茅臺(tái)地區(qū)醬香型酒糟中高溫細(xì)菌的分離鑒定

周　蓮，陳　莉*，盧紅梅，莫柳勤，徐　碩

（1.貴州大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，貴州 貴陽 550003；2.貴州大學(xué) 食品與釀酒工程學(xué)院，貴州 貴陽 550003；3.貴州大學(xué) 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550003）

茅臺(tái)地區(qū)醬香型酒糟中高溫細(xì)菌的分離鑒定

周蓮1，3，陳莉2，3*，盧紅梅2，3，莫柳勤2，3，徐碩2，3

（1.貴州大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，貴州 貴陽 550003；2.貴州大學(xué) 食品與釀酒工程學(xué)院，貴州 貴陽 550003；3.貴州大學(xué) 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550003）

從茅臺(tái)地區(qū)醬香型酒糟中分離篩選出耐高溫菌株DX和XX，檢測其生理生化特征，并進(jìn)行16S rDNA序列分析。結(jié)果表明，菌株DX和XX是革蘭氏陽性菌，有芽孢和莢膜，生長溫度范圍分別為35～60℃和35～55℃，最適生長溫度為45℃，繁殖能力非常強(qiáng)，并且對淀粉、纖維素、蛋白質(zhì)和油脂有著較強(qiáng)的分解能力；經(jīng)16S rDNA序列分析以及系統(tǒng)發(fā)育樹分析可以初步鑒定菌株DX是地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），菌株XX是空氣芽孢桿菌（Bacillus aerius）。

醬香型酒糟；高溫菌；分離鑒定；16S rDNA

白酒酒糟是白酒生產(chǎn)的副產(chǎn)物，2014年貴州省的酒糟量就達(dá)到100多萬t［1］，主要集中在貴州省仁懷市地區(qū)。白酒酒糟的鮮糟含水量大，加之又具有很多營養(yǎng)成分，白酒酒糟的貯存存在一定時(shí)間限制，如不及時(shí)處理，會(huì)造成極大的浪費(fèi)，并對環(huán)境造成染重污染。因此，白酒酒糟的利用早已被提上日程，然而面對日益增多的酒糟，以現(xiàn)有的處理方式和規(guī)模難以滿足要求。以多種方式從多個(gè)方面開展對酒糟重復(fù)利用的研究，實(shí)現(xiàn)白酒酒糟的重復(fù)利用對我國白酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展以及環(huán)境保護(hù)具有十分重要的意義［2］。根據(jù)對酒糟資源化利用問題的研究顯示，白酒酒糟除用于生產(chǎn)飼料外，還能用于生產(chǎn)有機(jī)肥、食用菌、食醋、白炭黑等［3-9］。由此可見，有效利用好白酒酒糟不僅能降低丟糟造成的環(huán)境污染，還能大幅提高白酒副產(chǎn)物的附加值，而其中利用酒糟生產(chǎn)有機(jī)肥是解決酒糟利用問題的有效方案。

高溫菌是一類能在45℃以上生長和繁殖的微生物，具有耐熱嗜熱，降解性能好，代謝效率高等特點(diǎn)，在很多領(lǐng)域都發(fā)揮著重要的作用［10-13］。利用高溫菌產(chǎn)生的耐熱酶的特性就能很好地加快酒糟成分的降解，明顯縮短堆肥周期，把酒糟堆肥發(fā)酵為有機(jī)肥，這樣，不僅能有效解決農(nóng)作物肥料供應(yīng)問題，還能解決酒糟資源化利用的問題。但我國的高溫菌研究與國外相比起步晚，研究水平相對較低，所以我們有必要在各個(gè)層次加強(qiáng)對高溫菌的研究，篩選大量降解性能好的優(yōu)良高溫菌株，并深入了解其特性，以便能夠更好地利用高溫菌資源，拓展其應(yīng)用領(lǐng)域。

本研究從茅臺(tái)地區(qū)醬香型酒糟中分離篩選出耐高溫菌株，通過對其分離和鑒定，以期為后續(xù)酒糟高溫菌劑和酒糟生物有機(jī)肥的制備奠定了基礎(chǔ)，這對于加強(qiáng)酒糟資源的綜合利用，拓寬高溫菌的應(yīng)用范圍，促進(jìn)可持續(xù)發(fā)展和循環(huán)經(jīng)濟(jì)相結(jié)合的白酒產(chǎn)業(yè)發(fā)展體系的構(gòu)建都將具有積極意義。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1醬香型酒糟

