產(chǎn)吡嗪類細(xì)菌的麩曲制作工藝優(yōu)化

武　順，王德良，閆寅卓（中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京 100015）

產(chǎn)吡嗪類細(xì)菌的麩曲制作工藝優(yōu)化

武順，王德良，閆寅卓*
（中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京 100015）

該文采用響應(yīng)面法對(duì)產(chǎn)吡嗪細(xì)菌的麩曲制作工藝進(jìn)行研究。以從酒曲中篩選的細(xì)菌為基礎(chǔ)，考察不同因素對(duì)細(xì)菌產(chǎn)吡嗪的影響。采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法對(duì)影響麩曲制作中細(xì)菌產(chǎn)吡嗪的4個(gè)主要影響因素即麩皮添加量、水分、培養(yǎng)時(shí)間和接種量進(jìn)行分析優(yōu)化。結(jié)果表明，影響細(xì)菌產(chǎn)吡嗪的工藝因素按主次順序排列為麩皮添加量＞接種量＞水分含量＞培養(yǎng)時(shí)間；確定麩曲制作中細(xì)菌產(chǎn)吡嗪的最佳工藝條件為麩皮添加量115 g、水分含量30%、培養(yǎng)時(shí)間36 h、接種量12%。在此最佳條件下，吡嗪類物質(zhì)的產(chǎn)量36.36×10-5g/g。

吡嗪；響應(yīng)面法；工藝優(yōu)化

吡嗪類化合物是1、4位含兩個(gè)氮雜原子的六元雜環(huán)化合物，具有氣味強(qiáng)度高、閾值低、風(fēng)味獨(dú)特、特殊藥理功能和保健功能等特點(diǎn)，廣泛存在于天然和發(fā)酵食品中［1］。其具有類似于炒堅(jiān)果、烤肉的怡人香氣，香氣透散性好，對(duì)其他香味有顯著的烘托和疊加作用［2-3］。研究表明，吡嗪類化合物尤其是四甲基吡嗪，具有擴(kuò)張血管、改善血循環(huán)、護(hù)肝（防止酒精對(duì)胃黏膜和肝臟的損傷）等功能［4-5］。

國(guó)內(nèi)外的相關(guān)研究結(jié)果表明，產(chǎn)吡嗪、特別是四甲基吡嗪的桿菌主要集中在枯桿菌及其突變株［6］、乳酸桿菌［7］、枯草芽孢桿菌［8］等桿菌屬，國(guó)內(nèi)的一些學(xué)者通過(guò)篩選高產(chǎn)蛋白酶活性［9-11］的菌株得到高產(chǎn)吡嗪類的菌株。KOSUGE T等［12］在納豆中分離得到四甲基吡嗪，發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌具有發(fā)酵產(chǎn)生四甲基吡嗪的能力。ZAK D L等［13］從發(fā)酵可可豆中找到了發(fā)酵產(chǎn)吡嗪的枯草芽孢桿菌，且只有在枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)時(shí)，體系中才會(huì)有四甲基吡嗪。HUANG T C等［14］考察了乙偶姻/乙酸銨模型體系中四甲基吡嗪的生成過(guò)程，并提出了弱酸高壓條件下四甲基吡嗪的生成機(jī)制。唐清蘭等［15］對(duì)劍南春酒曲中篩選產(chǎn)吡嗪類功能菌株的產(chǎn)吡嗪條件進(jìn)行優(yōu)化。祝賽峰等［16］利用響應(yīng)面法優(yōu)化枯草芽孢桿菌S0507產(chǎn)四甲基吡嗪的培養(yǎng)條件。朱兵鋒等［17］通過(guò)兩階段pH控制策略、葡萄糖補(bǔ)加策略對(duì)微生物發(fā)酵生產(chǎn)吡嗪進(jìn)行優(yōu)化。

本試驗(yàn)以從酒曲中篩選的高產(chǎn)吡嗪類的細(xì)菌為基礎(chǔ)，對(duì)其麩曲應(yīng)用中產(chǎn)吡嗪類物質(zhì)量進(jìn)行試驗(yàn)優(yōu)化，對(duì)該菌種的實(shí)際應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

