BMMSCs在溫敏性玻璃微載體上的培養(yǎng)及收獲

宋克東, 楊延飛, 武 爽, 李麗穎, 閆新宇, 劉天慶

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BMMSCs在溫敏性玻璃微載體上的培養(yǎng)及收獲

宋克東, 楊延飛, 武 爽, 李麗穎, 閆新宇, 劉天慶

(精細(xì)化工國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 大連理工大學(xué) 干細(xì)胞與組織工程研究室, 遼寧 大連 116024)

貼壁型種子細(xì)胞的培養(yǎng)和收獲，常在二維靜態(tài)的培養(yǎng)環(huán)境下進(jìn)行，而后采用酶解法或機(jī)械刮刀法來(lái)進(jìn)行收獲，但是其存在著一定的弊端，細(xì)胞擴(kuò)增數(shù)量有限且在收獲時(shí)細(xì)胞易受到損傷，同時(shí)也會(huì)失去一定的干性。論文研究整合了具有較大比表面積和三維立體環(huán)境的微載體，及溫敏性材料無(wú)損收獲細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)，采用表面自由基共聚合方法，用3-丙基三甲氧基硅烷甲基丙烯酸TMSPM為偶聯(lián)劑，在微載體表面接枝上-異丙基丙烯酰胺NIPAAm(N-isopropylacrylamide)及甲基丙烯酸羥基丙基酯(Hydroxypropyl methacrylate, HPM)，制備出P(NIPAAmHPM)TMSPM-微載體。其次，將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSCs)接種在制備的溫敏性玻璃微載體上，通過(guò)細(xì)胞的培養(yǎng)與降溫收獲考察制備的溫敏性微載體是否適宜細(xì)胞的降溫脫附及其細(xì)胞相容性。掃描電鏡及能譜分析表明溫敏材料NIPAAm可成功地接枝到含硅羥基的玻璃微載體表面。BMMSCs的粘附和生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果證明材料具有較好的生物相容性，降溫收獲后細(xì)胞的活性對(duì)比及再培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明細(xì)胞可很好的從載體上脫附，并保持良好的生長(zhǎng)活性。

-異丙基丙烯酰胺；溫敏性玻璃微載體；表面自由基共聚合；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；降溫脫附

1 前 言

在生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域的研究當(dāng)中，大量種子細(xì)胞的獲取往往需要通過(guò)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)和收獲來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中受到廣泛研究的脂肪干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞等都是貼壁生長(zhǎng)型的細(xì)胞，它們?cè)隗w外培養(yǎng)時(shí)需要粘附到材料表面生長(zhǎng)，貼壁牢固，而消化收獲的時(shí)候則要借助于蛋白酶酶解法或者物理方法如機(jī)械刮刀法。隨著貼壁型干細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)反復(fù)的消化收獲，干細(xì)胞的干性也逐漸減弱[1~3]，有研究認(rèn)為其原因在于多次酶解消化[4]。除此，傳統(tǒng)的二維靜態(tài)培養(yǎng)平面，由于生長(zhǎng)空間有限且營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)傳質(zhì)效果較差，難以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的大規(guī)模擴(kuò)增。因此，需要尋求一種方法來(lái)改善細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境，同時(shí)減小細(xì)胞收獲時(shí)的傷害。

近年來(lái)，溫敏性材料PNIPAAm得到了廣泛的研究，其可以替代傳統(tǒng)的方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行有效的回收。該材料是由Okano團(tuán)隊(duì)首次研發(fā)出來(lái)，其將LCST在32℃左右、非常接近于人體生理溫度的PNIPAAm應(yīng)用于細(xì)胞的培養(yǎng)和非酶解收獲研究中[5]，掀起了以PNIPAAm為主體的溫敏性聚合物的研究及應(yīng)用熱潮。對(duì)此，相關(guān)研究[6~8]也揭示了貼壁細(xì)胞在溫敏材料表面的粘附和脫附的機(jī)制。Canavan團(tuán)隊(duì)[9]對(duì)從PNIPAAm表面收獲的細(xì)胞片層及細(xì)胞脫附后的PNIPAAm表面上LN、FN以及CollI和CollIV的殘留情況做了檢測(cè)，結(jié)果表明降溫法收獲的細(xì)胞連同細(xì)胞外基質(zhì)蛋白一起從培養(yǎng)基底上脫附，其中FN和LN在培養(yǎng)表面幾乎沒(méi)有殘留，都隨細(xì)胞脫附，而膠原蛋白在培養(yǎng)表面有少量殘留，表明了該材料的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。Aniket等[10]研究了NIPAAm單體和PNIPAAm顆粒在0.1~10 mg×mL-1濃度范圍內(nèi)對(duì)成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞毒性，結(jié)果表明PNIPAAm具有良好的細(xì)胞相容性。1967年VanWezel[11]提出了“微載體”培養(yǎng)系統(tǒng)的新技術(shù)概念，使貼壁依賴性細(xì)胞高產(chǎn)培養(yǎng)成為可能，其表現(xiàn)出很多顯著的優(yōu)點(diǎn)[12,13]，如比表面較大、細(xì)胞所處環(huán)境類似于體內(nèi)三維立體環(huán)境、傳代操作簡(jiǎn)單、擴(kuò)增效率高等，成為當(dāng)前貼壁細(xì)胞培養(yǎng)的理想載體。