酒糟：取自仁懷市茅臺(tái)鎮(zhèn)第七輪次拋糟的醬香型酒糟。

1.1.2試劑

碘化鉀、碘（分析純）：Guizhou Sciencelab science& Technology Co.，Ltd；無水乙醇、體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇（分析純）：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；龍膽紫（分析純）：天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；草酸銨（分析純）：成都金山化學(xué)試劑有限公司；番紅O（分析純）：北京索萊寶科技有限公司；甲基藍(lán)（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；乳酸、戊二醛（50%）（分析純）：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；丙三醇（分析純）：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；苯酚（重精餾）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；細(xì)菌微量生化鑒定管、甲基紅試劑盒（5 mL×2）：青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

草酸銨結(jié)晶紫染液：（A液）龍膽紫2 g，95%vol乙醇20 mL；（B液）草酸銨0.8 g，蒸餾水80 mL；混合A、B液即可。

盧戈氏碘液：I 1 g，KI 2 g，去離子水300 mL，先用少量去離子水溶解KI，再將I加入其中溶解完全，最后補(bǔ)水至300 mL。

0.5%的番紅水溶液：2.5%的番紅酒精溶液20 mL，去離子水80 mL混勻。

乳酸石碳酸棉藍(lán)染液：苯酚20 g，乳酸20 mL，丙三醇40 mL，甲基藍(lán)0.05 g，去離子水20 mL。先將甲基藍(lán)溶于去離子水，再加入其他物質(zhì)微熱溶化，冷卻備用。

1.1.3培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏3.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，瓊脂粉20 g/L，pH自然，115℃滅菌30 min。

LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏5.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L，pH自然，121℃滅菌20 min。

1.2儀器與設(shè)備

BCD-290W冰箱：青島海爾股份有限公司；DMS-653廣西生物數(shù)碼顯微鏡：深圳市博宇儀器有限公司；∑IGMA ZEISS電子掃描顯微鏡：北京普瑞賽司儀器有限公司；SPX-250B智能型生化培養(yǎng)箱：上海瑯玕實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；YXQ-LS-5DS11立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DHG-9140B（101-2B）智能型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上?，槴\實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SN-CJ-IF潔凈工作臺(tái)：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1酒糟中高溫細(xì)菌的分離篩選

將醬香型酒糟制成不同稀釋梯度的菌液。將稀釋菌液均勻涂布在牛肉膏-蛋白胨培養(yǎng)基上，然后置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中55℃培養(yǎng)24 h。仔細(xì)觀察菌落特征和個(gè)體形態(tài)，將不同特征的生長良好的單個(gè)菌落用無菌接種針挑出，在牛肉膏-蛋白胨培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)。經(jīng)過多次重復(fù)過程（7～8次），得到了純的高溫菌。

1.3.2形態(tài)特征

菌落形態(tài)：挑選分離純化的細(xì)菌，用平板劃線的方法接種在牛肉膏-蛋白胨培養(yǎng)基上，55℃培養(yǎng)12～24 h，觀察菌落的的大小、形態(tài)、顏色、邊緣等特征。

個(gè)體形態(tài)：將分離純化的細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色，光學(xué)顯微鏡下觀察菌株形態(tài)。由于細(xì)菌在光學(xué)顯微鏡下不能很好的區(qū)分，故而對細(xì)菌制片后，進(jìn)行電鏡掃描，結(jié)合電鏡圖片確定各細(xì)菌的一些詳細(xì)特征［15］。

1.3.3生理生化鑒定

將分離純化的菌株進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)，主要包括接觸酶試驗(yàn)、糖發(fā)酵試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、蛋白胨水解實(shí)驗(yàn)等，具體實(shí)驗(yàn)步驟見參考文獻(xiàn)［14］。

1.3.4最適生長溫度及生長曲線

最適生長溫度：將在冰箱中保存的細(xì)菌菌株在篩選溫度條件下于LB液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)活化12 h，設(shè)置35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃六個(gè)溫度梯度，各溫度梯度下設(shè)置3組對照組，然后活化好的菌液1 mL接種到裝有100 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶，搖床培養(yǎng)12 h后用分光光度計(jì)測定各菌液的OD值，并繪制各細(xì)菌的最適生長溫度曲線。

生長曲線：將在冰箱中保存于營養(yǎng)瓊脂平板的細(xì)菌接種到裝有100 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在50℃、120 r/min條件下，搖床培養(yǎng)12 h，用移液器準(zhǔn)確吸取活化好的菌液0.1 mL接種到裝有100 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，每種菌株做3組，置于50℃、120 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)，每隔8 h測一次OD值，連續(xù)測5 d。取樣時(shí)要在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行，避免染菌，測OD值時(shí)，以未接種的同批次LB液體培養(yǎng)基作為空白對照。

1.3.5細(xì)菌基因組DNA的提取

利用TIANamp Bacteria DNA Kit（天跟生化科技有限公司）提取實(shí)驗(yàn)菌株的DNA，其具體步驟參見試劑盒的說明書。DNA提取產(chǎn)物保存于-20℃冰箱中。

