Iniferter自由基聚合法制備谷胱甘肽分子印跡聚合物及其吸附性能研究

宋任遠(yuǎn), 胡小玲, 管 萍, 王巧麗, 高 博, 楊龍飛

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Iniferter自由基聚合法制備谷胱甘肽分子印跡聚合物及其吸附性能研究

宋任遠(yuǎn), 胡小玲, 管 萍, 王巧麗, 高 博, 楊龍飛

(西北工業(yè)大學(xué) 空間應(yīng)用物理與化學(xué)重點實驗室, 陜西 西安 710129)

以谷胱甘肽(GSH)為模板分子，4-乙烯基吡啶(4-VP)為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，采用Iniferter自由基聚合法成功制備了谷胱甘肽分子印跡聚合物(L-MIPs)。利用計算機分子模擬和紫外光譜分析對模板分子和功能單體形成的復(fù)合物進(jìn)行了系統(tǒng)研究，結(jié)果表明GSH與4-VP之間的相互作用力為氫鍵作用，其最佳配比為1：6。研究了溶劑種類對L-MIPs的結(jié)合性能和印跡因子的影響，發(fā)現(xiàn)二甲亞砜為制備L-MIPs的最佳溶劑。對比研究了L-MIPs與傳統(tǒng)自由基聚合法制備的谷胱甘肽分子印跡聚合物(H-MIPs)的靜態(tài)吸附性能、動態(tài)吸附性能及選擇識別性能。結(jié)果表明，L-MIPs對GSH分子具有高度親和性、快速結(jié)合性能和良好的選擇識別性能。

谷胱甘肽; 分子印跡聚合物; Iniferter自由基聚合; 結(jié)合性能; 選擇識別性

1 前 言

谷胱甘肽(L-glutathione，簡稱GSH)是一種由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸構(gòu)成的具有重要生理功能的活性三肽，廣泛存在于生物體內(nèi)，是主要的抗氧化劑，參與細(xì)胞內(nèi)的多種反應(yīng)[1]。目前GSH的分離純化方法仍存在樣品預(yù)處理繁瑣、特異性差、干擾大及靈敏度較差等問題，無論是GSH的生產(chǎn)合成和應(yīng)用，還是GSH的生物學(xué)功能及臨床應(yīng)用方面的研究，都亟待優(yōu)良的GSH分離純化方法。

分子印跡是一種對模板分子具有特異性識別作用的新型技術(shù)[2,3]，分子印跡聚合物(MIPs)現(xiàn)通常由可控/“活性”自由基聚合進(jìn)行制備，主要分為氮氧穩(wěn)定自由基聚合(NMP)[4]、原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)[5]、可逆-加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移自由基聚合(RAFT)[6]以及引發(fā)轉(zhuǎn)移終止劑(Iniferter)法[7]。其機理的特點是快引發(fā)、慢增長和“無”終止，得到的聚合物分子量分布較窄，聚合物的端基、組成、結(jié)構(gòu)等都可以控制。另外，可控/“活性”自由基聚合還可以實現(xiàn)低溫光引發(fā)聚合，這種聚合方式對于生物活性較強的谷胱甘肽分子來說，更加利于其穩(wěn)定性。因此采用可控/“活性”自由基聚合法是制備谷胱甘肽分子印跡聚合物有效且重要的方法。

本文采用Iniferter自由基聚合法，以4-乙烯基吡啶(4-VP)為功能單體制備得到了谷胱甘肽分子印跡聚合物(L-MIPs)；同時研究了模板分子和功能單體的最佳配比，以及溶劑種類對L-MIPs在形貌和性能方面的影響；并通過實驗對Iniferter自由基聚合和傳統(tǒng)自由基聚合制備的分子印跡聚合物(L-MIPS和H-MIPs)進(jìn)行了比較；詳細(xì)研究了L-MIPs相比H-MIPs在靜態(tài)吸附性能、動態(tài)吸附性能以及識別性能方面的優(yōu)勢。

