大腸桿菌O157∶H7壓力反應(yīng)基因?qū)GCG和檸檬酸的轉(zhuǎn)錄響應(yīng)

畢旺來，杜文芳，肖　潔，劉　燁，談　笑，李　睿*

（武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023）

大腸桿菌O157∶H7壓力反應(yīng)基因?qū)GCG和檸檬酸的轉(zhuǎn)錄響應(yīng)

畢旺來，杜文芳，肖潔，劉燁，談笑，李睿*

（武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023）

采用反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR技術(shù)，檢測天然防腐劑表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）及檸檬酸處理后，大腸桿菌O157∶H7幾種壓力反應(yīng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄響應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1 mg/mL EGCG處理后，recA轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，rpoS無明顯變化，而oxyR轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào)；4 mg/mL檸檬酸處理后，recA轉(zhuǎn)錄水平小幅上調(diào)，rpoS和oxyR轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)。1mg/mLEGCG和4mg/mL檸檬酸聯(lián)合作用，recA、rpoS、oxyR基因轉(zhuǎn)錄量顯著上調(diào)，且上調(diào)幅度明顯大于防腐劑單獨(dú)處理樣本，說明檸檬酸和EGCG具有協(xié)同效應(yīng)。本研究結(jié)果證實(shí)低濃度的EGCG和檸檬酸均能激活細(xì)菌的氧化應(yīng)激反應(yīng)，檸檬酸能激活SOS反應(yīng)，但低濃度EGCG一定程度上能抑制SOS反應(yīng)。相較檸檬酸，EGCG更適于控制食品中大腸桿菌O157∶H7的污染。

大腸桿菌O157∶H7；EGCG；recA；rpoS；oxyR

大腸桿菌（Escherichia coli）O157∶H7是引起人類疾病的重要食源性致病菌，感染人體后，輕者可引起嘔吐腹瀉，重者可引發(fā)出血性腸炎、溶血性尿毒綜合癥和血栓性血小板減少性紫癜，甚至致人死亡［1］。大腸桿菌O157∶H7主要毒力因子是位于噬菌體上的stx1、stx2基因，這兩種基因分別編碼志賀毒素1（Stx1）和志賀毒素2（Stx2），Stx毒素的高表達(dá)是導(dǎo)致O157∶H7強(qiáng)致病力的原因之一［2］。

當(dāng)大腸桿菌細(xì)胞脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）受到嚴(yán)重?fù)p傷，原有修復(fù)模式無法修復(fù)時，DNA損傷會作為信號啟動SOS反應(yīng)修復(fù)模式。該信號導(dǎo)致胞內(nèi)少量RecA蛋白被激活，裂解阻遏SOS反應(yīng)的LexA蛋白，使細(xì)胞可以表達(dá)與SOS反應(yīng)相關(guān)的蛋白［3］。RecA蛋白激活，轉(zhuǎn)錄并翻譯出一系列抗終止蛋白和調(diào)節(jié)蛋白，從而使噬菌體晚期基因包括stx基因得以轉(zhuǎn)錄。Stx噬菌體進(jìn)入裂解途徑，導(dǎo)致溶源菌裂解并釋放成熟的噬菌體，Stx毒素也同時表達(dá)并釋放到胞外［4］。總的來說，能誘導(dǎo)大腸桿菌O157∶H7 SOS應(yīng)答的誘導(dǎo)物，均能誘導(dǎo)Stx毒素的產(chǎn)生和釋放［5］。

rpoS的編碼產(chǎn)物是RpoS蛋白，是細(xì)菌在脅迫情況下表達(dá)的一種σ因子，在正常的指數(shù)生長期不表達(dá)，而當(dāng)受到外界壓力或進(jìn)入穩(wěn)定期會大量表達(dá)［6］。RpoS蛋白水平的變化會引起眾多基因表達(dá)水平的改變，從而引起細(xì)菌對不同環(huán)境壓力應(yīng)答的變化。在大腸桿菌中該因子一般起正調(diào)節(jié)作用，在少數(shù)情況可起負(fù)調(diào)控作用［7］。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)，許多食源性致病菌能夠在胃酸、高滲等環(huán)境中存活，很大一部分取決于細(xì)菌的rpoS基因；也有研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的賴藥性與rpoS有關(guān)［7］。