1.3.616S rDNA的PCR擴(kuò)增和測序

以提取的基因組DNA為模板，利用通用引物正向引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCTAG-3'）和反向引物1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所有PCR均在50 μL標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系中進(jìn)行。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，52℃復(fù)性1 min，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；最后于72℃延伸10 min。采用1%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，采用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（離心柱型）回收PCR產(chǎn)物。純化后的目的基因送上海生工公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果用Chromas軟件參照正反序列圖譜進(jìn)行人工校正。

1.3.7系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

用基本局部比對搜索工具（basic local alignment cearch tool，BLAST）將測序結(jié)果在美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）中與已知細(xì)菌的16S rDNA基因序列進(jìn)行同源性分析，并用MEGA5.10軟的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，具體確定菌株的種屬。

2　結(jié)果與分析

2.1菌株的形態(tài)特征

通過實(shí)驗(yàn)分離出兩株高溫菌株，分別編號為DX和XX，其菌落形態(tài)見圖1。

圖1　菌株DX和XX的菌落形態(tài)Fig.1 Colonial morphology of strains DX and XX

由圖1可知，菌株DX菌落粗糙濕潤、不透明、邊緣多缺刻呈樹根狀、易挑取，菌落直徑約為15mm。菌株XX菌落干燥粗糙、白色、邊緣較規(guī)整、不易挑取，菌落直徑約為6 mm。

在菌落觀察得到初步結(jié)果后，用革蘭氏染色法對細(xì)菌進(jìn)行顯微鏡鏡檢，再做電鏡鏡檢。菌株個(gè)體形態(tài)描述見表1，鏡檢的部分圖片見圖2。

表1　菌株的個(gè)體形態(tài)Table 1 Individual morphology of strains DX and XX

圖2　菌株DX和XX鏡檢圖片F(xiàn)ig.2 Microscopy images of strains DX and XX

2.2生理生化實(shí)驗(yàn)

對兩株細(xì)菌DX和XX做生理生化實(shí)驗(yàn)，包括糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、V-P實(shí)驗(yàn)和甲基紅實(shí)驗(yàn)等，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2　菌株DX和XX生理生化試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Physiological and Biochemical experiments results of strains DX and XX

2.3最適生長溫度及生長曲線

2.3.1菌株的最適生長溫度曲線

圖3　菌株DX（A）和XX（B）的生長最適溫度曲線Fig.3 The optimum growth temperature curve of strain DX（A）and XX（B）

從圖3可以看出，在35～45℃內(nèi)，菌株DX的菌體OD值呈逐步上升，在45℃時(shí)達(dá)到最大值，之后菌體OD值逐步下降，所以菌株DX的最適生長溫度為45℃，在35～60℃均能較好的生長；在35～45℃內(nèi)，菌株XX的菌體OD值呈快速上升，在45℃時(shí)達(dá)到最大值，之后菌體OD值下降較快，所以菌株XX的最適生長溫度為45℃，在35～55℃均能較好的生長。

2.3.2菌株的生長曲線

圖4　菌株DX（A）和XX（B）的生長曲線Fig.4 Growth curve of strains DX（A）and XX（B）

從圖4 A可以看出，在0～24 h時(shí)，DX處于對數(shù)生長期，菌體快速繁殖，OD值變化最大，隨后由于營養(yǎng)物質(zhì)的急劇消耗，32～40 h時(shí)DX生長開始變緩，40～96 h時(shí)菌株DX進(jìn)入穩(wěn)定期，細(xì)菌數(shù)目和代謝產(chǎn)物達(dá)到最高水平，菌體OD值較穩(wěn)定，96 h后菌株DX進(jìn)入衰亡期，菌體大量死亡，OD值開始明顯下降，從OD值變化趨勢來看，DX具有較快的生長速度，發(fā)酵周期在24～36 h。

從圖4B可以看出，在0～32h時(shí)菌株XX處于對數(shù)生長期，菌體快速繁殖，OD值快速增加，32～40 h時(shí)開始變緩，在經(jīng)歷及其短暫的穩(wěn)定期后，菌株XX就開始進(jìn)入衰亡期，從OD值變化趨勢來看，菌株XX也具有較快的生長速度，發(fā)酵周期在24～36 h。

