定點(diǎn)突變提高g-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的pH耐受性及催化活性

彭 清, 姚 忠, 周 治, 王浩綺, 肖 環(huán), 倪 芳, 孫 蕓

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定點(diǎn)突變提高-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的pH耐受性及催化活性

彭 清, 姚 忠, 周 治, 王浩綺, 肖 環(huán), 倪 芳, 孫 蕓

(南京工業(yè)大學(xué) 食品與輕工學(xué)院, 江蘇 南京 211816)

-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)是生物體內(nèi)谷氨酰循環(huán)的關(guān)鍵酶,可廣泛應(yīng)用于多種-谷氨?；衔锏纳锖铣?。但其在體外催化環(huán)境下(pH>9.0)極易發(fā)生不可逆失活，限制其生物催化領(lǐng)域的實(shí)際應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)以枯草芽孢桿菌NX-2 GGT(_GGT)為對(duì)象，采用同源建模獲得_GGT的3D結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模型；分析_GGT大、小亞基表面氨基酸殘基的性質(zhì)、空間位置和保守性，最終選取Asp46、Thr201、Tyr280、Gln322、Glu502和His543為候選位點(diǎn)；通過(guò)定點(diǎn)突變將候選位點(diǎn)分別替換為纈氨酸，以期通過(guò)提高_(dá)GGT大小亞基間的疏水作用，改善其pH耐受性。研究成功實(shí)現(xiàn)了6種突變酶(D46V、T201V、Y280V、E502V、Q322V和H543V)的異源表達(dá)，并分別研究了其催化活性和穩(wěn)定性。結(jié)果表明：D46V、Y280V、E502V、H543V的m略小于_GGT，且Y280V的cat較_GGT有明顯提高；D46V、Y280V和E502V的pH穩(wěn)定性均較_GGT有所改善，其中Y280V的pH穩(wěn)定性最高；模型分析顯示，在<10?范圍內(nèi)，Y280V可與附近4個(gè)氨基酸殘基(Y-283、W-277、I-501和I-497)產(chǎn)生疏水相互作用，這可能是其pH耐受性較強(qiáng)的主要原因。

γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶；定點(diǎn)突變；疏水相互作用； pH穩(wěn)定性；催化性質(zhì)

1 前 言

-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(-glutamyltranspeptidase，GGT，EC 2.3.2.2)是生物體內(nèi)谷氨酰循環(huán)的關(guān)鍵酶，廣泛存在于細(xì)菌、真菌、植物、哺乳類動(dòng)物中。成熟的GGT是一種異質(zhì)二聚體酶[1]，包含一個(gè)大亞基(~40 KDa)和一個(gè)小亞基(~20 KDa)，是由一個(gè)大小約60 KDa的沒(méi)有催化活性的蛋白前體自主催化分裂而來(lái)[2]。

GGT可特異性催化谷胱甘肽的-谷氨酰基斷裂， 將其轉(zhuǎn)移至受體分子(如水分子、-氨基酸或二肽)[3]。由于該反應(yīng)具有位點(diǎn)特異性強(qiáng)，且不消耗ATP等優(yōu)點(diǎn)，在生物有機(jī)合成領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。目前，利用GGT反應(yīng)已成功實(shí)現(xiàn)了茶氨酸[4,5]、-谷氨酰-L-多巴[6]、-谷氨酰-L-?；撬醄7]、-谷氨酰-D-色氨酸[8,9]、-谷氨酰-半胱氨酸[10]等化合物的合成。但由于GGT催化的谷氨?；D(zhuǎn)移反應(yīng)需在堿性(pH>9.0)條件下進(jìn)行，而枯草芽孢桿菌NX-2 GGT (_GGT)對(duì)堿性環(huán)境的耐受性普遍較差，限制了GGT反應(yīng)的工業(yè)化應(yīng)用。

已經(jīng)證明，大多數(shù)寡聚酶的失活往往始于四級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，即亞基解聚(subunit dissociation)[11]。本課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，NX-2 GGT在失活過(guò)程中也伴隨著明顯的亞基解聚，且pH值的變化對(duì)其多亞基結(jié)構(gòu)的影響尤為顯著[12]。