將PNIPAAm和微載體進(jìn)行結(jié)合來(lái)制備溫敏微載體的研究仍處于起步階段，Yang等[14]在2009年通過(guò)末端含有羧基的PNIPAAm聚合物與表面富含氨基的Cytodex-3 (R)微載體縮合，制備了溫敏性微載體，借助于三維生物反應(yīng)器考察了制備的微載體用于非洲綠猴腎細(xì)胞的連續(xù)培養(yǎng)和非酶解收獲，結(jié)果表明細(xì)胞在溫敏性微載體上的粘附生長(zhǎng)狀況與其在Cytodex微載體上的狀況沒(méi)有差別，并且溫敏組的細(xì)胞通過(guò)降低溫度便可從微載體上脫附；2010年Yang等[15]又將該溫敏性微載體結(jié)合三維生物反應(yīng)器用于人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMMSCs)的培養(yǎng)和非酶解收獲，結(jié)果表明溫敏性微載體上的細(xì)胞經(jīng)32℃培養(yǎng)基孵育10 min便可從微載體上脫附，脫附率達(dá)82.5%，與胰酶消化法相比，溫敏消化法能明顯減少細(xì)胞的凋亡和死亡、簡(jiǎn)化細(xì)胞消化過(guò)程、減少消化過(guò)程對(duì)ECM的損傷。相比Cytodex-3等常用的微載體，玻璃微載體除了具有良好的生物相容性外，還具有優(yōu)良的介孔結(jié)構(gòu)、機(jī)械性能和表面可多功能修飾等優(yōu)勢(shì)，但是對(duì)于在其表面進(jìn)行溫敏性修飾的報(bào)道仍很少。

本文將先在玻璃微載體表面修飾上碳碳雙鍵，然后采用表面自由基共聚合的方法，用3-丙基三甲氧基硅烷甲基丙烯酸TMSPM為偶聯(lián)劑，在微載體表面接枝上NIPAAm及甲基丙烯酸羥基丙基酯(Hydroxypropyl methacrylate，HPM)，制備出P(NIPAAm--HPM)--TMSPM--微載體。并對(duì)聚合物表面做了表征；其次，將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSCs)接種在制備的溫敏性玻璃微載體上，通過(guò)細(xì)胞的培養(yǎng)與降溫收獲考察制備的溫敏性微載體是否適宜細(xì)胞的降溫脫附及其細(xì)胞相容性，為在本實(shí)驗(yàn)室的旋轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器(RWVB)中大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 材料

主要的藥品和試劑包括：NIPAAm(純度 > 98%，上海物競(jìng)化工科技有限公司)；HPM(分析純，Aldrich)；AIBN(純度>98%，上海物競(jìng)化工科技有限公司)；玻璃微載體(G102-1521，equl公司)；LG-DMEM(SIGMA)；胎牛血清(Hyclone)；胰蛋白酶(GIBCO)；FITC標(biāo)記美國(guó)倉(cāng)鼠抗大鼠的CD29(Biolegend)；FITC標(biāo)記小鼠抗大鼠的CD45(Biolegend)；FITC標(biāo)記小鼠抗大鼠CD13 Biolegend)；CCK-8 Kit(日本同仁化學(xué)研究所)；鈣黃綠素(SIGMA)；碘化丙啶(SIGMA)。主要的實(shí)驗(yàn)設(shè)備：冷凍干燥機(jī)(ALPHA 1-2/LD，美國(guó))；傅里葉變換紅外光譜儀(Nicolet Magna 750，美國(guó))；掃描電鏡(JSM-5600LV，日本)；倒置顯微鏡(IX70-131，日本)；顯微攝像、圖象分析系統(tǒng)(SONYDXC-390P/CMS800，美國(guó))；流式細(xì)胞儀(BDFACSantoTM，德國(guó))；酶標(biāo)儀(ELx800，美國(guó))。

