酸甲酯(純度>95%)是通過(guò)ε-己內(nèi)酯開環(huán)制得[15]。1H-NMR(400 MHz, CDCl3)：H 3.64 (3H, s, OCH3), 3.61 (2H, t,6.4 Hz, CH2OH), 2.30 (2H, t,7.2 Hz, CH2COOCH3), 1.80(1H, S, OH), 1.67~1.60 (2H, m, CH2CH2COOCH3), 1.60~1.52(2H, m, CH2CH2OH), 1.35~1.41(2H, m, CH2CH2CH2OH ); MS:169.0827(+Na)。這兩個(gè)單體的純化方法主要通過(guò)減壓蒸餾和硅膠柱層析。15-羥基十五烷酸甲酯是通過(guò)環(huán)十五內(nèi)酯開環(huán)制得，單體的純化方法為乙醚/正己烷=1/5雙溶劑重結(jié)晶[16]。1H-NMR(400 MHz, CDCl3)：H 3.66 (3H, s, OCH3), 3.63 (2H, t,6.6 Hz, CH2OH), 2.30 (2H, t,7.2 Hz, CH2COOCH3), 1.63~1.52 (4H, m, CH2CH2OH and CH2CH2COOCH3), 1.31~1.23 (20H, m, CH2C4~C13);MS: 295.2254(+Na)。

3.2 優(yōu)化反應(yīng)條件

3.2.1 催化劑用量的影響

在70℃、無(wú)溶劑體系下，考察脂肪酶用量對(duì)6-羥基己酸甲酯縮聚反應(yīng)效果的影響。如表1 所示，考察了5%(wt)、7%(wt)、10%(wt)和12%(wt)四種酶濃度下縮聚的效果，同時(shí)做了空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)。可以發(fā)現(xiàn)隨著催化劑用量的增加，重均分子量和產(chǎn)率也都在增加。當(dāng)脂肪酶濃度超過(guò)10%(wt)時(shí)，產(chǎn)率不再提高，因?yàn)閷?duì)于有限的底物來(lái)說(shuō)，多余的脂肪酶并不能發(fā)揮催化作用[17]。綜合考慮，選用10%(wt)脂肪酶用量為最佳用量。

表1 脂肪酶Candida sp.99-125催化量的影響