基于柱后衍生發(fā)芽糙米中γ-氨基丁酸HPLC檢測方法的建立及應(yīng)用

王麗群，潘媛媛，孟慶虹，張志宏，嚴(yán)　松，高　揚(yáng)，盧淑雯*（.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品加工研究所，黑龍江 哈爾濱 50086；.賽默飛世爾科技（中國）有限公司，北京 00085）

基于柱后衍生發(fā)芽糙米中γ-氨基丁酸HPLC檢測方法的建立及應(yīng)用

王麗群1，潘媛媛2，孟慶虹1，張志宏1，嚴(yán)松1，高揚(yáng)1，盧淑雯1*
（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品加工研究所，黑龍江 哈爾濱 150086；2.賽默飛世爾科技（中國）有限公司，北京 100085）

建立了一種能與17種常見氨基酸分離的發(fā)芽糙米中γ-氨基丁酸的檢測方法，即采用Hypercarb column色譜柱，以鄰苯二甲醛作為衍生試劑進(jìn)行柱后衍生，檢測波長為338 nm，γ-氨基丁酸的定量線性范圍為0.2～50 mg/L，線性方程為A=0.304 3C+0.065 3，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 9。確定了發(fā)芽糙米中γ-氨基丁酸的提取條件，發(fā)芽糙米經(jīng)20%甲醇-水提取后，用1.0%甲酸稀釋，進(jìn)樣檢測，回收率可達(dá)97.7%。按照上述提取與檢測方法，對(duì)不同種糙米制品中γ-氨基丁酸含量進(jìn)行了測定，發(fā)芽糙米中γ-氨基丁酸含量明顯高于普通糙米，發(fā)芽糙米經(jīng)高溫?cái)D壓與模擬蒸煮處理后，其γ-氨基丁酸含量均無明顯變化。

γ-氨基丁酸；發(fā)芽糙米；高效液相色譜法；擠壓

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）通常被稱為大腦天然冷靜劑［1-2］，因具有抑制大腦過度興奮、減緩神經(jīng)緊張以及降血壓、解酒、利尿及助眠等功效［3］，而受到國內(nèi)外食品與醫(yī)藥領(lǐng)域研究人員的普遍關(guān)注。目前，在諸多食品原料及其制品中均已發(fā)現(xiàn)GABA的存在，并以發(fā)酵食品和稻米類制品中含量最多［4-5］。GABA在發(fā)酵食品中主要由微生物（如乳酸菌、紅曲霉等）［6-7］代謝產(chǎn)生，而在稻米類制品中則主要是在糙米萌發(fā)的過程中產(chǎn)生［8-10］。發(fā)芽糙米是由糙米經(jīng)水浸泡幾個(gè)小時(shí)后，在一定的溫度和濕度條件下孵育而成，其口感良好，營養(yǎng)豐富并含有多種益生組分而易于為人們所接受。作為γ-氨基丁酸的主要植物來源［11-12］，與發(fā)芽糙米及其制品相關(guān)的研究已成為新的熱點(diǎn)。但截至目前，已發(fā)表的關(guān)于發(fā)芽糙米中γ-氨基丁酸含量檢測方法方面的研究并不多，并且存在一些尚未解決的問題，如：（1）與其他物料相比，發(fā)芽糙米中淀粉含量較高，在加工和提取過程中，發(fā)芽糙米米粉中的淀粉易隨溫度升高而發(fā)生糊化，從而造成樣品中GABA的提取率偏低；（2）在各種檢測方法中，發(fā)芽糙米中富含的多種氨基酸都會(huì)干擾GABA的測定結(jié)果；（3）同其他氨基酸一樣，GABA檢測目前采用最多的是以鄰苯二甲醛、對(duì)苯二甲醛-2-巰基乙醇、丹磺酰氯、2，4，6-三硝基苯磺酸及氯甲酸-9-芴基甲酯等進(jìn)行柱前衍生的液相色譜方法［13-15］，但柱前衍生的缺點(diǎn)在于前處理復(fù)雜，并容易引入過多衍生副產(chǎn)物，干擾衍生產(chǎn)物的測定。

鑒于以上存在的問題，本研究建立了一種能夠與17種常見氨基酸分離的GABA柱后衍生的高效液相色譜測定方法，設(shè)計(jì)了簡易有效的糙米樣品中GABA提取方案，從不同加工處理獲得的發(fā)芽糙米樣品入手，按照上述GABA提取方案與檢測方法，對(duì)發(fā)芽糙米樣品中GABA含量進(jìn)行測定，旨在為發(fā)芽糙米及其他食品中GABA柱后衍生HPLC檢測方法的應(yīng)用提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

