響應(yīng)面法優(yōu)化假單胞菌產(chǎn)胞外多糖發(fā)酵培養(yǎng)基

王曉霞，趙　晨，趙祥穎，劉建軍，*，張家祥

（1.齊魯工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250353；2.山東省食品發(fā)酵工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250013）

響應(yīng)面法優(yōu)化假單胞菌產(chǎn)胞外多糖發(fā)酵培養(yǎng)基

王曉霞1，趙晨2，趙祥穎2，劉建軍1，2*，張家祥2

（1.齊魯工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250353；2.山東省食品發(fā)酵工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250013）

采用響應(yīng)面法對(duì)假單胞菌（Pseudomonassp.）FJY5-13生產(chǎn)胞外多糖的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。通過Plackett-Burman試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)及Box-Behnken試驗(yàn)構(gòu)建回歸方程，結(jié)果表明，最佳發(fā)酵培養(yǎng)基成分為甘油83.0 g/L、酵母浸粉5.7 g/L、NaCl 8.2 g/L、檸檬酸鈉5 g/L、（NH4）2SO41 g/L、玉米漿粉7.5 g/L，在此條件下，胞外多糖的產(chǎn)量為10.50 g/L，約為優(yōu)化前多糖產(chǎn)量7.9 g/L的1.3倍。

假單胞菌；胞外多糖；響應(yīng)面；發(fā)酵培養(yǎng)基；優(yōu)化

微生物胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）是微生物在生長(zhǎng)過程中為適應(yīng)周圍環(huán)境的變化產(chǎn)生的對(duì)自身具有保護(hù)作用的生物高聚物［l］。微生物代謝產(chǎn)物對(duì)人類生存發(fā)展具有重大意義，它能夠提高動(dòng)物、植物本身的免疫力，不僅是保護(hù)細(xì)胞免受外界環(huán)境的屏障，也是細(xì)菌細(xì)胞的識(shí)別分子［2］。微生物胞外多糖因其獨(dú)特的理化性質(zhì)，已發(fā)展成為一類新型的發(fā)酵產(chǎn)品，目前已作為增稠劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、保濕劑、膠凝劑、懸浮劑等廣泛應(yīng)用于石油、化工、食品和制藥等多個(gè)領(lǐng)域［3-4］。野油菜黃單胞菌（Xanthomonas campestris）分泌得到的大分子多糖具有獨(dú)有的高黏性、增稠性及流變特性，使其廣泛應(yīng)用于食品、紡織、印染等領(lǐng)域［5］。MATSUDA M等［6］研究表明，假單胞菌屬中的Pseu domonassp.產(chǎn)生的硫酸鹽多聚糖（sulfate polysaccharide）能夠明顯的增強(qiáng)小鼠的免疫力，表明了該多糖具有抗癌活性。胞外多糖特有的抗氧化、抗癌及抗腫瘤特性［7］，因此其具有潛在的藥用價(jià)值。

響應(yīng)面優(yōu)化可以通過擬合回歸方程以構(gòu)建連續(xù)變量曲面預(yù)測(cè)模型，從而能夠?qū)τ绊戫憫?yīng)的不同因子水平及其交互作用進(jìn)行優(yōu)化和評(píng)價(jià)，所需試驗(yàn)次數(shù)較少，因此被成功地應(yīng)用于各種優(yōu)化過程中［8-10］。前期工作從高鹽、高滲環(huán)境中分離篩選到一株假單胞菌（Pseudomonassp.），本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用Plackett-Burman試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)及Box-Behnken試驗(yàn)［11-13］對(duì)該菌株產(chǎn)胞外多糖的最佳培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，進(jìn)一步提高了假單胞菌胞外多糖的發(fā)酵產(chǎn)率。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種

假單胞菌（Pseudomonassp.）FJY5-13：由山東省食品發(fā)酵工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室篩選保存。

1.1.2培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：甘油50 g/L，檸檬酸鈉5 g/L，酵母浸粉5g/L，玉米漿干粉7.5g/L，（NH4）2SO41g/L，NaCl5g/L，瓊脂15 g/L，pH值為7.0。