2 實驗部分

2.1 主要儀器與試劑

傅立葉變換紅外光譜儀(WQF-310，日本島津公司)；紫外可見光分光光度計(UV-2550，日本島津公司)；場發(fā)射掃描電子顯微鏡(Quanta 600FEG，美國TA公司)；熱分析系統(tǒng)(Q600SDT，美國TA)；微波-紫外-超聲三位一體合成萃取反應(yīng)儀(UWave-1000，上海新儀微波化學(xué)科技有限公司)；數(shù)顯水浴恒溫振蕩器(SHZ-C，金壇市江南儀器廠)；數(shù)控超聲波清洗器(KQ-100DE，昆山市超聲儀器有限公司)。

谷胱甘肽(GSH，BC，上海晶純科技有限公司)；氧化型谷胱甘肽(GSSG，BC，上海源葉生物科技有限公司)；雙甘氨肽(Gly-Gly，BC，上海晶純科技有限公司)；4-乙烯基吡啶(4-VP，AR，百靈威科技有限公司)；乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA，純度為97%，煙臺云開化工有限公司)；對氯甲基苯乙烯(P-CMS，AR，TCI化學(xué)工業(yè)發(fā)展有限公司)；二乙基二硫代氨基甲酸鈉(DDTC，AR，天津市東?；す?；二甲亞砜(DMSO，AR，廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開發(fā)中心)；偶氮二異丁腈(AIBN，AR，上海青析化工科技有限公司)；5,5-二硫代-2,2-二硝基苯甲酸(DTNB，AR，Sigma化學(xué)試劑有限公司)；三羥甲基氨基甲烷(Tris，AR，中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)有限公司)；其余試劑均為分析純。

2.2 合成與制備

2.2.1 光引發(fā)劑4-乙烯基芐基-N,N-二乙基二硫代氨基甲酸酯的合成

以對氯甲基苯乙烯(-CMS)和DDTC為原料，合成光引發(fā)劑4-乙烯基芐基-N,N-二乙基二硫代氨基甲酸酯(VBDC)[8]。

FT-IR(KBr)分析：914，985和1415 cm-1(CH=CH2)，1210和1485 cm-1(CS-N)；1H-NMR(CD3Cl)分析：7.322(4H, s, Ar-H)，6.637 ~ 6.685(H, q, Ar-CH=)，5.719~5.689和5.196~5.214(2H, d, CH2=)，4.517(2H, s, Ar-CH2)，3.637~3.675和3.982~4.017(4H, q, -N(CH2CH3)2)，1.239~1.263和1.208 ~ 1.227(6H, t, -N(CH2CH3)2)。

2.2.2 谷胱甘肽分子印跡聚合物MIPs的制備

稱取6.5 mg的GSH加入石英燒瓶中，加入20 mL溶劑使其充分溶解，再向其中加入一定量的4-VP，靜置2 h后，加入2 mL交聯(lián)劑EDMA和10.6 mg引發(fā)劑VBDC，在紫外光照下反應(yīng)10 h，期間一直保持N2氛圍，用甲醇/水/乙酸(70/25/5，v/v)混合液洗脫GSH分子直至洗脫液中檢測不到GSH為止，真空干燥后得到谷胱甘肽分子印跡聚合物(L-MIPs)。制備過程如圖1所示。

空白分子印跡聚合物(L-NIPs)的制備方法同上，但在制備過程中不加入模板分子GSH。

普通自由基聚合法制備谷胱甘肽分子印跡聚合物(H-MIPs)的方法同上，但在制備過程中選用AIBN作為引發(fā)劑，并采用水浴加熱65℃進(jìn)行聚合。空白分子印跡聚合物(H-NIPs)制備過程不加入模板分子，其余方法同上。