2.2 溫敏性玻璃微載體的制備

藥品的預(yù)處理：參照本實(shí)驗(yàn)室楊磊博士的論文[16]，對(duì)NIPAAm和HPM進(jìn)行重結(jié)晶，置于4℃冰箱中備用；將1份雙氧水加入到3份的濃硫酸中，并用磁力攪拌子攪拌配置成Piranha溶液，待溶液冷卻后，存放于廣口瓶中備用；將玻璃微載體放入1:1的甲醇/鹽酸溶液中浸泡30 min，然后用大量的去離子水沖洗微載體，待微載體干燥后，將其放入Piranha溶液中80℃下加熱1 h活化微載體表面的羥基，然后用大量的超純水沖洗微載體，收集微載體，氮?dú)獯蹈?，密封保存。本文中以?jīng)過(guò)Piranha溶液的處理微載體作為對(duì)照組微載體。

制備的示意圖如圖1所示，具體的步驟如下。

用TMSPM修飾微載體：在燒杯中用95%的乙醇及5%的水配成醇-水溶液，加入醋酸將pH調(diào)為4左右。攪拌下加入一定體積的TMPSM，水解5 min后，即生成含Si-OH的水解物。將活化好的微載體 (圖1A) 加入燒杯中，稍許攪動(dòng)，反應(yīng)完成后收集產(chǎn)品，用乙醇漂洗 2 次，然后干燥。將干燥固化后的微載體記為TMSPM微載體(圖1B)。

微載體表面的自由基共聚合反應(yīng)：將0.1 g的TMSPM修飾的微載體放入50 mL三口燒瓶中，加入一定量的NIPAAm和HPM (NIPAAm摩爾量的5%)，以10 mL 四氫呋喃溶液為溶劑，通入氮?dú)馀叛鯕?0 min后，加入引發(fā)劑AIBN ((NIPAAm + HPM)摩爾總量的1%)，磁力攪拌，氮?dú)獗Ｗo(hù)下60oC水浴冷凝回流反應(yīng)12 h。將得到的接枝組微載體用大量的四氫呋喃和超純水清洗，以除去未反應(yīng)的單體及未接枝到微載體表面的聚合物，從而得到溫敏玻璃微載體 (圖1C)。

2.3 溫敏性玻璃微載體的表征

通過(guò)ATR-FTIR對(duì)微載體表面元素組成進(jìn)行分析；其次，將要觀察的微載體固定在粘有導(dǎo)電膠帶的樣品臺(tái)上，將樣品臺(tái)真空噴金，置于SEM下，選擇合適的放大倍數(shù)拍攝掃描照片，加速電壓為20 kV。

2.4 BMMSCs的細(xì)胞免疫抗原鑒定

參考文獻(xiàn)[16]對(duì)分離培養(yǎng)至第4代的BMMSCs，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行表面抗原表達(dá)的檢測(cè)，用BDFACSDiva軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。未經(jīng)標(biāo)記的細(xì)胞作為空白對(duì)照。

2.5 BMMSCs在為載體上的接種和培養(yǎng)

微載體的預(yù)處理：先用PBS浸泡，然后120℃、高壓滅菌20 min，在無(wú)菌條件下用培養(yǎng)基置換掉PBS，并將微載體密度調(diào)節(jié)為35 mg×mL-1，在4℃冰箱保存?zhèn)溆谩⑴囵B(yǎng)至第4代的BMMSCs用細(xì)胞消化液消化成單細(xì)胞懸液，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為4.8×105cells×mL-1，然后取2 mL細(xì)胞懸液加入到二甲基二氯硅烷處理好的培養(yǎng)瓶中，再加入1 mL微載體懸液，使最終細(xì)胞密度為3.2×105cells×mL-1，然后將細(xì)胞在37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行靜態(tài)培養(yǎng)，每隔三天換液，換液時(shí)，使培養(yǎng)瓶?jī)A斜一定角度并靜置，待微載體沉降后，小心地用移液槍進(jìn)行換液。

2.6 BMMSCs在微載體上黏附曲線的測(cè)定

為了考察所制備的微載體對(duì)細(xì)胞粘附情況的影響，還測(cè)定了細(xì)胞在微載體上隨時(shí)間的黏附率，具體方法為：分別于細(xì)胞接種在微載體上0.5、1、2、4、8、18、24 h后吸出培養(yǎng)液，對(duì)培養(yǎng)液中的細(xì)胞用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，算出未黏附的細(xì)胞數(shù)(1)，繼而計(jì)算出細(xì)胞黏附率()。細(xì)胞黏附率的計(jì)算公式如下所示：