高產(chǎn)吡嗪類物質(zhì)的細(xì)菌為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）：本實(shí)驗(yàn)室從酒曲中篩選。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基（營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基）：蛋白胨10 g/L、牛肉膏3 g/L、氯化鈉5 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖70 g/L、玉米粉16 g/L、氯化錳0.05 g/L、氯化鎂0.15 g/L、氯化鋅0.1 g/L、氯化鐵0.05 g/L。

基礎(chǔ)麩曲培養(yǎng)基：麩皮100 g、水分含量40%。

1.2儀器與設(shè)備

Glarus 600氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatographymass spectrometer，GC-MS）：美國(guó)PerkinElmer公司；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；LDZX-50KBS立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；DHZ-B高溫全溫振蕩器：太倉(cāng)市豪成試驗(yàn)儀器制造有限公司。

1.3方法

1.3.1單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

種子液的制備：將枯草芽孢桿菌挑取一環(huán)接于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min培養(yǎng)1 d后轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中相同條件下培養(yǎng)。

麩皮添加量的確定：麩皮添加量分別為60g、70g、80g、90 g、100 g、110 g、120 g、130 g、140 g，水分含量40%，接入10%種子液，裝入500 mL三角瓶中，37℃培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)好的麩曲烘干48 h后粉碎，取0.5 g麩曲，加入內(nèi)標(biāo)5 μL，飽和NaCl 5 mL后測(cè)定吡嗪類物質(zhì)含量。

水分含量的確定：水分含量按20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%添加，麩皮添加量100 g，接入10%種子液，裝入500 mL三角瓶中，37℃培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)好的麩曲烘干48 h后粉碎，取0.5 g麩曲，加入內(nèi)標(biāo)5 μL，飽和NaCl 5 mL后測(cè)定吡嗪類物質(zhì)含量。

培養(yǎng)時(shí)間的確定：培養(yǎng)基中加入麩皮100 g，水80 mL，裝入500mL三角瓶中，接入10%種子液，37℃分別培養(yǎng)12h、18 h、24 h、30 h、36 h、42 h、48 h、54 h、60 h。培養(yǎng)好的麩曲烘干48 h后粉碎，取0.5 g麩曲，加入內(nèi)標(biāo)5 μL，飽和NaCl 5 mL后測(cè)定吡嗪類物質(zhì)含量。

接種量的確定：接種量按5%、7%、9%、11%、13%、15%、17%、19%、21%添加到培養(yǎng)基中，麩皮量100 g，水分含量40%，裝入500 mL三角瓶中，37℃培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)好的麩曲烘干48 h后粉碎，取0.5 g麩曲，加入內(nèi)標(biāo)5 μL，飽和NaCl 5 mL后測(cè)定吡嗪類物質(zhì)含量。

1.3.2響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以麩皮添加量（A）、水分含量（B）、培養(yǎng)時(shí)間（C）、接種量（D）為考察因子，以吡嗪類物質(zhì)含量（Y）為響應(yīng)值，利用Design-Expert8.05中的Box-Behnken Design進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素與水平編碼值見(jiàn)表1。

表1　Box-behnken試驗(yàn)編碼與水平Table 1 Factors and levels of Box-behnken experiment

1.3.3測(cè)定方法

吡嗪類物質(zhì)含量測(cè)定采用氣質(zhì)聯(lián)用法進(jìn)行測(cè)定。

樣品處理：取樣品0.5 g，加入內(nèi)標(biāo)5 μL、飽和NaCl 5 mL，50℃頂空固相萃取30 min。

氣相色譜條件：DB-Wax色譜柱（30 m×0.25 mm， 0.25 μm）氣相色譜。進(jìn)樣口溫度250℃，載氣He，流速2mL/min。進(jìn)樣量1 μL，不分流進(jìn)樣。升溫程序?yàn)?5℃，保持4 min，再以5℃/min的速度升溫至150℃，保持4 min再以3℃/min的速率升溫至220℃，保持5 min。