目前，寡聚酶亞基解聚的方法有提高反應(yīng)壓力[13]、酶的物理交聯(lián)或化學(xué)交聯(lián)[14]、以及酶的固定化[15]等。近年來(lái)，利用蛋白質(zhì)工程手段提高寡聚酶亞基間的相互作用能，提高寡聚酶穩(wěn)定性的方法逐漸成為研究熱點(diǎn)。1987年Klibanov等首次提出了通過(guò)定點(diǎn)突變提高寡聚酶亞基間相互作用能的方法，并以磷酸丙糖異構(gòu)酶(TIM)為對(duì)象進(jìn)行了成功的嘗試[16]。此后，Mishra等通過(guò)把Cu/Zn SOD二聚體表面一個(gè)保守序列上的亮氨酸突變成賴氨酸，降低了二聚體表面的疏水性，加速了其二聚體解聚[17]。Ding等在葡萄糖1-脫氫酶的亞基表面之間導(dǎo)入二硫鍵，使該酶在pH4.5~10.5保持高度穩(wěn)定的狀態(tài)，在50℃下的半衰期為9900min，是野生型酶的1868倍[18]；Bj?rk等將的蘋果酸脫氫酶中的Glu165替換為Gln或Lys，使突變酶在pH 7.5條件下的熱穩(wěn)定性顯著提高[19]。Peimbert等將TIM亞基表面上的部分殘基(K17，Y46，D48，Q82和D85)替換為非極性氨基酸(Ala、Val、Phe、Tyr、Ile、Leu或Pro)，獲得了高穩(wěn)定性的突變酶TIMs，突變酶的m值與野生酶相當(dāng)，但催化數(shù)cat卻下降明顯[20]。

綜上所述，采用蛋白質(zhì)工程手段，在寡聚酶亞基表面引入二硫鍵，或增加荷電及疏水性氨基酸，提高亞基的間相互作用能，是提高其穩(wěn)定性的有效途徑。因此，針對(duì)野生型GGT的pH耐受性差的缺陷，本文以_GGT 為研究對(duì)象，以str.168 GGT晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID: 3A75)為模板，通過(guò)分析_GGT大、小亞基表面殘基的組成、性質(zhì)及空間位置，篩選得到可能的突變位點(diǎn)，并將其逐一替換為纈氨酸(Valine)，以增強(qiáng)GGT亞基間的疏水相互作用；在此基礎(chǔ)上，考察了各種突變酶的催化特性及pH耐受性，以驗(yàn)證實(shí)際的突變效果。

2 材料與方法

2.1 材料與試劑

用于提取基因組的菌株為NX-2(CGMCC 0833，_GGT編碼基因全長(zhǎng)為1764 bp，與str.168 GGT基因序列的同源性達(dá)99.21%，氨基酸序列一致性達(dá)99.15%)；表達(dá)菌株BL21(DE3)和表達(dá)載體質(zhì)粒pET-22b(+)均為本實(shí)驗(yàn)室保藏；DNA聚合酶購(gòu)自TOYOBO公司；限制性內(nèi)切酶I、I 及相應(yīng)緩沖液購(gòu)至 NEB公司；DNA消化酶I購(gòu)自Thermo公司；T4 DNA連接酶、標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA、標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白購(gòu)自TaKaRa公司；蛋白定量試劑盒Bio-Rad購(gòu)自GENERAY公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器

蛋白電泳儀、紫外分光光度計(jì)Ultrospec 7000(GE healthcare，美國(guó))；MyCyceler PCR儀(Bio-Rad，美國(guó))；pH計(jì)(METTLER TOLEDO，瑞士)；蛋白純化儀 FPLC(GE Healthcare，美國(guó))。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1 同源建模方法和定點(diǎn)突變位點(diǎn)的選擇

采用Discovery studio 2.1 軟件(DS2.1 Accelrys Software Inc, San Diego, CA)，以str.168 GGT晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID: 3A75)為模板經(jīng)同源建模生成_GGT的3D結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模型。借助Pymol軟件分析_GGT大、小亞基表面氨基酸殘基，篩選合適的突變位點(diǎn)。突變的候選位點(diǎn)需同時(shí)滿足以下條件：距離_GGT活性中心(T-403)距離＞15 ?；保守性＜100%；非疏水性氨基酸。

