獼猴桃病原真菌拮抗菌篩選

何應紅， 錢一鑫， 康冀川*， 雷幫星

(1.貴州大學 生命科學學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學 西南藥用生物資源教育部工程研究中心，貴州 貴陽 550025 )

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·研究簡報·

獼猴桃病原真菌拮抗菌篩選

何應紅1,2， 錢一鑫2， 康冀川2*， 雷幫星2

(1.貴州大學 生命科學學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學 西南藥用生物資源教育部工程研究中心，貴州 貴陽 550025 )

為控制獼猴桃真菌病害，本研究使用平板對峙法，從34株青蒿內(nèi)生真菌中篩選出對5種常見獼猴桃病原真菌(Botryosphaeriadothidea、Collectotrichumsp.、Monilinialaxa、phomasp.、Alternariaalternata)具有廣譜高效拮抗作用的菌株，并采用菌絲生長速率法檢測了拮抗菌株發(fā)酵液及其發(fā)酵液粗提物對獼猴桃病原真菌的抑菌活性。結果表明：在平板對峙試驗中，21號青蒿內(nèi)生真菌具有較好的抑菌活性，對獼猴桃軟腐病病原菌的抑制率高達81.16%，對其他幾種獼猴桃病原真菌的抑制率也均在50%以上；21號菌株發(fā)酵液在濃度為20%時，對Botryoshaeriadothidea，Collectotrichumsp.，Alternariaalternate三種病害菌的抑制率分別達到了80.26%、79.12%、45.84%; 在1 mg/mL濃度下，21號菌株發(fā)酵液乙酸乙酯粗提物對Monilinialaxa、phomasp.的抑菌活性分別達到了100%、60.45%。研究表明21號菌株發(fā)酵液乙酸乙酯粗提物能有效抑制獼猴桃病害菌株，值得進一步研究。

獼猴桃; 青蒿; 病原真菌; 抑菌活性

獼猴桃(Actinidia chinensisPlanch.)具有豐富的營養(yǎng)價值和良好的藥用價值。其果實中含有大量的糖、蛋白質(zhì)、氨基酸等多種有機物和人體必需的多種礦物質(zhì)及維生素，其維生素C的含量遠遠超過柑桔、蘋果和梨，有“水果之王”、“Vc之王”之稱[1]。目前貴州省獼猴桃栽培區(qū)有水城、修文、貴定、甕安、湄潭、龍里、六枝、盤縣、赫章、開陽、烏當?shù)鹊?，栽培品種有貴長、貴豐、貴密、貴露、紅陽、海沃特、秦美[2-3]等，隨著獼猴桃種植面積逐年擴大，獼猴桃病害造成的損失也隨之加重。獼猴桃的主要病害有真菌性病害、細菌性病害、生理性病害，其中最常見、危害最嚴重的真菌病害有獼猴桃褐腐病(病原菌：Botryosphaeria dothidea)、獼猴桃炭疽病(病原菌：Collectotrichum sp.)、獼猴桃軟腐病(病原菌：phoma sp.)、獼猴桃褐斑病(病原菌：Alternaria sp.)等。

目前控制獼猴桃真菌性的主要方法仍以化學殺菌劑為主，但由于化學殺菌劑容易出現(xiàn)抗藥性和藥物殘留，不僅污染環(huán)境，還嚴重地威脅人體健康。隨著人們對無公害食品的需求日益增加以及對環(huán)境保護的日益關注，生物防治已成為了人們控制植物病害的理想途徑[4-5]。因此，篩選出抑菌活性高、抗菌譜廣的拮抗菌株具有重要的意義。植物內(nèi)生真菌是巨大的微生物資源，在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)與醫(yī)藥應用潛力方面有重大意義。本研究從分離自青蒿(Artemisia carvifoliaBess.)的34株內(nèi)生真菌中篩選對常見獼猴桃病害真菌具有拮抗作用的菌株，初步探討其抑菌活性，以期開發(fā)出具有應用價值的天然藥物。

1　材料與方法

1.1供試菌株

內(nèi)生真菌34株，分離自貴州省六盤水不同地區(qū)青蒿的根、莖、葉和花。

獼猴桃病原真菌：獼猴桃炭疽病菌(Collectotrichumsp.)、獼猴桃褐腐病菌(Botryosphaeria dothidea)、獼猴桃褐腐病菌(Monilinia laxa)、獼猴桃軟腐病菌(phomasp.)、獼猴桃褐斑病(Alternaria alternata)。分離于獼猴桃病害植株。