公式中0為培養(yǎng)瓶中接種的細(xì)胞總數(shù)。

2.7 BMMSCs在微載體上生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)選取了在相同的細(xì)胞接種密度(3.2×105cells×mL-1)下來(lái)考察不同微載體培養(yǎng)表面對(duì)細(xì)胞增殖的影響。測(cè)定BMMSCs在微載體上培養(yǎng)的生長(zhǎng)曲線時(shí)，將細(xì)胞和微載體在培養(yǎng)瓶中靜態(tài)培養(yǎng)，細(xì)胞接種在微載體上的當(dāng)天定為第0 d，之后每隔24 h從培養(yǎng)瓶中取出100 μL培養(yǎng)液，以未接種細(xì)胞的培養(yǎng)液作為空白對(duì)照，加入10 μL無(wú)菌CCK-8 試劑，將孔板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育3 h后在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)各孔在450 nm 處的吸光度值，獲得細(xì)胞在兩種微載體表面的生長(zhǎng)曲線。參比波長(zhǎng)為630 nm，每組設(shè)置3個(gè)平行對(duì)照。連續(xù)測(cè)試7 d。

2.8 收獲的BMMSCs的再培養(yǎng)

采用降溫脫附法處理微載體上粘附的細(xì)胞后，用細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾微載體，收集細(xì)胞懸液，將收集的BMMSCs懸液離心富集，用新鮮培養(yǎng)基重新接種在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，轉(zhuǎn)移至37℃ 細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞鋪展?fàn)顟B(tài)并拍照。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用OriginPro 8.5軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果。用-檢驗(yàn)確定顯著性水平，當(dāng)< 0.05時(shí)視為有顯著性差異。

3 結(jié) 果

3.1 溫敏性微載體的表觀形貌

圖2和圖3分別展示了接枝前后微載體的表面顏色變化及表觀形貌。從圖2可以看出，經(jīng)接枝處理后的微載體顏色由原來(lái)的略微透明的棕色變?yōu)榘咨?經(jīng)TMSPM處理的微載體與經(jīng)Piranha洗液處理的微載體顏色無(wú)變化)。圖3中，SEM照片展示了接枝前后微載體表面的形貌，由圖可以看出經(jīng)Piranha洗液處理后的微載體表面光滑，顏色均一；經(jīng)過(guò)TMSPM處理的微載體表面稍有變化，粗糙度有所增加；經(jīng)接枝處理后微載體表面多出許多小丘狀突起，形貌及大小不一。微載體表面顏色及形貌的變化間接地表明接枝處理前后微載體表面性質(zhì)的改變。

圖 2 微載體的照片

圖 3 微載體的SEM照片

3.2 溫敏性微載體的紅外圖譜及能譜分析

圖4展示了經(jīng)1.5% (v/v)TMSPM處理的微載體和接枝組微載體的漫反射紅外譜圖。從圖中難以看出接枝NIPAAm前后微載體表面有機(jī)官能團(tuán)的變化。對(duì)所制備微載體表面有機(jī)物的表征，還嘗試了ATR-FTIR和拉曼光譜，但是對(duì)照組微載體、TMSPM-g-微載體及接枝組微載體三者的圖譜都沒(méi)有明顯區(qū)別，這一方面可能是因?yàn)槲⑤d體表面有機(jī)物接枝量較少，難以檢測(cè)；另一方面本實(shí)驗(yàn)中微載體是聚苯乙烯球外面包裹一層薄的玻璃球殼、直徑在125~212 μm的小球，樣品本身的材質(zhì)和尺寸決定了檢測(cè)的難度。

圖 4 對(duì)照組微載體和接枝組微載體的漫反射紅外圖譜比較

所以，需借助環(huán)境掃描電子顯微鏡結(jié)合能譜分析對(duì)接枝樣品表面的C、N、O、Si進(jìn)行了定性和定量分析，結(jié)果如表 1 所示，接枝組微載體表面檢測(cè)出了C、O、Si、N三種元素，對(duì)N元素進(jìn)行強(qiáng)制標(biāo)記后顯示N元素的原子百分含量為1.35%，與未接枝組相比，可說(shuō)明NIPAAm已成功接枝到微載體表面。

表 1 接枝組微載體表面 EDS 能譜分析