稻米原料：黑龍江省農(nóng)科院栽培所培育粳稻品種X；γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品、17種氨基酸混標(biāo)（≥98.0%）：美國Sigma公司；甲醇、乙腈（色譜純）：美國Fisher Scientific公司；七氟丁酸、甲酸（分析純）：美國Acors公司；疊氮化鈉、鄰苯二甲醛、3-巰基丙酸、硼酸均為分析純：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

戴安U3000液相色譜：美國Thermo Fisher公司；DGP-3600 RS泵、WPS-3000TRS自動(dòng)進(jìn)樣器、TCC-3000RS柱溫箱、VWD-3100檢測器、變色龍6.8色譜軟件、FC-2K實(shí)驗(yàn)室礱谷機(jī)：日本大竹制作所；JXFM110錘式旋風(fēng)磨：上海嘉定糧油儀器有限公司；EV-25雙螺桿擠壓機(jī)：法國CLEXTRAL公司。

1.3方法

1.3.1色譜條件

色譜柱：戴安Hypercarb column（5 μm，4.6 mm× 150 mm）；流動(dòng)相：流動(dòng)相A為0.4%七氟丁酸，流動(dòng)相B為0.1%七氟丁酸-乙腈，流速為0.5 mL/min，梯度洗脫條件如表1所示，紫外檢測波長為338 nm，柱溫為室溫，進(jìn)樣量10 μL。

表1　梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.3.2γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取GABA固體對(duì)照品10 mg于10 mL容量瓶中，用20 mg/L疊氮化鈉溶液溶解并定容，配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.3.3 17種氨基酸混合溶液的配制

17種氨基酸混標(biāo)儲(chǔ)備液為2.5 μmol/mL（0.1 mol/L HCl），直接用20 mg/L疊氮化鈉溶液稀釋至目標(biāo)濃度。

1.3.4γ-氨基丁酸衍生化

0.4 mol/L硼酸緩沖液（pH=10.0）的配制：稱取24.8 g硼酸，14.1 g氫氧化鈉，用水稀釋并定容至1 000 mL容量瓶中，搖勻備用。

鄰苯二甲醛衍生試液配制：稱取200 mg鄰苯二甲醛，用甲醇溶解并定容至100 mL容量瓶中，加入3-巰基丙酸（200 μL），搖勻，室溫避光密封備用。

設(shè)置硼酸緩沖液與衍生試液的混合體積比為4∶1，并調(diào)節(jié)混合后的溶液流速為0.3 mL/min。

1.3.5糙米樣品的制備

糙米生米粉：取稻米1 kg，經(jīng)礱谷獲得糙米，通過錘式旋風(fēng)磨碾磨獲得糙米生米粉，過100目篩，備用。

發(fā)芽糙米生米粉：取稻米1 kg，經(jīng)礱谷獲得糙米，糙米經(jīng)25℃浸泡0.5 h，瀝干后，置于25℃、濕度98%恒溫恒濕箱中，發(fā)芽15 h，收集發(fā)芽糙米，于55℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥1.5～2 h，至發(fā)芽糙米中水分含量為15%左右，經(jīng)錘式旋風(fēng)磨碾磨獲得發(fā)芽糙米生米粉，過100目篩，備用。

高溫膨化發(fā)芽糙米粉：以發(fā)芽糙米生米粉為原料，采用雙螺桿擠壓機(jī)（配有6節(jié)加熱段），將米粉倒入擠壓機(jī)的進(jìn)料器中，模頭溫度125℃，六節(jié)加熱段溫度參數(shù)依次為30℃、60℃、90℃、120℃、140℃、和150℃。進(jìn)料速度控制在3 kg/h，進(jìn)水量0.2 kg/h。擠壓后，收集擠壓物，磨粉，過100目篩，備用。

模擬蒸煮發(fā)芽糙米粉：以發(fā)芽糙米生米粉為原料，采用雙螺桿擠壓機(jī)（配有6節(jié)加熱段），將米粉倒入擠壓機(jī)的進(jìn)料器中，模頭溫度80℃，六節(jié)加熱段溫度參數(shù)依次為30℃、40℃、60℃、70℃、80℃、和80℃。進(jìn)料速度控制在3 kg/h，進(jìn)水量0.8 kg/h。擠壓后，收集擠壓物，在80℃條件下，熱風(fēng)干燥10 min，磨粉，過100目篩，備用。