液體種子培養(yǎng)基：甘油50 g/L，檸檬酸鈉5 g/L，酵母浸粉5 g/L，玉米漿干粉7.5 g/L，（NH4）2SO41 g/L，NaCl 5 g/L，pH值為7.0。

搖瓶/基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：甘油80 g/L，檸檬酸鈉5 g/L，酵母浸粉5 g/L，玉米漿干粉7.5 g/L，（NH4）2SO41 g/L，NaCl 5 g/L，pH值為7.0。

1.1.3試劑

甘油、硫酸銨（（NH4）2SO4）、檸檬酸鈉、苯酚、氯化鈉（NaCl）、質(zhì)量分?jǐn)?shù)95%濃硫酸（均為分析純）：天津市化學(xué)試劑三廠；酵母浸粉（總氮≥10%）：安琪酵母股份有限公司；瓊脂條、玉米漿干粉：山東西王集團(tuán)淀粉廠。

1.2儀器與設(shè)備

BS124S電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；HH 600數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國(guó)華電器有限公司；7200型紫外分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；HV-110高壓滅菌鍋：日本Hirayama公司；QYC-211臥式恒溫（全溫）雙層培養(yǎng)搖床：上海新苗實(shí)驗(yàn)儀器。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1培養(yǎng)方法

種子活化：將假單胞菌接種到斜面培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)，12 h。

種子培養(yǎng)：在500 mL錐形瓶中裝入液體種子培養(yǎng)基50 mL，在121℃條件下，滅菌20 min，從斜面培養(yǎng)基挑去一環(huán)活化好的假單胞菌接入后進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，30℃、180r/min振蕩培養(yǎng)9 h。

搖瓶培養(yǎng)：在500 mL錐形瓶中裝入搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基50 mL，將種子液按4%接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)72 h。

1.3.2胞外多糖產(chǎn)量的測(cè)定［l4］

發(fā)酵液經(jīng)16 000 r/min離心15 min去除菌體，取上清液加入乙醇醇沉得到沉淀，將沉淀用去離子水溶解，吸取1mL樣品溶解液，加入1 mL蒸餾水，1 mL 5%苯酚和5 mL 95%濃硫酸，靜置10 min，搖勻，室溫下靜置20 min，在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定其吸光度值，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程（y=0.007 8x+0.001 9，R2=0.996 4）計(jì)算得到多糖產(chǎn)量。

1.3.3Plackett-Burman設(shè)計(jì)

在前期單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基中的6個(gè)主要因素進(jìn)行全面考察，每個(gè)因素取高低2個(gè)水平，高水平約為低水平的1.5倍［15］，Plackett-Burman試驗(yàn)因素與水平如表1所示。

表1　Plackett-Burman試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments g/L

1.3.4最陡爬坡試驗(yàn)

通過對(duì)Plackett-Burman設(shè)計(jì)的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，確定主要因子，根據(jù)回歸方程各因子的系數(shù)來確定主要因子的爬坡路徑和步長(zhǎng)［16］，得到響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)，即各個(gè)顯著因素的最佳質(zhì)量濃度，確定最大響應(yīng)值的區(qū)域。

1.3.5響應(yīng)面分析試驗(yàn)方法

Plackett-Burman設(shè)計(jì)確定影響假單胞菌胞外多糖產(chǎn)量的3個(gè)主要因素，最陡爬坡試驗(yàn)確定3個(gè)主要因素響應(yīng)區(qū)域的中心點(diǎn)，運(yùn)用Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，從3個(gè)主要因素的響應(yīng)區(qū)域各取3水平，設(shè)計(jì)3因素3水平試驗(yàn)進(jìn)行響應(yīng)面的分析，從而獲得菌株高產(chǎn)胞外多糖的培養(yǎng)基組成。

2　結(jié)果與分析

2.1Plackett-Burman試驗(yàn)

按照N=6的Plackett-Burman設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，每組進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，搖瓶發(fā)酵3 d，以胞外多糖的產(chǎn)量為其響應(yīng)值。Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示，各個(gè)因素的效應(yīng)及顯著性如表3所示。