所有菌株均保存于貴州大學西南藥用生物資源教育部工程研究中心藥用真菌實驗室。

1.2培養(yǎng)基

培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基和沙氏培養(yǎng)基。

1.3拮抗菌株篩選

采用兩點對峙培養(yǎng)法[6]，將活化好的內(nèi)生真菌和病原真菌菌落，在無菌條件下用直徑5mm的打孔器取其菌餅，接入直徑為90mm的PDA平板一側，在PDA平板另一側接入病原真菌，同時以單獨接種病原真菌的培養(yǎng)皿為空白對照，培養(yǎng)7d天后觀察菌落的生長及抑菌情況，測量內(nèi)生真菌與病原真菌菌落生長的相向直徑，計算內(nèi)生真菌對病原真菌的生長抑制率。病原真菌與內(nèi)生真菌菌落相交后，觀察記錄內(nèi)生真菌對病原真菌的包圍、抑制及覆蓋或占領其營養(yǎng)空間的過程，篩選出對病原真菌具有抑制作用的內(nèi)生真菌。

菌絲生長抑制率(%) = (對照菌落直徑 - 處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-0.5mm) × 100%

1.4目標菌株次級代謝產(chǎn)物抑菌活性研究

1.4.1不同稀釋濃度發(fā)酵液的抑菌活性

在無菌條件下，將活化好的21號青蒿內(nèi)生菌落用9mm的打孔器沿菌落邊緣打孔，接種至沙氏培養(yǎng)基(裝液量為200/500mL)的三角瓶中，每瓶接種2個菌餅，于120r/min搖床培養(yǎng)7d，液體發(fā)酵結束后，發(fā)酵液經(jīng)過0.22μm濾頭過濾處理后，與培養(yǎng)基混勻倒平板，使平板內(nèi)發(fā)酵液最終稀釋濃度分別為0%、4%、8%、12%、16%、20%。采用菌絲生長速率法[7]測定發(fā)酵液對獼猴桃炭疽病菌、獼猴桃褐腐病菌、獼猴桃褐斑病菌的抗菌活性。

1.4.2目標菌株發(fā)酵液粗提物的制備

發(fā)酵液粗提物制備：上述液體發(fā)酵結束后，過濾分離菌絲體與發(fā)酵液，發(fā)酵液濃縮為原體積的1/10后，加入等體積的乙酸乙酯超聲萃取3次，每次30min，取上層乙酸乙酯萃取液，合并后旋轉蒸發(fā)濃縮成浸膏備用。余下水相再加入等體積正丁醇相同方法萃取三次，合并萃取液濃縮成浸膏備用。

1.4.3目標菌株發(fā)酵液粗提物的抑菌活性

分別稱取0.2g的乙酸乙酯、正丁醇粗提物溶于3mL的丙酮溶液中，0.22μm濾頭過濾除菌，與冷卻至40-50℃左右的PDA培養(yǎng)基混勻后倒入6cm的平板，制成含藥平板，使平板最終含藥濃度為1mg/mL，以添加等量丙酮溶液培養(yǎng)基為空白對照。凝固后，將活化好的5mm病原真菌菌餅，分別置于含藥培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基表面。實驗設置3個重復。觀察菌落的生長情況，并測量菌落直徑，抑菌效果用抑菌率表示。

2　結果與分析

2.1拮抗菌株篩選

采用兩點對峙培養(yǎng)法對病原真菌具有抑制作用的內(nèi)生真菌進行篩選，結果見表1和圖1。

表1　青蒿內(nèi)生真菌對5種獼猴桃病原真菌的拮抗作用

注: 表中數(shù)據(jù)為內(nèi)生真菌對病原真菌的抑制率， “—”表示抑制效果低于45%或者沒有抑制效果。

(B6：獼猴桃炭疽病原真菌Collectotrichumsp.；B12：獼猴桃褐腐病病原真菌Botryosphaeriadothidea；HGHM: 獼猴桃軟腐病病原真菌phomasp.；RSF: 獼猴桃褐斑病病原真菌Alternariaalternata；LHF: 獼猴桃褐腐病病原真菌Monilinialaxa，下同)

由表1可知，34株菌株中有20株內(nèi)生真菌對至少一種獼猴桃病原真菌有大于45%的拮抗作用，有7株菌株對至少2種獼猴桃病原真菌有大于45%的拮抗作用，其中21號菌株抗菌譜最廣，對獼猴桃炭疽病原真菌B6，獼猴桃褐腐病病原真菌B12、獼猴桃軟腐病病原真菌HGHM、獼猴桃褐斑病病原真菌RSF、獼猴桃褐腐病病原真菌LHF均有抑菌活性，抑制率分別達到59.19%、66.67%、81.16%、57.10%、69.7 %。由圖1可以看出，獼猴桃炭疽病B6在21號菌株的包圍下不能繼續(xù)生長，之間形成一條抑菌帶，其他4種病原真菌與21號內(nèi)生真菌接觸后，生真菌菌落覆蓋病原真菌菌落之上，抑制病原真菌的生長。因此，本實驗選擇21號菌株作為目標菌株，進一步檢測其次級代謝產(chǎn)物對獼猴桃病害菌的抑菌作用。