質(zhì)譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量70 eV，離子源溫度230℃，激活電壓1.5 V，質(zhì)量掃描范圍30.00～350.00 m/z。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)

2.1.1麩皮添加量對(duì)吡嗪類物質(zhì)含量的影響

麩皮添加量對(duì)吡嗪類物質(zhì)含量的影響見(jiàn)圖1。

圖1　麩皮添加量對(duì)吡嗪類物質(zhì)含量的影響Fig.1 Effect of bran addition on pyrazine content

由圖1可知，隨著麩皮添加量的增加，吡嗪類物質(zhì)含量呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)，麩皮添加量為100 g時(shí)吡嗪類物質(zhì)含量最高，為32.213 1×10-5g/g。因此選擇麩皮添加量100 g為響應(yīng)面設(shè)計(jì)中心點(diǎn)。

2.1.2水分含量對(duì)吡嗪類物質(zhì)含量的影響

水分含量對(duì)吡嗪類物質(zhì)含量的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2　水分含量對(duì)吡嗪類物質(zhì)含量的影響Fig.2 Effect of water content on pyrazine content

由圖2可知，隨著水分含量的增加，吡嗪類物質(zhì)含量呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)，水分含量為40%時(shí)吡嗪類物質(zhì)含量最高，為28.734 6×10-5g/g。因此選擇水分含量40%為響應(yīng)面設(shè)計(jì)中心點(diǎn)。

2.1.3培養(yǎng)時(shí)間對(duì)吡嗪類物質(zhì)含量的影響

培養(yǎng)時(shí)間對(duì)吡嗪類物質(zhì)含量的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3　培養(yǎng)時(shí)間對(duì)吡嗪類物質(zhì)含量的影響Fig.3 Effect of culture time on pyrazine content

由圖3可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，吡嗪類物質(zhì)含量呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)，培養(yǎng)時(shí)間為48 h時(shí)吡嗪類物質(zhì)含量最高，為31.021 9×10-5g/g。因此選擇培養(yǎng)時(shí)間48 h為響應(yīng)面設(shè)計(jì)中心點(diǎn)。

2.1.4接種量對(duì)吡嗪類物質(zhì)含量的影響

接種量對(duì)吡嗪類物質(zhì)含量的影響見(jiàn)圖4。

圖4　接種量對(duì)吡嗪類物質(zhì)含量的影響Fig.4 Effect of inoculum on pyrazine content

由圖4可知，隨著接種量的增加，吡嗪類物質(zhì)含量呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)，接種量為15%時(shí)吡嗪類物質(zhì)含量最高，為36.272 5×10-5g/g。因此選擇接種量15%為響應(yīng)面設(shè)計(jì)中心點(diǎn)。

2.2 Box-Behnken試驗(yàn)

2.2.1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2，回歸模型方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，P值＜0.05即為顯著。方差分析結(jié)果可見(jiàn)，模型顯著，AC、BC、CD、A2、C2、D2均為顯著（P＜0.05），失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明該模型適合對(duì)該試驗(yàn)進(jìn)行分析。試驗(yàn)各因素對(duì)吡嗪類產(chǎn)量的影響程度由大到小依次為A（麩皮添加量）＞D（接種量）＞B（水分含量）＞C（培養(yǎng)時(shí)間）。

通過(guò)分析得到編碼后4個(gè)因素與吡嗪類含量擬合成的多元二次方程為：

表2　Box-behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiment

表3　回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.2.3響應(yīng)面分析與優(yōu)化

根據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)面分析圖，以確認(rèn)麩皮添加量、水分含量、培養(yǎng)時(shí)間、接種量對(duì)吡嗪類物質(zhì)含量的影響，響應(yīng)面曲面和等高線見(jiàn)圖5。

圖5　麩皮添加量、水分含量、培養(yǎng)時(shí)間、接種量交互作用對(duì)吡嗪類物質(zhì)含量影響的響應(yīng)曲面和等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction betueen bran addition，water content，inoculum on pyrazine content