圖1 GSH分子印跡聚合物制備過程示意圖

2.3 谷胱甘肽分子印跡聚合物的吸附性能

2.3.1 靜態(tài)平衡吸附

準(zhǔn)確稱取多份一定量的MIPs和NIPs(每份約100 mg)，各自置于50 mL錐形瓶中，然后依次加入10 mL濃度為0.02~0.3 mg×mL-1的GSH水溶液，于25℃下振蕩吸附10 h，離心分離后，利用DTNB為顯色劑，采用紫外分光光度計測定上清液中GSH的濃度[9]，根據(jù)吸附前后溶液中GSH的濃度變化計算MIPs及NIPs的吸附量，如公式(1)所示。

式中為吸附量(mg×g-1)；0為吸附前溶液中GSH的濃度(mg×mL-1)；e為吸附后溶液中GSH的濃度(mg×mL-1)；為MIPs或NIPs的質(zhì)量(g)；為吸附溶液的體積(mL)。平行測定三次，取平均值。

印跡因子是表征印跡聚合物吸附特異性大小的物理量，越大表明特異性吸附越強，印跡效果就越好。如公式(2)所示。

式中MIPs和NIPs分別表示MIPs和NIPs的吸附量(mg×g-1)。

NIPs對GSH的吸附操作步驟同上。

2.3.2 吸附動力學(xué)研究

為了研究MIPs/NIPs的吸附動力學(xué)，分別各自稱取多份100 mg MIPs/NIPs置于錐形瓶中，加入10 mL濃度為0.2 mg×mL-1GSH溶液，25℃振蕩吸附，每隔10 min取樣測定MIPs/NIPs對GSH的吸附量，以研究MIPs/NIPs對GSH的吸附速率。

2.4 谷胱甘肽分子印跡聚合物的識別性能

稱取1.05 g MIPs裝入內(nèi)徑為10 mm的固相萃取柱中，其中填充柱的床體積(Bed Volume，BV)為2 mL，分別配制濃度為0.2 mg×mL-1GSH，GSSG和Gly-Gly三種溶液，以2 BV×h-1的流速逆流通過固相萃取柱，并以1 BV的間隔收集流出液，測定流出液中待測物質(zhì)的濃度，并繪制出動態(tài)結(jié)合曲線，利用流出液的濃度與床體積數(shù)，計算MIPs對三種待測物質(zhì)的泄漏吸附量與飽和吸附量，研究MIPs的選擇吸附性能。

3 結(jié)果與討論

3.1 模板分子GSH與功能單體4-VP間的相互作用

在預(yù)聚合過程中，功能單體-模板分子復(fù)合物的穩(wěn)定性是制備高性能印跡聚合物的關(guān)鍵。當(dāng)功能單體的用量較低時，聚合物無法形成完整的識別空穴，因而也無法實現(xiàn)功能單體與模板分子的多位點結(jié)合；相反，當(dāng)功能單體用量較高時，會導(dǎo)致功能單體過剩，致使印跡聚合物的非特異性吸附增強，降低了印跡聚合物的特異識別性能[10]。優(yōu)化模板分子與功能單體的摩爾配比，可以獲得較高選擇識別性能的印跡聚合物[11]。

利用Materials Studio 5.0軟件對不同摩爾比的GSH和4-VP進(jìn)行分子模擬。首先使用分子力學(xué)Forcite模塊COMPASS的力場對GSH-4-VP復(fù)合物幾何構(gòu)型的進(jìn)行了優(yōu)化，并計算出GSH和4-VP之間的相互作用能。經(jīng)Material Studio 5.0軟件進(jìn)行計算后結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同摩爾比的GSH與4-VP絡(luò)合物的能量值

由圖2可知，不同摩爾比的GSH和4-VP復(fù)合物的能量值隨著摩爾比的增加呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。這是由于GSH與4-VP形成的復(fù)合物中主要存在氫鍵、范德華力、靜電力等相互作用力，其中最主要的為氫鍵作用。隨著功能單體量的增加，這些作用力使得復(fù)合物的能量產(chǎn)生變化。當(dāng)GSH與4-VP的摩爾比為1:6時，復(fù)合物最穩(wěn)定，此時的能量最低。繼續(xù)加入功能單體導(dǎo)致復(fù)合物的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)被破壞，體系的能量升高。