oxyR是氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因，其調(diào)節(jié)子表達(dá)產(chǎn)物OxyR含有典型HTH結(jié)構(gòu)，能夠與DNA特異堿基序列結(jié)合調(diào)控許多基因的表達(dá)［8］，主要作用是調(diào)控細(xì)菌的抗氧化相關(guān)基因，它對細(xì)菌抗氧化能力的調(diào)控主要是體現(xiàn)在兩個方面，一方面是調(diào)節(jié)表達(dá)可直接清除高氧化電勢物質(zhì)基因的表達(dá)，另一方面是調(diào)節(jié)可調(diào)控穩(wěn)定胞內(nèi)氧化還原電勢基因的表達(dá)［9-10］。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）是茶葉主要成分茶多酚的一種，也是茶多酚中活性最高的成分。EGCG的抗菌譜很廣，對大部分的細(xì)菌類群都有抑制作用，對食品中常見的微生物的最低抑菌濃度僅為1 mg/g，對腸道致病菌的最低抑菌濃度更低，不到0.5 mg/g［11］。檸檬酸可以改變細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性，使細(xì)菌的物質(zhì)運(yùn)輸發(fā)生障礙；同時檸檬酸還可以使菌體胞內(nèi)滲透壓升高而使其生理功能紊亂；它還能抑制細(xì)菌大分子物質(zhì)的合成［12］。檸檬酸抑菌效果良好，被廣泛應(yīng)用于食品保鮮。

近年來，EGCG、檸檬酸等天然食品添加劑廣泛應(yīng)用于食品保鮮，因其無毒、無害甚至對人體有益而受到消費(fèi)者青睞。EGCG、檸檬酸用于控制食品中大腸桿菌O157∶H7的研究也屢有報道［13-14］，但是關(guān)于EGCG和檸檬酸的抑菌機(jī)理研究不是很深入，很多抑菌機(jī)理尚待闡釋。本文著眼于研究EGCG、檸檬酸處理后，大腸桿菌O157∶H7壓力反應(yīng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄響應(yīng)，為揭示EGCG抑菌機(jī)理奠定基礎(chǔ)，并為EGCG、檸檬酸等天然防腐劑在食品保鮮儲藏中的實(shí)際應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1試驗(yàn)菌株

大腸桿菌O157∶H7 EC150為臨床菌株：由日本九州大學(xué)贈送。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑

檸檬酸：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；EGCG：南京廣潤生物制品有限公司；核酸染料GoldView：北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司；蛋白胨、酵母提取物：英國OXOID公司；外源核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）酶清除劑：北京華越洋生物科技有限公司；去基因組DNA（gDNA）反轉(zhuǎn)錄試劑盒、蛋白質(zhì)Marker、RNA提取試劑盒、熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒：日本Takara公司；甘氨酸、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、Tris堿、考馬斯亮藍(lán)、四甲基乙二胺（N，N，N'，N'-Tetramethylethylenediamine，TEMED）：美國Amresco公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）：美國Sigma公司。

1.2儀器與設(shè)備

5417R型臺式高速冷凍離心機(jī)：德國Eppendorf公司；ABI7500型熒光定量PCR儀：美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；DYY-6C型電泳儀：北京市六一儀器廠；THZ-22型恒溫?fù)u床：太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；Lambda 25型紫外可見分光光度計(jì)：美國PerkinElmer股份有限公司；GBox-HR-E-M型自動凝膠成像分析系統(tǒng)：英國Syngene公司；SL302型電子天平：上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；T100TMThermal Cycler型PCR儀：美國BIO-RAD公司；JY-SCZ2/SCZ2+型雙垂直電泳儀：上海凱圣科學(xué)儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1菌株的體外抑制

將EC150菌株接種到LB液體培養(yǎng)基，于37℃、150r/min培養(yǎng)14 h。取4 mL培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于10 mL離心管，室溫條件下12000r/min離心1min，棄上清。取2mLpH值為6.5的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌菌體兩次；配置EGCG、檸檬酸母液（均用PBS稀釋）。分別取2mL1mg/mL EGCG（即2倍最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的EGCG）、4 mg/mL檸檬酸（約MIC濃度的檸檬酸）、終濃度4 mg/mL檸檬酸+1 mg/mLEGCG的混合液和pH 6.5的PBS重懸菌體；37℃條件下150 r/min遮光處理1 h。

