一種新型內(nèi)切-β-葡聚糖酶基因在里氏木霉中的重組與表達(dá)

夏 穎, 趙 杰, 夏黎明

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一種新型內(nèi)切--葡聚糖酶基因在里氏木霉中的重組與表達(dá)

夏 穎, 趙 杰, 夏黎明

(浙江大學(xué)生物質(zhì)化工教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 浙江大學(xué) 化學(xué)工程與生物工程學(xué)院, 浙江 杭州 310027)

刺糙青霉 () 可產(chǎn)生一種耐熱、耐堿的新型內(nèi)切--葡聚糖酶 (1)，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。鑒于野生型刺糙青霉的產(chǎn)酶水平低，將該菌的內(nèi)切--葡聚糖酶基因經(jīng)過密碼子優(yōu)化后，在里氏木霉()中進(jìn)行重組與表達(dá)，采用里氏木霉強(qiáng)啟動(dòng)子Pcbh1 (纖維二糖水解酶I) 及其信號肽，以pCAMBIA1300為載體骨架構(gòu)建重組質(zhì)粒pCB-PET，并采用根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化技術(shù)將重組質(zhì)粒pCB-PET導(dǎo)入里氏木霉的分生孢子中，在潮霉素抗性平板上篩選獲得5個(gè)優(yōu)良的重組轉(zhuǎn)化子。將5個(gè)轉(zhuǎn)化子重復(fù)傳代培養(yǎng)10個(gè)批次后，分別提取染色體DNA進(jìn)行PCR驗(yàn)證，均可檢測到目的基因1n (密碼子優(yōu)化后的1) 條帶，說明該基因已穩(wěn)定地整合到里氏木霉基因組中。采用SDS-PAGE蛋白電泳對轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)液進(jìn)行檢測，獲得了與目的基因表達(dá)產(chǎn)物相符的蛋白條帶 (約41 kDa)，表明1n已在重組里氏木霉中成功實(shí)現(xiàn)了胞外表達(dá)。重組轉(zhuǎn)化子在30℃，搖瓶轉(zhuǎn)速200 r×min-1條件下培養(yǎng)48 h，取發(fā)酵上清液在pH8.0，60℃條件下，測得內(nèi)切--葡聚糖酶活力為382.6 U×mL-1，是出發(fā)菌株的22.5倍。酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果表明：該酶耐熱性能較好，在70℃以下性能穩(wěn)定，其最適催化溫度為60℃；該酶在pH 5.0~10.5穩(wěn)定性較好、具有明顯的催化活性，其最適pH為8.0，屬于堿性纖維素酶。從而成功地實(shí)現(xiàn)了刺糙青霉內(nèi)切--葡聚糖酶基因在里氏木霉中的重組與胞外表達(dá)，有關(guān)研究結(jié)果在里氏木霉纖維素酶的定向進(jìn)化及其工業(yè)化應(yīng)用中具有重要的促進(jìn)作用。

內(nèi)切--葡聚糖酶; 堿性纖維素酶; 里氏木霉; 基因重組; 表達(dá)

1 前 言

內(nèi)切--葡聚糖酶是纖維素酶的主要組成之一，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值[1]。里氏木霉()是生產(chǎn)纖維素酶的常用菌種，由該菌生產(chǎn)的內(nèi)切--葡聚糖酶適用于酸性反應(yīng)體系，其最適作用pH為4.8，當(dāng)反應(yīng)溫度高于50℃ 時(shí)酶活力迅速下降[2]。這一特性大大限制了該酶在棉織物水洗整理、廢紙脫油墨、制漿造紙、含酶洗潔劑以及環(huán)保等領(lǐng)域中的廣泛應(yīng)用[3~6]。

由刺糙青霉()所產(chǎn)的內(nèi)切--葡聚糖酶的pH作用范圍廣，且熱穩(wěn)定性好[7,8]。但野生型刺糙青霉的產(chǎn)酶水平低，發(fā)酵成本高，不適于工業(yè)化生產(chǎn)[9]。近年來，采用里氏木霉生產(chǎn)異源重組蛋白方面的研究方興未艾，利用里氏木霉的強(qiáng)啟動(dòng)子Pcbh1 (纖維二糖水解酶I啟動(dòng)子) 及信號肽，可以實(shí)現(xiàn)外源基因的高效表達(dá)和胞外分泌[10]，絲狀真菌作為外源基因表達(dá)的宿主系統(tǒng)，還可以簡化表達(dá)產(chǎn)物的分離提取，這方面的研究工作具有良好的發(fā)展前景[11,12]。