圖1　21號青蒿內(nèi)生真菌對5種獼猴桃病害真菌的拮抗作用

注：A-E為只接獼猴桃病原真菌的對照組,分別為B6、B12、HGHM、RSF、LHF；a-e分別為21號菌株對以上幾種獼猴桃病原真菌的拮抗效果，菌株編號同表1。

2.221號菌株不同稀釋濃度發(fā)酵液的抑菌活性

對21號菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，將發(fā)酵液稀釋成不同濃度對獼猴桃炭疽病菌、獼猴桃褐腐病菌、獼猴桃褐斑病菌的抗菌活性進行檢測，結果見表2-4及圖2。由表2-4中可以看出，隨著發(fā)酵液濃度的增加，獼猴桃病原真菌的菌落逐漸變小，對獼猴桃病害病病原真菌的抑菌活性均呈上升趨勢，發(fā)酵液濃度與抑菌率呈正相關，當發(fā)酵液濃度為20%時，對獼猴桃褐腐病、獼猴桃炭疽病、獼猴桃褐斑病三種病害菌的抑制率分別達到了80.26%、79.12%、45.84%；通過回歸方程得出發(fā)酵液對以上三種病害菌的IC50值分別為10.33%、11.44%、19.48%。從圖2可以看21號菌株發(fā)酵液對獼猴桃褐腐病病原真菌有很強的抑菌活性，菌絲在發(fā)酵濾液培養(yǎng)基上生長緩慢，菌落大小也隨著發(fā)酵液濃度的增加而減小，菌絲明顯稀薄。

表2　21號青蒿內(nèi)生真菌發(fā)酵液對獼猴桃褐腐病(B12)病原真菌的拮抗活性

表3　21號青蒿內(nèi)生真菌菌株發(fā)酵液對獼猴桃炭疽病菌(B6)的拮抗活性

表4　21號青蒿內(nèi)生真菌菌株發(fā)酵液對獼猴桃褐斑病菌(RSF)的拮抗活性

圖2　21號菌株發(fā)酵濾液對獼猴桃褐腐病病原真菌(B12)的抑菌作用(3d)

3.321號拮抗菌株發(fā)酵液粗提物的抑菌活性

21號菌株發(fā)酵液經(jīng)乙酸乙酯和正丁醇萃取后粗提物(終濃度為1 mg/mL)溶于丙酮溶液中制成含藥平板，并以等量丙酮溶液培養(yǎng)基為空白對照。將活化好的5 mm 病原真菌菌餅，分別置于含藥培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基表面，其抑菌活性見圖3。由圖3可知， 21號內(nèi)生真菌發(fā)酵液的乙酸乙酯、 正丁醇粗提物對4種獼猴桃病原菌都有不同程度的抑菌活性,乙酸乙酯粗提物對LHF、HGHM的抑制率分別達到100%、60.45%，具有較強的抑制作用。乙酸乙酯粗提物對病原真菌的抑制效果較好，其菌落的生長情況和抑菌效果見圖4；而正丁醇粗提物除了對LHF有較好的抑制作用外，對其他病原真菌的抑制效果均不好。

圖3　21號青蒿內(nèi)生真菌發(fā)酵液粗提物對幾種獼猴桃病原菌的抑菌率

圖4　21號青蒿內(nèi)生真菌發(fā)酵液的乙酸乙酯粗提物對4種獼猴桃病原真菌的抑菌情況

3　討論

隨著病原菌對殺菌劑耐藥性、抗藥性的出現(xiàn)和耐/抗藥程度的不斷增強和農(nóng)藥污染的日趨嚴重，人們渴望獲得更多新型、安全、療效更為顯著的抗菌藥物，而尋找新型抗菌藥物的前提是找到新的藥物篩選源[8]。生物防治成為目前植物病害防治研究的熱點之一。本實驗采用平板對峙法發(fā)現(xiàn)供試青蒿內(nèi)生真菌菌株對于供試的5種獼猴桃主要病害病原菌均有不同的抑制作用，其中對獼猴桃炭疽病、獼猴桃褐腐病病原真菌具有抑菌活性的菌株較多，而對獼猴桃褐斑病和獼猴桃軟腐病病原真菌有抑菌作用的菌株較少，同一內(nèi)生真菌，對不同病原菌的抑制效果有明顯的差異。而21號內(nèi)生真菌對5種病原真菌均有較高的抑制作用，且抑制率均大于其他內(nèi)生真菌的抑制率，可見21號菌株具有較強的抑菌活性，有進一步研究的價值。