1.3.2提取菌體總RNA

將以上各種試劑處理后的細(xì)菌培養(yǎng)物12 000 r/min離心1 min，棄上清，取2 mL pH為6.5的PBS洗滌菌體兩次，用1 mL pH為6.5的PBS重懸菌體。取重懸的菌液400 μL于1.5 mL EP管中，4℃條件下12 000 r/min離心1 min，棄上清。加入1 mL RNAiso Plus于EP管中，并用移液槍吹打至裂解液無沉淀，冰浴5min。加入200μL氯仿，劇烈振蕩，直至溶液充分乳化，繼續(xù)冰浴5 min后，4℃、12 000 r/min離心15 min。輕輕取出EP管，吸取400 μL上清液于新的EP管中，該過程及后續(xù)的步驟在冰上完成。向400 μL上清液中加入已于-20℃條件下預(yù)冷的等體積異丙醇，顛倒混勻，于-20℃條件下靜置20 min后，4℃條件下12 000 r/min離心10 min。將離心產(chǎn)物的上清液轉(zhuǎn)移至新的EP管中，沿管壁緩慢加入1 mL無水乙醇，4℃條件下12 000 r/min離心5 min。小心盡量吸走上清液，后將EP管敞口放置10 min風(fēng)干。加入30 μL RNAase-free水溶解沉淀。將溶解后的產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳（電泳槽、致膠、梳子溶膠用三角瓶均用RNA酶抑制劑處理，并用滅菌后的焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）處理過的水。同時將提取的RNA用分光光度計(jì)測量其在波長為260 nm及280 nm處的OD值。

1.3.3反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR

加入去gDNA反應(yīng)體系：RQ1 RNase-Free DNase 10× buffer 1 μL，RQ1 RNase-Free DNase 1 μL，RNase-Free H2O 7 μL和RNA 1 μL。37℃孵育30 min后，加入1 μL終止液，終止反應(yīng)，然后65℃孵育10 min，使DNase失活。采用體系：1.0μLRTPrimerMix，1.0μLPrimeScriptRTEnzymeMixI，4.0 μL RNase Free dH2O，4.0 μL 5×PrimeScript Buffer 2，10.0 μL制備的RNA樣品液，總體積為20.0 μL。并做不加反轉(zhuǎn)錄酶的陰性對照組。反應(yīng)條件均為：37℃、15 min，85℃、5 s。將樣品-20℃保存待用。加入反應(yīng)體系：0.6 μL 10 μmoL/L的PCR Forward Primer，0.6 μL 10 μmoL/L PCR Reverse Primer，10.0μL2×的PremixDimerEraserTM， 0.4 μL 50×的ROX Reference Dye，5 μL cDNA，最后補(bǔ)加滅菌三蒸水至總體積為20 μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性10 s，94℃變性5 s，55℃退火15 s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán)，每一循環(huán)的退火階段實(shí)時檢測熒光。熒光定量PCR結(jié)束后，94℃、15s，60℃、60s，94℃、30s，60℃、15s，記錄熒光信號，得到擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線。

引物采用SLANECT等［15-16］設(shè)計(jì)的引物（表1），16SrRNA為內(nèi)參基因。PBS處理樣本為對照。

表1　RT-real time PCR引物Table 1 RT-real time PCR primer

2　結(jié)果與分析

2.1EGCG和檸檬酸對大腸桿菌EC150的recA、rpoS及oxyR基因轉(zhuǎn)錄的影響

圖1　RT-real time PCR檢測recA、rpoS及oxyR基因轉(zhuǎn)錄Fig.1 The transcription ofrecA，rpoSandoxyRgenes detected by RT-real time PCR

