生殖支原體16SrRNA基因和MgPa基因TaqMan熒光聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)的比較研究*

唐正宇，王碧玉，蔡亮，謝良伊，姚玲，王太林

（1.長(zhǎng)沙衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410100；2.湖南省疾病預(yù)防控制中心；3.湖南省人民醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410005）

論著

生殖支原體16SrRNA基因和MgPa基因TaqMan熒光聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)的比較研究*

唐正宇1，王碧玉1，蔡亮2，謝良伊3，姚玲1，王太林1

（1.長(zhǎng)沙衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410100；2.湖南省疾病預(yù)防控制中心；3.湖南省人民醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410005）

目的對(duì)生殖支原體（Mg）16SrRNA基因和MgPa基因TaqMan熒光聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，選取敏感度更高的靶基因進(jìn)行TaqMan熒光PCR檢測(cè)。方法選取Mg 16SrRNA基因和MgPa基因?yàn)榘谢?，根?jù)已報(bào)道文獻(xiàn)設(shè)計(jì)合成特異性擴(kuò)增引物和探針，對(duì)泌尿生殖道拭子標(biāo)本進(jìn)行TaqMan熒光PCR檢測(cè)，對(duì)Mg不同靶基因TaqMan熒光PCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果Mg 16SrRNA基因TaqMan熒光PCR檢測(cè)敏感性為90%，MgPa基因TaqMan熒光PCR檢測(cè)敏感性為97.5%。結(jié)論MgPa基因TaqMan熒光PCR敏感性要高于16SrRNA基因TaqMan熒光PCR。

生殖支原體；16SrRNA基因；M gPa基因；TaqM an熒光聚合酶鏈反應(yīng)

生殖支原體（mycoplasma genitalium，Mg）是支原體的一種，由TULLY等于1981年從男性非淋菌性尿道炎（nongonococcal urethritis，NGU）患者尿道分泌物中分離出來(lái)，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的能夠自我復(fù)制的最小原核細(xì)胞型微生物［1］。在男性NGU中的感染率可達(dá)21%～45%［2-4］，2009年歐洲NGU治療指南已明確Mg是NGU病原體之一［2］。目前Mg難以培養(yǎng)，臨床標(biāo)本分離率低，血清學(xué)試驗(yàn)與其他支原體存在較強(qiáng)的交叉反應(yīng)，在實(shí)際檢測(cè)中存在很大局限性。常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）對(duì)臨床標(biāo)本中Mg的檢測(cè)缺乏定量評(píng)估，針對(duì)MgPa和16SrRNA兩個(gè)靶基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR技術(shù)在Mg檢測(cè)方面得到一定的應(yīng)用，但國(guó)內(nèi)外沒有對(duì)這兩種基因TaqMan熒光PCR檢測(cè)結(jié)果對(duì)比的文獻(xiàn)報(bào)道，難以選擇優(yōu)勢(shì)基因用于TaqMan熒光PCR檢測(cè)，本研究對(duì)同一批臨床標(biāo)本根據(jù)已報(bào)道的文獻(xiàn)針對(duì)16SrRNA基因和MgPa基因設(shè)計(jì)引物和探針進(jìn)行Mg的核酸檢測(cè)，對(duì)兩種檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較研究，選取敏感度更高的靶基因作為TaqMan熒光PCR檢測(cè)方法，用于臨床上Mg感染者基因快速、準(zhǔn)確的診斷。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1Mg標(biāo)準(zhǔn)菌株來(lái)源Mg G-37標(biāo)準(zhǔn)株由南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所惠贈(zèng)。

1.1.2標(biāo)本來(lái)源中南大學(xué)湘雅醫(yī)院皮膚性病就診患者、湖南省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科泌尿生殖道拭子標(biāo)本246例?；颊咄瑫r(shí)行淋球菌、解脲脲原體、衣原體性病常規(guī)檢查均為陰性。經(jīng)常規(guī)Mg 16SrRNA基因PCR檢測(cè)為陽(yáng)性40例，并經(jīng)核酸測(cè)序證實(shí)；陰性標(biāo)本206例。

1.1.3主要試劑及儀器Qiamp DNA mini kit（德國(guó)QIAGEN公司），Hot Star DNA taq酶、dNTP mixture、Platinum Taq DNA polymerase（美國(guó)Invitrogen公司），PCR nucleotide mix、Nuclease-free water（美國(guó)Promega公司），PCR產(chǎn)物純化試劑盒（美國(guó)Omega公司）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司7300型）。

1.2方法

1.2.1引物探針設(shè)計(jì)根據(jù)JESEN［5］等文獻(xiàn)設(shè)計(jì)引物、探針。引物和探針委托Invitrogen生物工程公司合成。見表1、2。