本文將刺糙青霉內(nèi)切--葡聚糖酶基因經(jīng)過密碼子優(yōu)化后，插入里氏木霉強(qiáng)啟動(dòng)子Pcbh1(及其信號肽)和終止子Tcbh1之間，并以pCAMBIA1300為載體構(gòu)建重組質(zhì)粒，進(jìn)一步通過根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化技術(shù)，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入里氏木霉的分生孢子中，并成功實(shí)現(xiàn)了目的基因的高效表達(dá)與胞外分泌。因此本研究對于新型纖維素酶制劑的研究開發(fā)及其工業(yè)化應(yīng)用具有重要的促進(jìn)作用。

2 材料與方法

2.1 菌株和質(zhì)粒

2.1.1 菌株

大腸桿菌 (DH5α)、里氏木霉 (ZU-02[13])、根癌農(nóng)桿菌 (AGL-1) 均為本實(shí)驗(yàn)室保存菌株。

2.1.2 質(zhì)粒

pMD18-T simple vector和pUC18均購自Takara公司；pDESTR (含潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，Genbank：AB218275.1) 和pCAMBIA1300均為實(shí)驗(yàn)室保存質(zhì)粒。

2.2 培養(yǎng)基

2.2.1 種子培養(yǎng)基

(g×L-1) 葡萄糖15，酵母抽提物 20，(NH4)2SO42.5，KH2PO46，MgSO40.8，CaC121.0。

2.2.2 篩選培養(yǎng)基

(g×L-1) 馬鈴薯(去皮）200，葡萄糖20，瓊脂20，潮霉素B 0.1，頭孢霉素0.2。

2.2.3 復(fù)篩培養(yǎng)基

(g×L-1) 羧甲基纖維素鈉20， (NH4)2SO45，KH2PO415，MgSO40.8，CaC120.6，F(xiàn)eSO4×7H2O 0.005，MnSO4×H2O 0.0016，ZnSO4×7H2O 0.0014，CoCl2×6H2O 0.0037，潮霉素B 0.1，瓊脂粉 18。

2.2.4 產(chǎn)酶培養(yǎng)基

(g×L-1) 乳糖40，蛋白胨5，(NH4)2SO42.8，KH2PO44，MgSO4×7H2O 0.6，CaCl20.6，F(xiàn)eSO4×7H2O 0.005，MnSO4×H2O 0.0016，ZnSO4×7H2O 0.0014，CoCl2×6H2O 0.0037。

2.3 目的基因1n的制備

從基因文庫中調(diào)取刺糙青霉內(nèi)切--葡聚糖酶1的基因序列 (GenBank: FJ998421)，在氨基酸序列不改變的前提下，根據(jù)里氏木霉的密碼子偏好，通過生物信息學(xué)軟件(DNA2.0 Tool)對1的基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，并在該序列的上下游分別引入限制性內(nèi)切酶I /I的切割位點(diǎn)，將密碼子優(yōu)化后的基因序列標(biāo)記為1n。采用ABI 3900型高通量DNA合成儀合成1n基因，并克隆至載體pMD18-T，構(gòu)建成pMD-E1質(zhì)粒 (圖1)。

以I和I分別雙酶切質(zhì)粒pUC18-PsT和pMD-E1，將1n基因片段以T4連接酶連接至pUC18-PsT信號肽和終止子之間，得到重組質(zhì)粒pUC18-PET。

以I和I分別雙酶切pCB-h和pUC18-PET，進(jìn)一步將含啟動(dòng)子和終止子的1n基因插入到pCB-h的多克隆位點(diǎn) (MCS) 中，得到重組質(zhì)粒pCB-PET。質(zhì)粒pCB-PET含潮霉素篩選標(biāo)記和1n基因，可用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化。

2.5 1n基因序列的PCR檢測

根據(jù)1n基因序列設(shè)計(jì)PCR上游引物(5' 3')：CCTCCTGCTTCCCGCTCC；下游引物(5' 3')：CAGGCACTGGGAGTAGTAGT。

PCR反應(yīng)條件：94℃ 預(yù)變性10 min，30 次擴(kuò)增循環(huán) (94℃×1 min、52℃×1 min、72℃×1 min 30 s)，72℃ 延伸 10 min。

2.6 根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo) (-mediated transformation, AMT) 轉(zhuǎn)化里氏木霉