表2　Plackett-Burman設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Plackett-Burman

表3　Plackett-Burman試驗(yàn)顯著因子分析Table 3 Analysis of significant factors of Plackett-Burman experiments

由表3可知，在發(fā)酵培養(yǎng)基中，甘油，酵母浸粉，NaCl及（NH4）2SO4表現(xiàn)為正效應(yīng)，玉米漿粉、檸檬酸鈉表現(xiàn)為負(fù)效應(yīng)。由P值的大小可知，發(fā)酵培養(yǎng)基中各因素對(duì)菌株發(fā)酵生產(chǎn)胞外多糖影響的重要性排序?yàn)镈＞A＞E＞F＞C＞B，即酵母浸粉＞甘油＞NaCl＞檸檬酸鈉＞（NH4）2SO4＞玉米漿粉，顯著性影響（P＜0.05）的因素有酵母浸粉、甘油和NaCl。因此，選擇甘油、酵母浸粉和NaCl作為顯著因素進(jìn)行下一步的試驗(yàn)。

2.2最陡爬坡試驗(yàn)確定試驗(yàn)因素水平的中心點(diǎn)

根據(jù)Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選出顯著因素及效應(yīng)大小的比例設(shè)定它們的變化步長(zhǎng)，最快的逼近最佳值區(qū)域［13］。最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果如表4所示。

表4　最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table 4 Design and results of the steepest ascent path experiments

由表4可知，第2組試驗(yàn)胞外多糖產(chǎn)量最大，即甘油85 g/L，酵母浸粉5.5 g/L，NaCl 8.5 g/L時(shí)胞外多糖產(chǎn)量達(dá)到最大值，因此以此為中心點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)分析。

2.3Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與響應(yīng)面試驗(yàn)分析

由上述2.2節(jié)確定了顯著因子的最佳濃度范圍，根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，在主要因素的響應(yīng)區(qū)取3個(gè)水平，運(yùn)用軟件Design-Expert V8.0.6軟件設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，每個(gè)試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)，Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平如表5所示，響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表6，回歸方程的方差分析結(jié)果見表7。

表5　Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Table 5 Factors and levels of Box-Behnken experiments

根據(jù)Box-Behnkon試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)，獲得15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，該15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)可以分為2類：一是析因點(diǎn)，自變量取值在X1、X2和X3所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，共12個(gè)析因點(diǎn)；二是零點(diǎn)，為區(qū)域的中心點(diǎn)，零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)3次，用以估計(jì)試驗(yàn)誤差［17］。根據(jù)表6試驗(yàn)結(jié)果，運(yùn)用Design-Expert V 8.0.6軟件對(duì)其進(jìn)行多元回歸擬合方差分析，擬合得到的回歸方程為：

由表7可知，在回歸模型中，因素X12、X22、X32表現(xiàn)影響極其顯著（P＜0.01），X1表現(xiàn)影響顯著（P＜0.05），失擬項(xiàng)的P值0.260 3＞0.05，影響不顯著，表明了試驗(yàn)誤差很小，其他未知因素對(duì)該試驗(yàn)影響極小。決定系數(shù)R2為0.974 3＞0.9，說明模型達(dá)到了較好的擬合程度［18］，調(diào)整后的R2adj=0.944 1說明了回歸方程中自說明了回歸方程中自變量可以94.41%的解釋胞外多糖的結(jié)果，變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）為5.05%＜10%，信噪比（signal to noise ratio，SNR）為13.38＞4.0，說明了該方程的相關(guān)性良好，試驗(yàn)穩(wěn)定，可信度高，也從側(cè)面說明了回歸方程的擬合性很好。

表6　響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Design and results of response surface methodology

表7　回歸方程的方差分析Table 7 Variance analysis of regression equation

2.4響應(yīng)面交互作用結(jié)果分析［19］

固定其中的一個(gè)因素，利用軟件Design-Expert做另外兩個(gè)因素交互作用的曲面圖及等高線圖，確定甘油、酵母浸粉及氯化鈉濃度對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響結(jié)果見圖1。