1.3.6發(fā)芽糙米中γ-氨基丁酸提取方法比較

稱取發(fā)芽糙米生米粉樣品1 g于50 mL離心管中，分別加體積分?jǐn)?shù)為80%甲醇水溶液、體積分?jǐn)?shù)為20%甲醇水溶液及純水溶液8 mL，搖勻，于40℃水浴振蕩提取30 min，4℃條件下12 000 r/min離心10 min。取上清液，分別用1%和0.1%甲酸水溶液稀釋1倍，0.22 μm尼龍膜過濾后進(jìn)樣檢測。加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)中，取糙米粉樣品1 g，加入對(duì)照品，放置30 min老化后，提取方式同樣品。

1.3.7糙米樣品中GABA含量及其回收率測定

分別取糙米生米粉、發(fā)芽糙米生米粉、高溫膨化發(fā)芽糙米粉及模擬蒸煮發(fā)芽糙米粉樣品按1.3.6確定的樣品前處理方法提取GABA，按1.3.1色譜分析方法進(jìn)行GABA含量測定，回收率測定方法參照1.3.6方法。

2　結(jié)果與分析

2.1 GABA檢測方法的建立

2.1.1 GABA色譜分離結(jié)果

利用柱后鄰苯二甲醛衍生法，按照1.3.1的參數(shù)條件對(duì)GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行了檢測，GABA先經(jīng)過在Hypercarb色譜柱分離，其標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖如圖1所示。由圖1可知，GABA保留時(shí)間為7.80 min。

圖1　GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.1 The chromatogram of GABA standard solution

鑒于糙米中含有的氨基酸對(duì)GABA含量測定的干擾，按照相同的參數(shù)條件對(duì)17種常見氨基酸進(jìn)行檢測分析，疊加譜圖見圖2。

圖2　GABA和17種常見氨基色譜疊加圖Fig.2 Chromatographic overlay chart of GABA and 17 common amino acids

從圖2可以看出，GABA可與17種常見氨基酸完全分離（除色譜圖中可見的10種氨基酸外，其他7種氨基酸在胱氨酸后被快速洗脫，分別為Leu-亮氨酸、Ile-異亮氨酸、Met-蛋氨酸、His-組氨酸、Arg-精氨酸、Phe-苯丙氨酸和Tyr-酪氨酸），在糙米GABA檢測過程中，可以避免樣品中常見氨基酸對(duì)GABA測定的影響。

2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線

以GABA質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用超純水進(jìn)行系列稀釋，所得工作曲線質(zhì)量濃度分別為0.2 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L和50.0 mg/L，以GABA質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，峰面積（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為A=0.304 3C+ 0.065 3，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9，在0.2～50 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3定量限及重復(fù)性試驗(yàn)

取質(zhì)量濃度為0.2 mg/L的GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液、以進(jìn)樣量10μL信噪比為20計(jì)算定量限，得知方法定量限為0.02 mg/g。

取質(zhì)量濃度為10.0 mg/L的GABA重復(fù)進(jìn)樣5次，重復(fù)進(jìn)樣疊加圖見圖3，保留時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.30%，峰面積的標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.73%，重復(fù)性試驗(yàn)表明方法精密度良好。

圖3　GABA重復(fù)進(jìn)樣疊加圖Fig.3 Chromatographic overlay chart of GABA repeat injections

2.2糙米中GABA提取的前處理方法

對(duì)于糙米的前處理，參考文獻(xiàn)［9］采用體積分?jǐn)?shù)為80%甲醇水溶液振蕩提取后濃縮、定容檢測。采用該方法，測得各樣品中GABA含量偏低，且回收率僅為60%左右。本文根據(jù)GABA極易溶于水的性質(zhì)，分別采用體積分?jǐn)?shù)為20%甲醇水溶液及超純水進(jìn)行提取試驗(yàn)，為防止GABA在分析過程中吸附在基質(zhì)中，而造成回收率偏低，試驗(yàn)設(shè)計(jì)在提取溶液中加入甲酸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，樣品出現(xiàn)GABA峰拖尾及干擾峰，判斷在酸性條件下，樣品中某些干擾組分被提取出來，從而影響GABA的測定。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇在進(jìn)樣前分別用1%甲酸和0.1%甲酸進(jìn)行稀釋，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2　 不同提取方法的GABA回收率對(duì)比Table 2 The comparison of the GABA recovery rate by different extraction method