2.3.2 PCR方法

PCR反應(yīng)體系(50 μL)包括1×DNA 聚合酶緩沖液，20 mmol×L-1Mg2+，10 pmol×L-1正反向引物，50 ng DNA模板和1UDNA 聚合酶。反應(yīng)條件為：95℃ 5 min；95℃ 30 s；55℃30 s；68℃ 1~7 min，循環(huán)28次；68℃ 10 min 結(jié)束程序。

2.3.3 GGT突變體質(zhì)粒的獲得和外源表達(dá)

根據(jù)已公布的str. 168(Genbank: AL009126.3)的GGT基因序列設(shè)計(jì)合成引物(表1)。在上游引物、下游引物的5′端分別引入相應(yīng)的酶切位點(diǎn)(下劃線)，構(gòu)建重組質(zhì)粒Pet-22b(+)GGT，并以其為模板，通過(guò)互補(bǔ)的正反向引物(見表1)經(jīng)PCR得到突變重組質(zhì)粒；用限制性內(nèi)切酶I酶切去除模板質(zhì)粒；將酶切的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主BL21 (DE3) 感受態(tài)細(xì)胞中，并涂布在含有氨芐青霉素(50 μg×mL-1)的LB平板，于37℃過(guò)夜培養(yǎng)后，挑取克隆轉(zhuǎn)接LB培養(yǎng)基(含氨芐青霉素)培養(yǎng)12 h；以5 %接種量接種于新鮮的LB培養(yǎng)基，至OD600=0.5~0.6后加入終濃度為2.5 g×L-1的乳糖，于25℃下誘導(dǎo)表達(dá)12 h。為了驗(yàn)證所表達(dá)的突變體編碼基因的正確性，每次表達(dá)過(guò)程中均取5 mL菌液，提取質(zhì)粒并測(cè)序。

表1 模板引物設(shè)計(jì)和定點(diǎn)突變?cè)O(shè)計(jì)的部分引物

Note：Nucleotide sequence corresponding to the mutated amino acids is bolded

2.3.4 重組_GGT和突變酶的純化

將誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液經(jīng)12000 r×min-1離心后收集菌體；用Tris-HCl (pH 8.0，50 mmol×L-1)緩沖液洗滌菌體，再次離心收集菌體后用Tris-HCl(pH 8.0，50 mmol×L-1)緩沖液重懸菌體，冰浴超聲破碎，12000 r×min-1、4℃下離心取上清液，粗酶液中GGT以Ni2+-NTA純化，并經(jīng)超濾脫鹽后備用。

2.3.5與蛋白濃度的檢測(cè)

_GGT和突變酶的純度由SDS-PAGE檢測(cè)；蛋白濃度由Bradford蛋白定量試劑盒測(cè)定，以牛血清蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)蛋白繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.6 酶活測(cè)定[21]

酶活(U)定義：以-谷氨酰對(duì)硝基苯胺(GNA)為供體，以雙苷二肽為受體，每分鐘催化GNA水解生成1 nmol對(duì)硝基苯胺(NA)所需的酶量。

酶活測(cè)定方法：配制不同濃度的對(duì)硝基苯胺(NA)標(biāo)準(zhǔn)溶液，并在410 nm下測(cè)定其吸光值，分別以NA濃度和相應(yīng)的吸光值為橫、縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取0.5 mL GNA溶液(5 mmol×L-1)、0.5 mL 雙苷二肽溶液(100 mol×L-1)、0.5 mL酶液和1.5 mL Tris-HCl緩沖液(50 mmol×L-1，pH 8.0)，混勻后于37oC水浴反應(yīng)10 min。反應(yīng)液于410 nm下測(cè)吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算產(chǎn)物濃度和酶活。

2.3.7催化動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測(cè)定

GGT的催化動(dòng)力學(xué)方程為雙底物的Michaelis-Menten方程[22]，當(dāng)受體(雙甘二肽)濃度遠(yuǎn)大于供體(GNA)濃度時(shí)，該方程可簡(jiǎn)化為單底物米氏方程：