由圖1可知，用1 mg/mL EGCG處理后，EC150的recA基因轉(zhuǎn)錄量略有下調(diào)，表明其可以一定水平上抑制SOS反應(yīng)。1 mg/mL EGCG處理后rpoS基因轉(zhuǎn)錄無明顯變化。用4 mg/mL檸檬酸處理后，其recA和rpoS基因的轉(zhuǎn)錄量上調(diào)；1 mg/mL EGCG和4 mg/mL檸檬酸共同作用，RecA和rpoS基因轉(zhuǎn)錄量均顯著上調(diào)，且上調(diào)幅度明顯大于檸檬酸單處理樣本。說明檸檬酸可以誘導(dǎo)SOS反應(yīng)，同時也可激活菌體對外界環(huán)境的壓力應(yīng)答。且EGCG和檸檬酸共同作用比檸檬酸單處理作用效果更明顯，可能是它們的聯(lián)合使用對DNA的破壞力更強(qiáng)。

三種處理方式均使oxyR基因轉(zhuǎn)錄顯著上調(diào)，且EGCG和檸檬酸聯(lián)合作用，oxyR基因轉(zhuǎn)錄量明顯大于其單獨(dú)處理樣本，說明EGCG和檸檬酸均能激活氧化應(yīng)激反應(yīng)，且聯(lián)合使用具有協(xié)同效應(yīng)，可以增強(qiáng)細(xì)菌氧化應(yīng)激反應(yīng)。

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)分別研究了EGCG和檸檬酸單獨(dú)處理及共同處理后，大腸桿菌O157∶H7的3種壓力應(yīng)答基因recA、rpoS、oxyR基因的轉(zhuǎn)錄水平變化。研究發(fā)現(xiàn)低濃度EGCG抑制菌體出現(xiàn)SOS反應(yīng)。現(xiàn)階段的研究表明SOS應(yīng)答激活會導(dǎo)致大腸桿菌致病菌大量表達(dá)志賀毒素并釋放到胞外，從而對食品安全造成危害［17-18］。低濃度的EGCG不激活rpoS基因表達(dá)，而rpoS基因表達(dá)產(chǎn)物可能與細(xì)菌耐藥性有關(guān)，這些特性使EGCG可以很好地用于食品中O157∶H7的防控。檸檬酸具有很好的抑菌效果，但本研究表明低濃度檸檬酸可誘導(dǎo)SOS反應(yīng)和激活rpoS轉(zhuǎn)錄，可能使菌體產(chǎn)生一系列抗壓反應(yīng)及耐藥性。EGCG和檸檬酸的聯(lián)合使用對菌體的抑制作用更強(qiáng)，但是卻會增強(qiáng)SOS應(yīng)答和rpoS轉(zhuǎn)錄。因此在食品保鮮儲藏時，建議不可將二者聯(lián)合使用，以避免增強(qiáng)食品中致病菌的毒力。

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Transcriptional response ofE.coliO157：H7 stress related gene to EGCG and citric acid

BI Wanglai，DU Wenfang，XIAO Jie，Liu Ye，TAN Xiao，LI Rui*
（College of Biological and Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，China）

This study aimed at revealing the transcriptional response of stress related genes inEscherichia coliO157∶H7 when exposed to natural preservatives epigallocatechin gallate（EGCG）and citric acid by RT-real-time PCR.Results showed that whenE.coliO157∶H7 exposed to 1 mg/ml EGCG，the transcription level ofrecAreduced，while the transcription level ofoxyRincreased distinctly.When exposed to 4 mg/ml citric acid，the transcription level ofrecAimproved slightly，whilerpoSandoxyRimproved significantly.Compared with the samples exposed to EGCG or citric acid，respectively，whenE.coliO157∶H7 exposed to 1 mg/ml EGCG and 4 mg/ml citric acid，the transcription levels of three genes improved sharply and were much higher.This study demonstrated that both EGCG and citric acid could induce oxidative stress reaction.Citric acid could also induced SOS response but EGCG could slightly inhibited SOS reaction.So compared with citric acid，EGCG was more suitbale in the prevention ofE.coli O157：H7 contamination in food production.

Escherichia coliO157：H7；EGCG；recA；rpoS；oxyR

R155.5

0254-5071（2016）03-0041-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.03.010

2015-12-16

湖北省教育廳重點(diǎn)科研計(jì)劃項(xiàng)目（D20151702）

畢旺來（1972-）男，實(shí)驗(yàn)師，本科，研究方向?yàn)槭称肺⑸镂廴九c控制。

李睿（1972-），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩?/p>