由圖5可知，麩皮添加量與水分含量交互作用、麩皮添加量與培養(yǎng)時(shí)間交互作用、麩皮添加量與接種量交互作用、水分含量與培養(yǎng)時(shí)間交互作用、水分含量與接種量交互作用、培養(yǎng)時(shí)間與接種量交互作用的顯著性情況與表3中交互項(xiàng)P值的分析結(jié)果一致。

響應(yīng)面的坡度較為陡峭，表明吡嗪類的產(chǎn)量對(duì)麩皮添加量和水分含量、麩皮添加量和培養(yǎng)時(shí)間、麩皮添加量和接種量、水分含量和培養(yǎng)時(shí)間、水分含量和接種量、培養(yǎng)時(shí)間和接種量的變化較為敏感。在麩皮量不變的條件下，隨著水分含量水平的逐漸提高，吡嗪類產(chǎn)量呈先上升后下降的變化趨勢(shì)；在水分含量不變的條件下，隨著麩皮量的逐漸增加，吡嗪類產(chǎn)量呈先上升后下降的趨勢(shì)，且變化較大，其他交互因素同上。

等高線呈圓形，表明兩因素之間的交互作用強(qiáng)度較弱，影響不顯著。等高線圓形，表明兩因素之間的交互作用強(qiáng)度較強(qiáng)，影響顯著。

通過(guò)Design Expert（v8.0.6）軟件分析，制作麩曲的最佳條件為麩皮量114.61 g、水分含量30%、培養(yǎng)時(shí)間36 h、接種量12%，此條件下吡嗪類產(chǎn)量的理論值為36.5473×10-5g/g。

考慮到實(shí)際操作方便性，將麩皮添加量定為115 g。故本試驗(yàn)所得最佳條件為麩皮量115 g、水分含量30%、培養(yǎng)時(shí)間36 h、接種量12%。

2.3回歸模型的驗(yàn)證試驗(yàn)

為檢測(cè)所得結(jié)果的可靠性，對(duì)上述優(yōu)化條件進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，即麩曲量115g、水分含量30%、培養(yǎng)時(shí)間36 h、接種量12%，實(shí)際測(cè)得的平均吡嗪類產(chǎn)量為36.3645×10-5g/g，理論值與試驗(yàn)值的相對(duì)偏差為0.497%，證明應(yīng)用響應(yīng)曲面法優(yōu)化細(xì)菌產(chǎn)吡嗪類的培養(yǎng)條件是可行的。

3　結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)單因素試驗(yàn)分析了培養(yǎng)條件對(duì)吡嗪類產(chǎn)量的影響，并結(jié)合Box-Behnken設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析，建立了二次多項(xiàng)式模型，并經(jīng)顯著性檢驗(yàn)證明了該模型具有可靠性。所得二次回歸方程為：Y=34.76+0.59A+0.28B-0.16C-0.38D-0.46AB-2.23AC-0.11AD+1.65BC+0.45BD+2.14CD-2.89A2-0.51B2-1.80C2-1.40D2。得到最佳發(fā)酵條件為麩曲量115 g、水分含量30%、培養(yǎng)時(shí)間36 h、接種量12%。在此條件下，吡嗪類物質(zhì)含量為36.3645×10-5g/g。

［1］SEITZ E W.Bioprocess production of flavor，fragrance，and color ingredients［M］.New York∶Wiley，1994.

［2］吳建峰.白酒中四甲基吡嗪全程代謝機(jī)理研究［D］.無(wú)錫：江南大學(xué)博士論文，2013.

［3］周永妍，李亞，余愛(ài)農(nóng).頂空固相微萃取法萃取Maillard反應(yīng)體系中吡嗪類化合物的條件優(yōu)化［J］.食品科學(xué)，2015，37（6）：119-123.

［4］趙德義，湯丹丹，曹建全，等.產(chǎn)四甲基吡嗪微生物菌株的選育［J］.中國(guó)釀造，2015，34（3）：103-106.