2.3.8 最適反應(yīng)pH

按照2.3.6節(jié)的酶活測(cè)定方法，調(diào)節(jié)緩沖液的pH值分別為6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，分別測(cè)定突變酶及重組_GGT在不同pH條件下的酶活。

2.3.9 pH穩(wěn)定性

將重組_GGT和突變酶分別置于pH 6.0~11.0的緩沖液中，40℃水浴保溫3 h后，分別取樣，按2.3.6節(jié)的方法測(cè)定其殘余酶活。設(shè)保溫前各自的初始酶活為100 %。

將重組_GGT和突變酶分別置于pH 9.0~11.0的緩沖液中，并于40℃下溫育，每隔一段時(shí)間取樣，按2.3.6節(jié)的方法測(cè)定酶活，并計(jì)算殘余相對(duì)酶活r(%)。假定GGT的失活為一級(jí)反應(yīng)，可得失活反應(yīng)方程：

2.3.11 重組_GGT和突變酶?；磻?yīng)活化能的測(cè)定

由于酶促反應(yīng)速度可表示為：

根據(jù)式(4)和(5)，酶促催化反應(yīng)速率方程可表示為：

3 結(jié)果與討論

3.1 同源建模及突變氨基酸候選位點(diǎn)的篩選

以str. 168 GGT的晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID: 3A75)為模板構(gòu)建了GGT 3D結(jié)構(gòu)的二聚體預(yù)測(cè)模型(見圖1)，并運(yùn)用Ramachandran模塊來(lái)其進(jìn)行評(píng)估。在構(gòu)建的預(yù)測(cè)模型中，98.3 %的殘基位于允許范圍內(nèi)，其中91.7 %的殘基位于最優(yōu)化區(qū)域，2.0 %位于待優(yōu)化區(qū)域。模型的Profile-3D得分為182分，而預(yù)期最高得分為212分，表明該模型能夠反映GGT的真實(shí)結(jié)構(gòu)，并可用于定點(diǎn)突變位點(diǎn)的選取。

進(jìn)一步根據(jù)2.3.1節(jié)的篩選條件，結(jié)合_GGT3D結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模型，并選取了9條不同來(lái)源的GGT序列(；；；；；sp；；；)與模板(NX-2)進(jìn)行同源性分析，最終選取得到了6個(gè)候選的突變位點(diǎn)，分別為A鏈上的D46、T201、Y280、Q322，和B鏈上的E502和H543，候選殘基的空間位置、保守性，以及距活性中心(T-403)的距離見圖1和表2。

表2 候選突變位點(diǎn)與活性中心(T-403)的距離(?)、保守性及位置

Note：A and B represent chain A and chain B ofGGT respectively，chain A：1~359；chain B：360~587.

3.2_GGT基因擴(kuò)增、重組、突變、誘導(dǎo)表達(dá)及純化

按2.3.3節(jié)構(gòu)建突變重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化BL21 (DE3) 感受態(tài)細(xì)胞；挑選陽(yáng)性克隆，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后，對(duì)所得突變菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；發(fā)酵液經(jīng)離心后收集菌體，經(jīng)超聲破碎后，取上清液進(jìn)行親和純化。

純化后樣品的SDS -PAGE 電泳分析結(jié)果顯示，6種突變酶在BL21 (DE3)中均可成功表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物均為二聚體蛋白，大、小亞基的分子量分別在46 kDa和20 kDa左右(圖2)，與_BGGT一致。

3.3_GGT和突變酶的酶學(xué)性質(zhì)

3.3.1 催化動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測(cè)定

分別配制供體(GNA)濃度為0.5、1、2、3、4、5 mmol×L-1，受體雙甘二肽濃度均為100 mmol×L-1的反應(yīng)液，測(cè)定重組_GGT和突變酶的?；磻?yīng)速率(s)，并按照2.3.7節(jié)的方法，計(jì)算_GGT和各種突變酶的催化動(dòng)力學(xué)常數(shù)，結(jié)果見表3。

表3 wt_GGT和突變酶的催化動(dòng)力學(xué)常數(shù)

由表可知，大多數(shù)突變酶的催化常數(shù)與_GGT相近，其中D46V、Y280V、E502V、H543V的m略小于_GGT，T201V和Q322V的m較_GGT有所增加；此外，Y280V的cat顯著高于_GGT，提高幅度達(dá)43.3 %。