2.416S rDNA及基因系統(tǒng)發(fā)育分析

用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物，電泳圖見圖5。由圖5可知，在1 000 bp～2 000 bp正中間處有一明亮條帶，測序結(jié)果為1 522 bp和1 536 bp，與檢測結(jié)果相符合。將菌株DX和XX的16S rDNA序列測序結(jié)果與NCBI中已報(bào)道的模式菌株序列序列進(jìn)行比對，結(jié)果表明，菌株DX和XX與Bacillus屬成員有較高的序列同源性，在94%～99%之間，其中菌株DX、XX與Bacillus licheniformis、Bacillus aerius、Bacillus sonorensis的同源性達(dá)到99%，說明從中可以看出菌株DX、XX與這3個(gè)種具有最高的序列同源性。用MEGA5.10構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖6和圖7所示，通過與進(jìn)化關(guān)系比較親近的屬種進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，結(jié)果表明菌株DX與菌株XX均屬于芽孢桿菌屬，菌株DX與芽孢桿菌屬中的Bacillus licheniformis親緣關(guān)系最近，兩者在同一進(jìn)化分支上；菌株XX與芽孢桿菌屬中的Bacillus aerius的親緣關(guān)系最近。結(jié)合菌株DX和菌株XX的細(xì)胞形態(tài)、菌落形態(tài)、生理生化特征、16S rDNA序列分析以及系統(tǒng)發(fā)育分析可以初步鑒定菌株DX是地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、菌株XX是空氣芽孢桿菌（Bacillus aerius）。

圖5　菌株DX和XX的16S rDNA PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.5 16S rDNA PCR amplification electrophoretogram of strains DX and XX

圖6　菌株DX基于16S rDNA建立的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 The phylogenetic tree of strain DX based on 16S rDNA sequence

圖7　菌株XX基于16S rDNA建立的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 The phylogenetic tree of strain XX based on 16S rDNA sequence

3　結(jié)論

從茅臺(tái)菌株地區(qū)醬香型酒糟中分離篩選出耐高溫菌株DX和XX，根據(jù)形態(tài)及生理生化特征和16S rDNA序列分析，菌株DX是一株革蘭氏陽性桿菌，有芽孢、莢膜，產(chǎn)接觸霉，能降解淀粉、纖維素、蛋白質(zhì)、明膠等大分子有機(jī)物，其中對蛋白質(zhì)有著十分強(qiáng)烈的分解能力。兼性厭氧型，生長溫度范圍為35～60℃，最適生長溫度是45℃。菌株DX與Bacillus licheniformis的同源性在NCBI中對比為99%，并且通過系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，菌株DX與Bacillus licheniformis親緣關(guān)系最近。初步鑒定該菌株是芽孢桿菌屬的地衣芽孢桿菌。菌株XX是一株革蘭氏陽性桿菌，有芽孢、莢膜，產(chǎn)接觸霉，能降解淀粉、纖維素、蛋白質(zhì)、明膠等大分子有機(jī)物，其中對纖維素的分解能力較強(qiáng)。兼性厭氧型，生長溫度范圍為35～55℃，最適生長溫度是45℃。菌株XX與Bacillus aerius的同源性在NCBI中對比為99%，并且通過系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，菌株XX與Bacillus aerius親緣關(guān)系最近。初步鑒定該菌株是芽孢桿菌屬的空氣芽孢桿菌。菌株DX和菌株XX的繁殖能力非常強(qiáng)，屬于非致病菌，對淀粉、纖維素、蛋白質(zhì)和油脂有著較強(qiáng)的分解能力，并且是從酒糟中分離出來的，所以對于酒糟中環(huán)境有著天然的適應(yīng)能力，所以可以很好的用于酒糟生物有機(jī)肥的制備以及其他其他工業(yè)生產(chǎn)中。

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Isolation and identification of thermophilic bacterium from Moutai-flavor vinasse in Moutai region

ZHOU Lian1，3，CHEN Li2，3*，LU Hongmei2，3，MO Liuqin2，3，XU Shuo2，3

（1.College of Chemistry and Chemical Engineering，Guizhou University，Guiyang 550003；2.College of Liquor and Food Engineering，Guizhou University，Guiyang 550003；3.Guizhou Province Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biopharmacy，Guizhou University，Guiyang 550003）

The thermophilic bacteria strains DX and XX were isolated and screened from Moutai-flavor vinasse in Moutai region.The physiological-biochemical characteristics of strains were detected and 16S rDNA sequence was analyzed.The results showed that the strains DX and XX were gram-positive bacterium，and had spore and capsule.The strains growth temperature ranges were 35-60℃and 35-55℃，respectively.The optimum growth temperature was 45℃.The strains had a strong growth ability and strong ability of decomposition on starch，cellulose，protein and fats.By the 16S rDNA sequence and phylogenetic tree analysis，the strains DX and XX could be identified preliminarily asBacillus licheniformisandBacillus aerius，respectively.

Moutai-flavor vinasse；themophilic bacteria；isolation and identification；16S rDNA

Q93

0254-5071（2016）03-0061-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.03.014

2015-12-10

產(chǎn)學(xué)研合作項(xiàng)目（HX2014002）

周蓮（1990-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锘ぁ?/p>

陳莉（1981-），女，副教授，碩士，研究方向?yàn)槲⑸铩?/p>