半夏及其易混品的DNA分子鑒定

馮　圖，何　洋，阮培均

(1. 貴州工程應(yīng)用技術(shù)學(xué)院 生態(tài)工程學(xué)院，貴州 畢節(jié) 551700；2.四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用重點實驗室省部共建國家重點實驗室培育基地，成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 610075; 3. 成都中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610075；4. 畢節(jié)市中藥研究所，貴州 畢節(jié) 551700)

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半夏及其易混品的DNA分子鑒定

馮圖1*，何洋2,3，阮培均4

(1. 貴州工程應(yīng)用技術(shù)學(xué)院 生態(tài)工程學(xué)院，貴州 畢節(jié) 551700；2.四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用重點實驗室省部共建國家重點實驗室培育基地，成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 610075; 3. 成都中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610075；4. 畢節(jié)市中藥研究所，貴州 畢節(jié) 551700)

基于ITS、matK、trnL-trnF、rpl32-trnL和rps16序列對栽培半夏及其易混品開展DNA條形碼鑒別研究，結(jié)果表明：ITS、rps16序列可作為DNA條形碼用于半夏及其易混品的鑒別研究中，matK、trnL-trnF序列可作為天南星科不同屬間DNA條形碼或條形碼組合候選序列鑒別半夏及其鄰近屬植物，rpl32-trnL序列可作為鑒別半夏及其易混品的DNA條形碼候選序列。

DNA條形碼；半夏；易混品；鑒別

半夏(Pinelliaternata(Thunb.) Breit.)，為天南星科(Araceae)半夏屬植物，塊莖圓球形，直徑1-2 cm，具須根。半夏屬在全世界共有9種，中國均有分布，其中7種為中國特有種，中國東部為半夏屬植物全球多樣性中心[1-2]?！吨腥A人民共和國藥典》(2015版)收載半夏入藥，其來源為半夏的干燥塊莖，具有燥濕化痰，降逆止嘔，消痞散結(jié)之功效，入藥用于治療濕痰寒痰、咳喘痰多、痰飲眩悸、嘔吐反胃等[3]。半夏是一味常用大宗藥材，不僅供中醫(yī)臨床配方使用，也是多種中成藥的原料[4]，其使用量較大。然而，由于野生半夏遭到大量采挖且生態(tài)環(huán)境遭到破壞，野生半夏資源不斷減少，加之半夏在種植栽培過程中規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化不夠，半夏資源量和產(chǎn)量不斷減少，不能完全滿足藥材市場需要，正品半夏在藥材市場常出現(xiàn)同屬或同科偽品混用的現(xiàn)象[4-6]。由于與半夏塊莖的形態(tài)相似性，中藥材市場上半夏的混偽品主要有同屬植物虎掌(Pinelliapedatisecta)、滴水珠(Pinelliacordata)以及犁頭尖屬鞭檐犁頭尖(Typhoniumflagelliforme)、斑龍芋屬獨角蓮(Sauromatumgiganteum)、天南星屬一把傘南星(Arisaemaerubescens)[7]。

目前對半夏及其易混品的鑒別主要采用顯微鑒別、薄層層析、紫外光譜、HPLC等方法，但這些方法不同程度存在耗時較長、穩(wěn)定性不強、依賴主觀性或重復(fù)性差等缺點，不能快速、準(zhǔn)確地鑒別半夏及其易混品[6-7]。DNA barcoding (DNA條形碼)技術(shù)是基于物種在遺傳特性上的相對穩(wěn)定性，用一段或幾段標(biāo)準(zhǔn)DNA 序列作為分子標(biāo)記來快速、準(zhǔn)確地進行物種鑒別的技術(shù)，不受環(huán)境因素影響以及樣品形態(tài)和材料部位的限制，具有客觀、穩(wěn)定、重復(fù)性強的特點以及較強的通用性及實用性，對中藥材及其易混品的鑒別提供重要手段[7-8]。

本研究基于nrDNA ITS序列及葉綠體matK、rpl32-trnL、rps16、trnL-trnF序列對采自不同地區(qū)栽培半夏及其混偽品進行DNA條形碼鑒別研究，分析不同序列是否適宜對半夏及其易混品進行DNA條形碼鑒別，以期為半夏及其易混品的分子鑒別提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料來源