3.3.2 酰基反應(yīng)活化能(a)的測(cè)定

根據(jù)2.3.11節(jié)的方法，在不同溫度下(25~50℃)分別測(cè)定_GGT及D46V、T201V、Y280V、Q322V、E502V、H543V的NA的生成速率()，以ln對(duì)1/作圖，得到_GGT和突變酶的?；磻?yīng)活化能a，結(jié)果如圖3和表4所示。

表4 wt_GGT和突變酶的酰基化反應(yīng)活化能(Ea)

反應(yīng)活化能(a)表示GGT啟動(dòng)?；D(zhuǎn)移反應(yīng)所需的能量。如表所示，Y280V和E502V的反應(yīng)活化能與_GGT相近，而D46V、T201V、Q322V，以及H543V的反應(yīng)活化能較_GGT均有不同程度的增加。

3.3.3 最適反應(yīng)pH

分別在pH6.0~11.0的緩沖液中測(cè)定_GGT和突變酶D46V、T201V、Y280V、Q322V、E502V、H543V的活力。結(jié)果顯示，無(wú)論_GGT還是突變酶，其最適pH范圍均在pH 8.0~10.0，但突變酶酶活在這一范圍內(nèi)的變化均較_GGT更為平緩(圖4)。

3.3.4 pH穩(wěn)定性

將_GGT和突變酶分別置于pH 6.0~11.0的緩沖液中，于40℃下保溫3 h后測(cè)定酶活，以0時(shí)刻的初始酶活為100 %，計(jì)算殘余酶活r。結(jié)果表明，隨著pH值的上升，_GGT和突變酶的穩(wěn)定性均呈下降趨勢(shì)(圖5)，但D46V、Y280V和E502V的pH穩(wěn)定性較_GGT有所提高，其中Y280V在pH 11.0條件下溫育3 h后，殘余酶活仍可達(dá)24.32%，較_GGT提高了58.33%。

3.3.5 不同pH下_GGT、D46V、Y280V和E502V的失活速率常數(shù)

分別將_GGT，以及突變酶D46V、Y280V和E502V置于pH 9~11的緩沖液中，并于40℃保溫，每隔一定時(shí)間取樣測(cè)定酶活，以0時(shí)刻的酶活性為100%，計(jì)算相對(duì)酶活r。按照2.3.10節(jié)的方法計(jì)算_GGT和突變酶在不同溫度下的失活速率常數(shù)d，結(jié)果見表6和圖6。

表6 wt_GGT、D46V、Y280V和E502V在不同pH條件下的失活速率常數(shù)

由表可知，_GGT、D46V、Y280V和E502V的失活速率均隨pH值的升高呈逐漸增加的趨勢(shì)，但突變酶的pH失活速率常數(shù)(d)明顯低于_GGT，其中Y280V在pH 11.0條件下的d值僅為5.65×10-3。

3.4 突變酶V-46、V-502和V280與附近氨基酸的相互作用分析

采用Pymol軟件分析了D46V、E502V和Y280V突變殘基(V-46、V-502和V-280)附近的疏水性氨基酸。如圖7所示，在<10 ?距離內(nèi)，V-46、V-502和V-280附近均存在一定數(shù)量的疏水性氨基酸，可與突變殘基間發(fā)生疏水相互作用，且分別位于A鏈和B鏈(圖7)，這有助于提高突變酶亞基間的相互作用能，并穩(wěn)定其三、四級(jí)結(jié)構(gòu)；其中，V-280可與附近4個(gè)氨基酸(Y-283、W-277、I-501和I-497)的側(cè)鏈產(chǎn)生疏水相互作用，形成的疏水力場(chǎng)更強(qiáng)，從而使Y280V具有更強(qiáng)的pH穩(wěn)定性。

4 結(jié) 論

GGT是由大、小兩個(gè)亞基構(gòu)成的二聚體酶，在高pH環(huán)境(pH>9.0)下易發(fā)生亞基解聚，進(jìn)而引發(fā)酶的不可逆失活。為此，本文提出了采用定點(diǎn)突變的方法，在GGT亞基表面引入疏水性氨基酸，增強(qiáng)亞基間的疏水相互作用。由于疏水相互作用的強(qiáng)度不易受環(huán)境pH值影響，因而有助于提高GGT的pH耐受性。得到的具體結(jié)論如下：