圖1　甘油、酵母浸粉和NaCl交互作用對(duì)胞外多糖產(chǎn)量影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig.1 Response surface plots and contour line of effects of interaction between glycerinum，yeast extract powder and NaCl on polysaccharide yield

由圖1可知，甘油濃度、酵母浸粉濃度、氯化鈉濃度相互作用對(duì)假單胞菌胞外多糖產(chǎn)量的影響均出現(xiàn)拋物面型關(guān)系，所得到的響應(yīng)面都存在一個(gè)極大值點(diǎn)。其中甘油濃度與酵母浸粉濃度之間的交互作用最為明顯。

2.5最佳培養(yǎng)基濃度的預(yù)測(cè)與驗(yàn)證

經(jīng)過響應(yīng)面法優(yōu)化，軟件Design-Expert分析得到的假單胞菌產(chǎn)胞外多糖的最佳培養(yǎng)基成分為甘油83.26 g/L、酵母浸粉5.72 g/L、NaCl 8.24 g/L，在此條件下，理論所得到的胞外多糖產(chǎn)量為10.32 g/L。

為了驗(yàn)證所得到的最佳培養(yǎng)基組成是否可靠，同時(shí)考慮了實(shí)際操作的可行性，將培養(yǎng)基成分調(diào)整為甘油83.0g/L、酵母浸粉5.7 g/L、NaCl 8.2 g/L，進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，得到胞外多糖的平均產(chǎn)量為10.50 g/L，與預(yù)測(cè)值接近，約為優(yōu)化之前的最高產(chǎn)量7.9 g/L的1.3倍，進(jìn)一步說明該模型能夠很好地預(yù)測(cè)實(shí)際的發(fā)酵情況。

3　結(jié)論

本研究通過Plackett-Burman試驗(yàn)快速有效的從6個(gè)影響因素確定甘油、酵母浸粉和NaCl為影響胞外多糖發(fā)酵的主要因素，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)，逼近最大響應(yīng)面區(qū)域，然后采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定了3種主要影響因素的質(zhì)量濃度經(jīng)過驗(yàn)證試驗(yàn)，該菌種生產(chǎn)胞外多糖的最佳培養(yǎng)基成分為甘油83.0 g/L，酵母浸粉5.7 g/L，NaCl 8.2 g/L，檸檬酸鈉5 g/L，玉米漿粉7.5 g/L，（NH4）2SO41 g/L，在此條件下，胞外多糖的產(chǎn)量高達(dá)10.50 g/L，約為基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵得到的胞外多糖產(chǎn)量7.90g/L的1.3倍。這表明響應(yīng)面法在培養(yǎng)基優(yōu)化方面具有一定的指導(dǎo)作用。

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Optimization of fermentation medium of exopolysaccharide-producingPseudomonassp. by response surface methodology

WANG Xiaoxia1，ZHAO Chen2，ZHAO Xiangying2，LIU Jianjun1，2*，ZHANG Jiaxiang2
（1.College of Food and Biological Engineering，QiLu University of Technology，Jinan 250353，China；2.Food&Fermentation Engineering Key Laboratory of Shandong Province，Jinan 250013，China）

The fermentation medium of exopolysaccharide-producingPseudomonassp.FJY5-13 was optimized by response surface methodology.The regression equation was established by Plackett-Burman，the steepest ascent path and Box-Behnken experiments.The results showed the optimum fermentation medium components were as followed：glycerin 83.0 g/L，yeast extract 5.7 g/L，NaCl 8.2 g/L，sodium citrate 5 g/L，（NH4）2SO41g/L and corn steep powder 7.5 g/L.Under the conditions，exopolysaccharide yield was10.50 g/L，which was1.3 timeshigher than thatbefore optimization（7.9 g/L）.

Pseudomonassp.；exopolysaccharide；response surface methodology；fermentation medium；optimization

Q939

0254-5071（2016）03-0080-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.03.018

2015-12-30

山東省科技發(fā)展計(jì)劃（2014GSF121038）

王曉霞（1986-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸锛夹g(shù)及應(yīng)用。

劉建軍（1962-），男，研究員，博士，研究方向?yàn)槲⑸锛夹g(shù)及應(yīng)用。