實驗材料來自貴州省畢節(jié)市不同地區(qū)栽培半夏植株，采集新鮮植株葉片材料后用硅膠快速干燥，經(jīng)四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院余巖副教授鑒定，材料及序列詳細(xì)信息見表1。

表1　樣品及序列信息

1.2研究方法

1.2.1DNA提取、片段擴增和測序采用2×CTAB法提取硅膠干燥植株材料總DNA[9]，分別選用ITS、matK、rpl32-trnL、rps16、trnL-trnF引物擴增序列，引物信息見表2。PCR擴增反應(yīng)采用50 μL反應(yīng)體系，擴增程序為94℃預(yù)變性3 min，94℃預(yù)變性1 min，48-55℃退火1 min，72℃延伸90 s(共30個循環(huán))，72℃延伸5 min后 10℃保存。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶清晰單一且片段大小正確的擴增產(chǎn)物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司進行雙向測序(見表2)。

1.2.2序列分析及處理根據(jù) Genbank中半夏屬植物及半夏易混品相應(yīng)序列進行建樹，建樹所用序列號及樣品編號詳見圖中物種名后括號內(nèi)。利用MEGA6.06[15]對序列進行比對后人工校正，構(gòu)建鄰接樹(neighbor-joining，NJ)，并通過10 000次重復(fù)bootstrap計算每個分支自展支持率，所有NJ嚴(yán)格一致樹均只保留50%以上自展支持率分枝。利用Genbank中blastn 功能比對所得測序序列，并利用DnaSP 5.0[16]對所擴增序列片段核苷酸多態(tài)性進行統(tǒng)計分析，分析結(jié)果見表3。

表2　序列擴增引物信息

表3　擴增序列分析信息

根據(jù)Ohi-Toma[17]等對天南星科植物系統(tǒng)發(fā)育的研究結(jié)果，建樹分析選取芋(Colocasia esculenta)相應(yīng)序列作為外類群，芋ITS、matK、rpl32-trnL、rps16、trnL-trnF序列號分別為：AY081000，AM920622，JN105690，JQ237159，AY555184。

2　結(jié)果與分析

2.1序列分析

本研究對采自畢節(jié)市不同地區(qū)的的栽培半夏植物樣品的核基因ITS片段及4個葉綠體DNA片段(matK、rpl32-trnL、rps16、trnL-trnF)進行了PCR擴增及測序，測序成功率為100%，共獲得30條序列。序列分析結(jié)果表明：ITS序列GC含量最高，達(dá)66.6%，rpl32-trnL序列GC含量最低，為24.6%；rps16序列核苷酸多樣性最高，為0.0050，matK序列核苷酸多樣性最低，為0.0007； rpl32-trnL序列中插入(缺失)堿基數(shù)最多，為13個，ITS序列中無插入(缺失)堿基；matK序列K2P(Kimura 2-parametyer)遺傳距離變化范圍最小，為0.0012，ITS、rps16序列K2P遺傳距離變化范圍最大，均為0.0046。

2.2半夏及其易混品不同序列遺傳距離分析

通過對半夏及其鄰近屬物種不同序列遺傳距離分析結(jié)果表明：半夏種內(nèi)ITS、matK、rpl32-trnL、rps16、trnL-trnF序列遺傳距離從0到0.0124不等，其中trnL-trnF序列遺傳距離為0。半夏屬內(nèi)物種trnL-trnF序列遺傳距離最小，遺傳距離變化范圍最大為ITS序列(表4)。半夏與天南星屬、犁頭尖屬、斑龍芋屬不同序列遺傳距離變化范圍均大于半夏種內(nèi)序列遺傳距離，部分物種因無相關(guān)序列，故未做比較。

表4　半夏及其鄰近屬物種不同序列遺傳距離分析

2.3半夏及其易混品不同序列建樹分析

基于ITS序列構(gòu)建半夏及其易混品NJ一致樹表明(圖1)，一把傘南星與半夏屬植物分別聚為一支，自展支持率均為100%，其中半夏聚為一支，與其他半夏屬植物分開，自展支持率達(dá)99%?；趓ps16序列的半夏及其易混品NJ一致樹表明(圖2)，半夏屬、天南星屬、斑龍芋屬植物分別聚為一支，所有半夏聚為一支，且自展支持率達(dá)64%。