(1) 采用同源建模的方法得到了_GGT的3D結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模型，并通過(guò)對(duì)_GGT表面氨基酸殘基的性質(zhì)、空間位置，以及保守性的分析，篩選得到了6個(gè)候選的突變位點(diǎn)；

(2) 采用定點(diǎn)突變的方法，將候選位點(diǎn)分別替換為纈氨酸，并成功實(shí)現(xiàn)了6種突變酶的異源表達(dá)；

(3) 分別測(cè)定了6種突變酶的酶學(xué)性質(zhì)和催化常數(shù)。結(jié)果表明，D46V、Y280V、E502V、H543V的m略小于_GGT，而T201V和Q322V的m較_GGT有所增加；Y280V和D46V的cat均較_GGT有所提高，其中Y280V的提高幅度高達(dá)43.3 %；

(4) 突變酶中D46V、Y280V和E502V的pH穩(wěn)定性均較_GGT有所提高，其中Y280V在pH 11.0條件下溫育3 h后，殘余酶活可達(dá)24.32%，較_GGT提高了58.33%；經(jīng)測(cè)定，Y280V在pH 11.0條件下的失活速率常數(shù)(d)值僅為5.56×10-3；

(5) 模型分析顯示，突變殘基V-46、V-502和V-280可分別與位于A鏈和B鏈上的多個(gè)氨基酸殘基產(chǎn)生疏水相互作用，其中V-280與附近氨基酸形成的疏水作用更強(qiáng)，這可能是導(dǎo)致Y280V的pH穩(wěn)定性最高的主要原因。

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Improving pH Stability and Catalytic Activity of-Glutamyltranspeptidase by Site-Directed Mutation

PENG Qing, YAO Zhong, ZHOU Zhi, WANG Hao-qi, XIAO Huan, NI Fang, SUN Yun

(College of Food Science and Light Industry, Nanjing Tech University, Nanjing 211816, China)

-Glutamyltranspeptidase (GGT) is a key enzyme in glutathione metabolism that can synthesize a series of-glutamyl compounds. However, a variety of environmental conditions (especially pH>9.0) can restrain GGT and hence the application of GGT in biocatalysis. The 3D structure of-glutayltranspeptidase fromNX-2 (_GGT) was predicted by a homologous model in this study. In order to improve hydrophobic interaction between two subunits of_GGT and enhance GGT pH tolerance, residues Asp46, Thr201, Tyr280, Gln322, Glu502 and His543 were chosen as the candidates, which were substituted with valine by site-directed mutagenesis after analyzing the spatial position, conservation and properties of those residues on the surface of_GGT. Six mutations were successfully expressed inand the catalytic properties and stabilities of the obtained mutations were investigated. The results show that substitution of Asp46, Tyr280, Glu502 or His543 with Val result in a slight decrease ofmcompared with that of_GGT. Thecatof mutation Y280 is significantly increased. Moreover, the pH stability of mutations D46V, Y280V and E502V are all improved and Y280V is the best. The 3D models of D46V, E502V and Y280V show that V-280 could form a stronger hydrophobic interaction with four hydrophobic residues（Y-283, W-277, I-501 and I-497）within the scope of 10 ?, which may be the main reason for the better tolerance of Y280V under higher pH values.

γ-glutamyltranspeptidase; site-directed mutation; hydrophobic interaction; pH stability; catalytic properties

1003-9015(2016)01-0133-09 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/33.1141.TQ.20151222.1108.016.html

Q81

A

10.3969/j.issn.1003-9015.2015.00.039

2014-12-16；

2015-04-17。網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-12-22 11:08:28

國(guó)家自然科學(xué)基金(21206072)；江蘇省自然科學(xué)基金(BK2012825)；江蘇省農(nóng)業(yè)支撐計(jì)劃項(xiàng)目(BE2012399)。

彭清(1990-)，男，湖南汩羅人，南京工業(yè)大學(xué)碩士生。通訊聯(lián)系人：姚忠，E-mail：yaozhong@njtech.edu.cn