［5］張世仙，金茜，曾啟華，等.茅臺(tái)醬香型酒糟香氣成分分析［J］.中國(guó)釀造，2012，31（1）：188-189.

［6］XIAO Z J，XIE N Z，LIU P H，et al.Tetramethylpyrazine production from glucose by a newly isolatedBacillusmutant［J］.Appl Microbiol Biot，2006，73（3）∶512-518.

［7］KIM K S，LEE H J，SHON D H，et al.Optimum conditions for the production of tetramethylpyrazine flavor compound by aerobic fed-batch culture ofLactococcus lactissubsp.Lactisbiovar.Diacetylactis FC1［J］.J Microbiol Biotech，1994，4（4）∶327-332.

［8］劉露，李麗，閆洪雪，等.一株蘋果內(nèi)生枯草芽孢桿菌BS10的發(fā)酵條件優(yōu)化研究［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2015（23）：131-132，139.

［9］莊名揚(yáng)，王仲文，孫達(dá)孟，等.美拉德反應(yīng)與醬香型白酒［J］.釀酒，1999（4）：44-46.

［10］王慶國(guó)，劉天明，韓小龍，等.兩株產(chǎn)果香菌株的初步鑒定及香味成分分析［J］.食品研究與開(kāi)發(fā)，2007，28（6）：16-19.

［11］成堃，路福平，李玉，等.產(chǎn)堿性蛋白酶菌株的篩選、分子鑒定及其酶學(xué)性質(zhì)的初步研究［J］.中國(guó)釀造，2009，28（2）：33-36.

［12］KOSUGE T，KAMIYA H.Discovery of a pyrazine in a natural product-tetramethylpyrazine from cultures of a strain ofBacillus subtilis［J］. Nature，1962，193（4817）∶776-776.

［13］ZAK D L，OSTOVAR K，KEENEY P G.Implication ofBacillus subtilis in the synthesis of tetramethylpyrazine during fermentation of cocoa beans［J］.J Food Sci，1972，37（37）∶967-968.

［14］HUANG T C，F(xiàn)U H Y，HO C T.Mechanistic studies of tetramethylpyrazine formation under weak acidic conditions and high hydrostatic pressure［J］.J Agr Food Chem，1996，44（1）∶240-246.

［15］唐清蘭，徐姿靜，徐占成，等.劍南春酒體風(fēng)味物質(zhì)吡嗪類生成功能菌株的選育［J］.釀酒，2013（3）：23-27.

［16］祝賽峰，吳建峰，趙錫榮，等.響應(yīng)面法優(yōu)化枯草芽孢桿菌S0507產(chǎn)四甲基吡嗪的培養(yǎng)條件［J］.食品科學(xué)，2014，35（9）：218-223.

［17］朱兵峰.枯草桿菌兩步法生產(chǎn)四甲基吡嗪的調(diào)控及機(jī)制的研究［D］.無(wú)錫：江南大學(xué)博士論文，2010.

Optimization of Processing technology of Fuqu with pyrazine-producing bacteria

WU Shun，WANG Deliang，YAN Yinzhuo*
（China National Research Institute of Food and Fermentation Industries，Beijing 100015，China）

The process of pyrazine-producing bacteria used inFuquwas studied.The bacteria were screened from differentDaqu，and the effect of different factors on pyrazine production was investigated.The effects of bran addition，water content，culture time and inoculum were investigated by single factor and response surface experiments during the production ofFuqu.The results showed that the factors affecting pyrazine production in order was bran addition，inoculum，water content and culture time.The optimal processing condition was bran 115 g，water content 30%，culture time 36 h and inoculum 12%.Under the optimized condition，the pryzine production was 36.36×10-5g/g.

pyrazine；response surface methodology；process optimization

TS201.1

0254-5071（2016）02-0013-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.02.004

2015-12-03

國(guó)家自然科學(xué)基金（31401680）

武順（1987-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。

閆寅卓（1986-），女，高級(jí)工程師，博士，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。