圖1　基于ITS序列的半夏及其易混品NJ一致樹

圖2　基于rps16序列的半夏及其易混品NJ一致樹

利用matK序列構(gòu)建的半夏及其易混品NJ一致樹表明(圖3)，半夏屬植物、一把傘南星、獨角蓮、鞭檐犁頭尖分別聚為一支，且自展支持率均為95%以上。天南星屬植物聚為一支，自展支持率為99%.斑龍芋屬植物與犁頭尖屬植物聚為一支，自展支持率為60%，且在此分支內(nèi)斑龍芋屬植物與犁頭尖屬植物各自聚為一支，自展支持率分別為95%和99%。但在半夏屬植物分支內(nèi)，半夏與虎掌等其他半夏屬植物形成多個平行分支，未能完全鑒別開半夏與其他同屬植物。

利用matK序列構(gòu)建的半夏及其易混品NJ一致樹表明(圖3)，半夏屬植物、一把傘南星、獨角蓮、鞭檐犁頭尖分別聚為一支，且自展支持率均為95%以上。天南星屬植物聚為一支，自展支持率為99%.斑龍芋屬植物與犁頭尖屬植物聚為一支，自展支持率為60%，且在此分支內(nèi)斑龍芋屬植物與犁頭尖屬植物各自聚為一支，自展支持率分別為95%和99%。但在半夏屬植物分支內(nèi)，半夏與虎掌等其他半夏屬植物形成多個平行分支，未能完全鑒別開半夏與其他同屬植物。

利用trnL-trnF序列構(gòu)建的半夏及其易混品NJ一致樹表明(圖4)，半夏屬植物聚為一支，自展支持率達(dá)97%，但獨角蓮、一把傘南星、犁頭尖屬植物與半夏屬植物形成多個平行分支，未能區(qū)分開來。利用rpl32-trnL序列構(gòu)建的半夏NJ一致樹表明(圖5)，半夏屬內(nèi)不同半夏樣品能被有效鑒別開來且自展支持率較高，均大于60%。

圖4　基于trnL-trnF序列的半夏及其易混品NJ一致樹

圖5　基于rpl32-trnL序列的半夏樣品NJ一致樹

3　討論

生命條形碼聯(lián)盟植物工作組推薦使用PWG距離法(單獨計算每個物種的遺傳距離) 和構(gòu)建NJ 系統(tǒng)聚類樹(Tree-Building) 法，評估不同條形碼序列對物種的鑒別力。采用PWG距離法時，只有被鑒定物種種間最小的遺傳距離大于種內(nèi)最大的遺傳距離時才表示成功鑒定物種，采用系統(tǒng)聚類樹(Tree-Building)方法時，只有同一個物種的不同個體在構(gòu)建的NJ 系統(tǒng)樹上形成單系分支才表示成功鑒定物種[18-19]。

鄭司浩等[6]利用ITS、ITS2、psbA-trnH、rbcL和matK序列對半夏及其偽品一把傘南星進行了DNA條形碼鑒別研究，結(jié)果表明：matK和rbcL序列為鑒別半夏屬及其偽品的較理想條形碼組合。張雅琴等[7]采用ITS2 序列對中藥材半夏及其混偽品虎掌、獨角蓮、滴水珠、鞭檐犁頭尖、一把傘南星進行了DNA 條形碼鑒定研究，結(jié)果表明：ITS2 序列能準(zhǔn)確、穩(wěn)定鑒定中藥材半夏藥材及其混偽品。張樂容等[20]對中國半夏屬5種植物trnL-trnF序列進行了測序并構(gòu)建NJ樹，結(jié)果表明：半夏屬藥用植物物種分化不完全，序列進化不一致，其中虎掌和半夏屬其他物種間的遺傳差異較大。