計算機分子模擬是理論化計算的結(jié)果，為了驗證結(jié)果的準(zhǔn)確性，進(jìn)一步采用紫外分光光度計法測定不同摩爾比的GSH和4-VP的紫外吸收光譜，實驗發(fā)現(xiàn)隨著4-VP使用量的增加，GSH-4-VP復(fù)合物的紫外吸收不斷向長波方向移動，當(dāng)兩者的摩爾比為1:6時紅移量最大，繼續(xù)加入4-VP后反而開始向左移動。說明GSH與4-VP的摩爾比為1:6時，兩者的氫鍵作用最大，為最佳摩爾比。這一結(jié)果與分子模擬結(jié)果一致。

3.2 溶劑的選擇

本研究采用DMSO，MeCN/DMSO(1/1，v/v)和EtOH/H2O(9/1，v/v)三種不同的溶液作為溶劑，分別制備了相應(yīng)的L-MIPs和L-NIPs。其中L-MIPs1、L-NIPs1、L-MIPs2和L-NIPs2均為塊狀聚合物，并且其MIPs表面比相應(yīng)的NIPs表面更加粗糙，同時還可以看到MIPs表面存在大量的小孔，這有利于模板分子在識別過程中的傳質(zhì)，因此擁有較高的印跡因子(見表1)。從圖3還可以看到L-MIPs3和L-NIPs3均為類球狀聚合物，并且L-MIPs3的平均粒徑明顯高于L-NIPs3，這可能是由于模板分子在印跡過程中影響了聚合物鏈段的增長，其次GSH的模板作用可導(dǎo)致印跡聚合物內(nèi)部有孔道存在，同樣可以促使印跡聚合物的粒徑增大。

表1 不同溶劑對L-MIPs比表面積、孔體積、平均孔徑及吸附性能的影響

由表1還可以看出，DMSO為溶劑時制備的L-MIPs1和L-NIPs1比表面積差值和孔體積差值較大，這主要是由于印跡聚合物的表面及內(nèi)部存在大量的印跡孔穴，說明模板分子在印跡聚合物中起到了顯著的印跡效果，且結(jié)合性能也最為優(yōu)良。另外，L-MIPs3比表面積雖然較大，但其結(jié)合性能卻最差，這可能是由于其類球狀的形貌使得其比表面積相對較大，但L-MIPs3在印跡過程中存在大量的水，影響了模板分子與功能單體的相互作用，同時聚合物間相互團聚，減少了L-MIPs3中特異性識別位點，造成GSH的印跡因子較小，結(jié)合性能較差。綜合分析表明，DMSO是制備識別性能優(yōu)良L-MIPs的最佳溶劑。

圖3 不同溶劑制備的分子印跡聚合物SEM圖

3.3 L-MIPs和H-MIPs的識別性能

3.3.1 谷胱甘肽分子印跡聚合物的吸附等溫線

圖4為MIPs和NIPs對GSH的吸附等溫線。由圖4可看出，隨著GSH濃度的增加，L-MIPs和H-MIPs的吸附量均出現(xiàn)不同程度的增長，其飽和吸附量分別達(dá)到29.6和18.8 mg×g-1，明顯高于L-NIPs和H-NIPs對GSH的吸附量。這種現(xiàn)象說明在印跡過程中，GSH與4-VP之間通過相互作用在MIPs上產(chǎn)生了印跡孔穴和結(jié)合位點，決定了MIPs對GSH的高度親合力，而NIPs表面沒有印跡孔穴和印跡位點，只限于微球表面產(chǎn)生的非特異性吸附，因此吸附能力較低[12]。另外，在相同濃度下，L-MIPs對GSH的吸附量明顯高于H-MIPs，表明活性Iniferter自由基聚合法制備的印跡聚合物相比于普通自由基法可得到更多的印跡孔穴和識別位點，可有效改善對模板分子的識別性能。這可能是由于Iniferter自由基聚合法制備的L-MIPs擁有較為均勻的交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可以形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的印跡空穴和結(jié)合位點，因此對模板分子有較強的識別效果[13~15]。