由表3可知，采用純水提取-0.1%甲酸稀釋的方法樣品回收率為86.11%，但由于糙米樣品用純水提取時(shí)，極易出現(xiàn)乳化作用形成膠體，不利于離心過濾，而相對(duì)于純水提取法，20%甲醇水溶液提取-1.0%甲酸稀釋法，回收率為97.74%，且重現(xiàn)性較好，因此，本實(shí)驗(yàn)最終選用20%甲醇水溶液提取-1.0%甲酸稀釋一倍后進(jìn)樣的前處理方法。

2.3不同糙米樣品中GABA含量及回收率的測定

按照2.1建立的GABA檢測方法，以及2.2確定的糙米中GABA提取方法，對(duì)糙米生米粉、發(fā)芽糙米生米粉、高溫膨化發(fā)芽糙米粉、模擬蒸煮發(fā)芽糙米粉樣品中GABA含量進(jìn)行測定，測定結(jié)果見表3。

表3　糙米中GABA含量及加標(biāo)回收率Table 3 The content of GABA in brown rice and standard recovery rate

發(fā)芽糙米制品在提取過程中易于糊化，從而影響GABA的提取率。由表4可知，不同糙米樣品中GABA的回收率在96.50%～107.01%，說明文中建立的提取與檢測方法準(zhǔn)確度高，適用于各類糙米制品中GABA含量的檢測。此外，糙米生米粉中GABA含量僅為發(fā)芽糙米樣品中GABA含量的23.90%，說明糙米經(jīng)過發(fā)芽處理后GABA含量得到很大地提高，這與先前報(bào)道的研究結(jié)果一致［5，16］。同時(shí)，通過高溫膨化和模擬蒸煮處理的發(fā)芽糙米粉樣品中GABA含量與發(fā)芽糙米生米粉相比均無顯著差異（P＞0.05）。

3　結(jié)論

本研究建立了一種能夠與17種常見氨基酸分離的GABA柱后衍生液相色譜測定方法，使GABA目標(biāo)色譜峰能與常見的17種氨基酸實(shí)現(xiàn)完全基線分離，方法的靈敏度、選擇性及回收率能夠滿足各類樣品中GABA的定量檢測。此外，針對(duì)發(fā)芽糙米開發(fā)了GABA的樣品處理方法，即20%甲醇水溶液提取-1.0%甲酸稀釋進(jìn)樣，解決了發(fā)芽糙米及其制品易于糊化從而造成GABA提取率偏低的問題。發(fā)芽糙米中GABA含量為普通糙米的4倍，且富含GABA米粉樣品中GABA含量并沒有受到不同擠壓工藝的影響，由此說明文中采用的擠壓工藝可用于發(fā)芽糙米類制品的生產(chǎn)，但更多工藝參數(shù)對(duì)發(fā)芽糙米中GABA含量及功能性質(zhì)的影響還需要做進(jìn)一步研究。

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Establishment and application of the HPLC determination method for γ-aminobutyric acid in germinated brown rice based on postcolumn derivation

WANG Liqun1，PAN Yuanyuan2，MENG Qinghong1，ZHANG Zhihong1，YAN Song1，GAO Yang1，LU Shuwen1*
（1.Food Processing Research Institute，Heilongjiang Academy of Agricultural Science，Harbin 150086，China；2.Thermo Fisher Scientific（China）Co.，Ltd.，Beijing 100085，China）

A determination method forγ-aminobutyric acid（GABA）separated with 17 common amino acids in germinated brown rice was established by HPLC.GABA was separated by Hypercarb chromatographic column，then derived by o-phthalaldehyde as derivative reagent.The detection wavelength was 338 nm.The quantitative linear range of GABA was from 0.2 mg/L to 50 mg/L，and the linear equation wasA=0.304 3C+0.065 3（R2= 0.999 9）.The extraction condition of GABA in germinated brown rice was determined.The germinated brown rice was extracted by 20% methanol-water，and diluted and by 1.0%formic acid，and then determined by HPLC.The recovery rate could reach to 97.7%.According to the extraction conditions and detection method，the content of GABA from different brown rice products was determined.The results showed that the content of GABA in germinated brown rice was obviously higher than ordinary brown rice.By high temperature extrusion and simulation cooking，the content of GABA in germinated brown rice had no significant change.

γ-aminobutyric acid；germinated brown rice；HPLC；extrusion

R155.5

0254-5071（2016）02-0144-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.02.033

2015-11-05

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）專項(xiàng)（201403063）；黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院引進(jìn)博士人員科研啟動(dòng)金（201507-47）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目（CARS-01-34）

王麗群（1982-），女，助理研究員，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。

盧淑雯（1968-），女，研究員，博士，研究方向?yàn)榈久准庸ぁ?/p>