1.2.2Mg DNA的提取拭子標(biāo)本及標(biāo)準(zhǔn)菌液的DNA提取使用德國(guó)QIAGEN公司的Qiamp DNAmini kit試劑盒，具體操作參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，置入-20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

表1　TaqMan熒光PCR中針對(duì)MgPa基因的引物及探針

表2　TaqMan熒光PCR中針對(duì)16SrRNA基因的引物及探針

1.2.3MgPa基因TaqMan熒光PCR總反應(yīng)體系25μl，在反應(yīng)管內(nèi)依次加入：1×PCR反應(yīng)液，3.5 mmol/L氯化鎂 MgCl2，200 mmol/L dNTP，0.625 U DNAtaq酶，1.0 mmol/L正向引物MgPa-335 F，1.0 mmol/L反向引物MgPa-432R，0.1mmol/L探針Mg-Pa-380，5μl DNA模板，ABI 7300型實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件：50℃、1min，95℃、10min，1個(gè)循環(huán)，95℃變性15 s，60℃退火1min，共50個(gè)循環(huán)。每個(gè)反應(yīng)板設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)菌株陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照組。

1.2.4Mg 16SrRNA基因TaqMan熒光PCR總反應(yīng)體系50μl，在反應(yīng)管內(nèi)依次加入：1×PCR反應(yīng)液，5 mmol/L氯化鎂 MgCl2，200 mmol/L dNTP，1.25U DNA taq酶2.0mmol/L正向引物My-ins，2.0 mmol/L反 向引物 MGSO-2，0.1mmol/L探針Mgen-P1，4μl DNA模板。ABI7300型實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件：50℃、2min，95℃、10min，1個(gè)循環(huán)，95℃變性15 s，66℃退火1min，共60個(gè)循環(huán)。每個(gè)反應(yīng)包括陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照組。

2　結(jié)果

2.1MgPa基因TaqMan熒光PCR檢測(cè)結(jié)果

對(duì)246例泌尿生殖道拭子標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，MgPa基因TaqMan熒光PCR擴(kuò)增陽(yáng)性為45例，與常規(guī)16SrRNA基因PCR檢測(cè)結(jié)果比較陽(yáng)性符合率為97.5%（39/40），陰性符合率為97.1%（200/206），總符合率為97.2%（239/246）。

2.2Mg 16SrRNA基因TaqMan熒光PCR檢測(cè)結(jié)果

對(duì)同一批246例臨床標(biāo)本檢測(cè)，Mg 16SrRNA基因TaqMan熒光PCR擴(kuò)增陽(yáng)性為38例，與常規(guī)16SrRNA基因PCR檢測(cè)結(jié)果比較陽(yáng)性符合率為90.0%（36/40），陰性符合率為99.0%（204/206），總符合率為97.6%（240/246）。

從檢測(cè)結(jié)果中筆者發(fā)現(xiàn)，3種PCR中都為陽(yáng)性的有36例標(biāo)本。有3例標(biāo)本為常規(guī)16SrRNA基因PCR和MgPa基因TaqMan熒光PCR檢測(cè)都為陽(yáng)性的。僅MgPa基因TaqMan熒光PCR檢測(cè)和Mg 16SrRNA基因TaqMan熒光PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的有2例。但有4份標(biāo)本僅是MgPa基因TaqMan熒光PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的，經(jīng)再次檢測(cè)后仍為陽(yáng)性。通過(guò)檢測(cè)結(jié)果比較，MgPa基因TaqMan熒光PCR敏感性（97.5%）要高于16SrRNA基因TaqMan熒光PCR（90%）。見附圖。

附圖　Mg 16SrRNA基因和MgPa基因TaqMan熒光PCR檢測(cè)結(jié)果比較

3　討論

YOSHIDA等［6］于2002年發(fā)表第一個(gè)實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)Mg的報(bào)道。EDBERG［7］和JURSTRAND［8］等報(bào)告顯示，與傳統(tǒng)的16SrRNA基因PCR比較，實(shí)時(shí)的16SrRNA基因的PCR的敏感性較低。JURSTRAND等［8］文獻(xiàn)里指出男性泌尿生殖道標(biāo)本Mg實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)與常規(guī)PCR比較，敏感性為72.2%，特異性為99.7%。