將重組質(zhì)粒pCB-PET用凍融法轉(zhuǎn)入根瘤農(nóng)桿菌AGL-1，具體操作步驟見參考文獻(xiàn)[14]。

2.7 里氏木霉基因組DNA的提取

取重組里氏木霉菌體培養(yǎng)液4000 r×min-1離心10 min收集菌體，用無菌水反復(fù)洗滌，離心并干燥。用液氮快速研磨至粉狀，取100 mg菌絲粉末置于1.5 mL的離心管，加入400 μL的真菌基因組提取液 (50 mmol×L-1Tris-HCl；150 mmol×L-1NaCl；100 mmol×L-1EDTA) 震蕩混勻；加入50 μL 10% SDS，震蕩混勻后65℃水浴1 h；加入等體積的酚/氯仿/異戊醇 (25 : 24 : 1)，震蕩混勻后離心；取上層水相加入0.65倍體積的異丙醇，4℃ 沉淀30 min；離心棄上清，用70% 乙醇洗滌兩次，干燥后用適量無菌水溶解，加RNA酶(終濃度為0.1 μg×μL-1) 37℃處理1 h。

2.8 轉(zhuǎn)化子的復(fù)篩

用切割器分別在轉(zhuǎn)化子菌落上切取直徑為0.3 cm的菌塊，每個(gè)轉(zhuǎn)化子取3塊轉(zhuǎn)接到復(fù)篩平板培養(yǎng)基上，30℃ 培養(yǎng)2~3 d，定時(shí)觀察，記錄菌落生長直徑，從中選出生長速率快，菌落直徑大的轉(zhuǎn)化子。

2.9 重組轉(zhuǎn)化子產(chǎn)酶試驗(yàn)

將斜面菌種接種到液體種子培養(yǎng)基中，30℃，200 r×min-1搖瓶培養(yǎng)48 h后轉(zhuǎn)接至產(chǎn)酶培養(yǎng)基，250 mL搖瓶裝液量50 mL，接種量10% (v/v)，28℃，200 r×min-1振蕩培養(yǎng)[18]，定時(shí)取樣檢測上清液的內(nèi)切--葡聚糖酶活力。每個(gè)轉(zhuǎn)化子做三個(gè)平行搖瓶產(chǎn)酶實(shí)驗(yàn)。

2.10 SDS-PAGE蛋白電泳

將發(fā)酵液于10000~12000 r×min-1離心5 min，取上清液進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳。采用的聚丙烯酰胺濃度為12%，染色液為0.1%的考馬斯亮藍(lán)R-250，脫色液配方為甲醇:水:乙酸 (2:7:1)。

2.11 內(nèi)切--葡聚糖酶活力測定

以1% 羧甲基纖維素鈉 (CMC) 溶液為底物，加入0.5 mL適當(dāng)稀釋的酶液，于設(shè)定的溫度、pH值條件下反應(yīng)一定時(shí)間后，采用DNS法 (3,5-二硝基水楊酸法)[19]測定上清液中的還原糖。一個(gè)酶活力單位為標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下1 h內(nèi)生成1 mg還原糖所需的酶量，以U×mL-1表示。

2.12 酶液的最適反應(yīng)pH值及pH穩(wěn)定性測定

最適pH試驗(yàn)：用緩沖液配制不同pH (4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5和11.0) 的CMC底物溶液，取酶液分別測定不同pH條件下的內(nèi)切--葡聚糖酶活力，酶反應(yīng)溫度為60℃。

pH穩(wěn)定性試驗(yàn)：將酶液分別在pH值為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5和11.0，60℃條件下保溫60 min后，再在60℃、pH 8.0條件下測定內(nèi)切--葡聚糖酶活力。

2.13 酶液的最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性測定

最適溫度試驗(yàn)：將酶促反應(yīng)溫度設(shè)為30、35、40、45、50、55、60、65和70℃，分別測定試樣在pH 8.0時(shí)的內(nèi)切--葡聚糖酶活力。

溫度穩(wěn)定性試驗(yàn)：將酶液分別在溫度為30、35、40、45、50、55、60、65和70℃ 的水浴中，pH 8.0，保溫2 h后，再在60℃、pH 8.0條件下測定內(nèi)切--葡聚糖酶活力。

3 結(jié)果與討論

3.1 重組載體pCB-PET的驗(yàn)證分析

重組質(zhì)粒經(jīng)I單酶切獲得大小約為14.6 kb的條帶，經(jīng)I/I雙酶切分別得到4.2 kb和10.4 kb條帶 (圖2)，分別與1n基因表達(dá)盒 (Pcbh1+1n+Tcbh1)、pCB-PET載體的片段大小相符。

圖2 重組質(zhì)粒pCB-PET的酶切驗(yàn)證