本研究中經(jīng)分析表明，ITS、rps16序列種間最小的遺傳距離均大于種內(nèi)最大的遺傳距離(表4)，且在NJ樹中所有半夏聚為單系分支，自展支持率分別為99%和64%，表明ITS、rps16序列能作為DNA 條形碼成功鑒別半夏及其易混品。matK、trnL-trnF序列種間最小的遺傳距離均大于種內(nèi)最大的遺傳距離，在構(gòu)建的NJ樹中，它們未能成功鑒別半夏與其他同屬植物，但半夏屬植物形成的分支與天南星屬、斑龍芋屬、犁頭尖屬等分支明顯區(qū)別開來，自展支持率分別為99%和97%。成功鑒別半夏屬與其他屬植物。

理想的DNA條形碼應(yīng)具有可以區(qū)分物種的足夠變異和分化，種內(nèi)變異必須足夠小；應(yīng)有高度保守的引物設(shè)計區(qū)以便于設(shè)計通用引物；序列長度便于DNA提取和PCR擴增，尤其是對部分降解DNA的擴增[21]。目前國內(nèi)外學(xué)者對植物DNA條形碼開展了諸多研究，但很難發(fā)現(xiàn)一個DNA序列片段能區(qū)別同科或同屬所有物種。因此，學(xué)者根據(jù)不同的研究對象推薦不同的DNA 序列組合以準(zhǔn)確鑒別中藥材及其易混品。本研究結(jié)果表明，ITS、rps16序列可作為DNA條形碼用于半夏及其易混品的鑒別研究中，matK、trnL-trnF序列可作為天南星科不同屬間DNA條形碼或條形碼組合候選序列鑒別半夏及其鄰近屬植物，rpl32-trnL序列長度適中，有通用引物且易于擴增，可作為鑒別半夏及其易混品的DNA條形碼候選序列。但由于本次樣本量及Genbank中登錄rpl32-trnL序列偏少，有待擴大采樣數(shù)量后開展后續(xù)研究。

致謝：感謝四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院余巖副教授在樣品鑒定、數(shù)據(jù)處理及分析方面給予的幫助，感謝國家標(biāo)本平臺教學(xué)標(biāo)本子平臺(2005DKA21403-JK，http://mnh.scu.edu.cn)提供標(biāo)本比對參考圖片。

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Identification ofPinelliaternataand Adulterants Based on DNA Barcoding

FENGTu1,HEYang2,3,RUANPei-jun4

(1.GuizhouUniversityofEngineeringScience,SchoolofEcologicalEngineering,Bijie,Guizhou551700，China; 2.StateKeyLaboratoryBreedingBaseofSystematicResearch,DevelopmentandUtilizationofChineseMedicineResources,Co-fundedbySichuanProvinceandMOST,ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine,Chengdu,Sichuan610075,China;3.CollegeofMedicalTechnology,ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine,Chengdu,Sichuan610075,China;4.BijieInstitutionofTraditionalChineseMedicine,Bijie,Guizhou551700,China)

In the present study, DNA barcoding analysis was used to identifyPinelliaternategermplams and their adulterants based on ITS, matK, trnL-trnF, rpl32-trnL and rps16 sequences. The results showed that the ITS and rps16 sequences were suitable for the identification ofPinelliaternategermplasms and their adulterants, and the rpl32-trnL sequences could be the candidatebarcode sequences. The combination of matK and trnL-trnF sequences could be used to identify the germplasms ofPinellia, as well as their relatives of Araceae.

DNA Barcoding;Pinelliaternata; Adulterant; Identification

2016-02-01；

2016-03-16

貴州省教育廳自然科學(xué)研究項目“DNA條形碼技術(shù)在地道中藥材鑒定研究中的應(yīng)用”(黔教科(20090070)；國家科技支撐計劃“特色優(yōu)勢中藥材保種擴繁及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與質(zhì)量控制研究”(2015BAI05B03)；畢節(jié)學(xué)院高層次人才科研基金“烏蒙山區(qū)重要藥用植物資源調(diào)查、鑒別與質(zhì)量評價研究”(G2012009)；畢節(jié)學(xué)院自然科學(xué)研究項目“五種重要藥用植物的DNA指紋圖譜研究”(20092023)。

馮圖(1982-)，男，四川武勝人，博士，副教授，主要研究方向：植物學(xué)、生態(tài)學(xué)研究；E-mail: fengtu@gues.edu.cn。

Q949.95；S184

A

1008-0457(2016)02-0015-006國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2016.02.003