在本研究中對(duì)Mg 16SrRNA基因和MgPa基因TaqMan熒光PCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。根據(jù)最新文獻(xiàn)檢測(cè)報(bào)道，采集泌尿生殖道拭子標(biāo)本要優(yōu)于首段尿標(biāo)本，其敏感度更顯著，故本研究中采集的標(biāo)本為泌尿道拭子。對(duì)246例臨床標(biāo)本進(jìn)行MgPa基因和16SrRNA基因的Taqman熒光PCR檢測(cè)結(jié)果的比較發(fā)現(xiàn)，MgPa基因TaqMan熒光PCR敏感性要高于16SrRNA基因TaqMan熒光PCR，MgPa基因Taq-Man熒光PCR證實(shí)是最敏感的方法。在筆者的比較研究中，實(shí)時(shí)16SrRNA基因PCR在試驗(yàn)中需要4μl DNA模板，而實(shí)時(shí)MgPa基因的PCR在試驗(yàn)中需要5μl DNA模板，這可能與16SrRNA作為實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)的靶基因敏感性較低有關(guān)。MgPa基因作為實(shí)時(shí)PCR的靶基因更適合臨床Mg的診斷，能為今后開展人群中Mg的感染調(diào)查、定量分析Mg感染量與臨床表現(xiàn)的關(guān)系及開展耐藥監(jiān)測(cè)提供依據(jù)。

［1］DORMAN C J.Regulation of transcription by DNA supercoiling in Mycoplasma genitalium；global control in the smallest known self-replicating genome［J］.Mol Microbiol，2011，81（2）:302-304.

［2］SHAHMANESH M，MOI H，LASSAU F，et al.2009 European guideline on the of male non-gonococcal urethritis［J］.Int J STD AIDS，2009，20（7）:458-464.

［3］MOI H，REINTON N，MOGHADDARA A.Mycoplasma genitalium is associated with symptomatic and asymptomatic non-gono coccal urethritis in men［J］.Sex Transm Infect，2009，85（1）:15-18.

［4］COX C，MCKENNA J P，WATT A P，et al.Ureaplasma parvum and mycoplasma genitalium are found to be significantly associated with microscopy-confirmed urethritis in a routine genitourinary medicine setting［J］.Int JSTD AIDS，2015，16:DOI: 10.1177/0956462415597620.

［5］JENSEN J S，BJ?RNELIUS E，DOHN B，et al.Use of TaqMan 5'nuclease real-time PCR for quantitative detection of Mycoplasma genitalium DNA in males with and without urethritis who were attendees at a sexually transmitted disease clinic［J］.J Clin Microbiol，2004，42:683-692.

［6］YOSHIDA T，DEGUCHI T，ITO M，et al.Quantitative detection of mycop lasma genitalium from first-pass urine of men with urethritis and asymptomaticmen by real-time PCR［J］.J Clin Microbiol，2002，40（4）:1451-1455.

［7］EDBERG A，JURSTRAND M，JOHANSSON E，et al.comparative study of three different PCR assays for detection of mycoplasma genitalium in urogenital specimens from men and women［J］.J Med Microbiol，2008，57（3）:304-309.

［8］JURSTRAND M，JENSEN JS，F(xiàn)REDLUND H，et al.Detection of mycoplasma genitalium in urogenital specimens by real-time PCR and by conventional PCR assay［J］.Journal of Medical Microbiology，2005，54:23-29.

（張蕾編輯）

Com parative study of TaqM an fluorescence PCR assay detection of m ycop lasma genitalium by 16SrRNA gene and M gPa gene*

Zheng-yu Tang1，Bi-yu Wang1，Liang Cai2，Liang-yi Xie3，Ling Yao1，Tai-lin Wang1
（1.Changsha Health Vocational College，Changsha，Hunan 410100，China；2.Hunan provincial Center for Disease Control and Prevention，Changsha，Hunan 410005，China；3.Hunan People's Hospital，Changsha，Hunan 410005，China）

Objective To compare the TaqMan fluorescence PCR detection results betweenmycoplasma genitalium 16SrRNA gene and MgPa gene.Methods Mycoplasma genitalium 16SrRNA gene and MgPa gene were selected as target genes.According to the reported literatures，the specific amp lified primers and probes were designed and synthesized.Urinary tract swab specimens were detected by TaqMan fluorescent PCR.The results of TaqMan fluorescence PCR detection of different target genes of Mycop lasma genitalium were statistically analyzed.Results The detection sensitivity of 16SrRNA gene and MgPa gene ofmycoplasma genitalium TaqMan PCR was 90%and 97.5%，respectively.Conclusions The sensitivity of TaqMan PCR in the genitalmycoplasma MgPa gene is higher than that of the 16SrRNA gene.

mycoplasma genitalium；16SrRNA gene；MgPa gene；TaqMan fluorescence PCR

R 446.5；R 375；

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.12.009

1005-8982（2016）12-0041-03

2016-02-17

湖南省教育廳科研基金項(xiàng)目（No：14C0090）