實驗研究表明拮抗菌對植物病害防治的作用機制主要表現(xiàn)為3種類型：(1) 抗生作用，指內(nèi)生真菌分泌具有抗生作用的次級代謝產(chǎn)物使之與供試病原真菌菌落間產(chǎn)生抑菌帶，內(nèi)生真菌并不與供試病原真菌直接接觸即可抑制其生長[9-10]；(2) 基質(zhì)競爭作用，是由于內(nèi)生真菌具有較快的菌絲生長速度或可快速大量產(chǎn)生孢子，菌落迅速擴展占領培養(yǎng)基質(zhì)，減少和壓縮了供試病原真菌可獲得的營養(yǎng)和生存空間[10-11]；(3) 寄生作用，即內(nèi)生真菌具有寄生供試病原真菌的能力，在與供試病原真菌接觸后可繼續(xù)生長，通過菌絲纏繞和寄生活動抑制供試病原真菌的生長，最后內(nèi)生真菌菌落覆蓋和代替病原真菌菌落于病原真菌菌落之上[11]。本實驗平板對峙中的來自青蒿內(nèi)生真菌的21號菌株對獼猴桃病病原真菌的拮抗作用主要表現(xiàn)為基質(zhì)競爭作用和寄生作用，而發(fā)酵液及發(fā)酵液粗提物對植物病原菌均有抑制作用，說明該菌株可以產(chǎn)生具有抑菌活性的物質(zhì)，表明21號菌株對獼猴桃病病原真菌的拮抗作用也表現(xiàn)為一定的抗生作用。此外有研究表明青蒿內(nèi)生真菌具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化[12-15]等活性。我們將在后續(xù)研究中重點對青蒿內(nèi)生真菌的21號菌株及其抗菌活性物質(zhì)進行分離純化與鑒定，深入開發(fā)青蒿內(nèi)生真菌，以期服務于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和醫(yī)藥衛(wèi)生。

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ScreeningofAntagonisticFungiagainstPathogenicFungiofKiwifruitandDeterminationofitsAntimicrobialActivity

HE Ying-hong1,2, QIAN Yi-xin2, KANG Ji-chuan2*, LEI Bang-xing2

(1.College of life science, Guizhou University, Guiyang, Guizhou 550025, China; 2.Engineering Research Centre of Southwest Bio-Pharmaceutical Resources,Ministry of Education, Guizhou University, Guiyang, Guizhou 550025, China )

Inthepresentstudy,dual-cultureinhibitionwasusedtoscreenantagonisticstrainsfrom34endophyticfungiofArtemisia carvifoliaagainstfivecommonpathogenicfungi(Botryosphaeria dothidea, Collectotrichumsp., Monilinia laxa, Phomasp., Alternaria alternata)ofActinidia chinensis.Also,growthratemethodwasemployedtodetecttheantagonisticeffectofthefermentationliquidandthecrudeextractsfromfermentedliquidagainstpathogenicfungi.No21endophyticfungiisolatedfromA.carvifoliademonstratedbetterantibacterialactivity.InhibitionratesofPhomasp. (A. chinensissoftrot)was81.16%,andthatofseveralothertestedpathogenicfungireachedhigherthan50%.Inhibitionratesof20%fermentationliquidagainstB. dothidea, Collectotrichumsp.,andA. alternatewere80.26%, 79.12%, 45.84%,respectively.TheethylcrudeextractsofNo21strainfermentationliquid(1mg/mL)gave100%and60.45%inhibitionratesagainstM. laxaandPhomasp.,respectively.Therefore,theethylcrudeextractsofNo21fermentationliquidmighteffectivelyinhibitthepathogenicfungiofA. chinensis,andwaspromisingfordeservingfurtherexploitation.

Actinidia chinensis; Artemisia carvifolia;Pathogenicfungi;Antimicrobialactivity

2015-12-21；

2016-03-10

貴州省中藥現(xiàn)代化科技產(chǎn)業(yè)研究開發(fā)專項項目(黔科合中藥字[2012]5008號)；貴州省科技創(chuàng)新人才團隊建設項目(黔科合人才團隊[2012]4007號)。

康冀川，男，教授，博士生導師，主要研究方向：分子生物學和真菌學；E-mail: bcec.jckang@gzu.edu.cn。

Q945.8

A

1008-0457(2016)02-0068-05國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2016.02.013