抗環(huán)瓜氨酸肽抗體膠體金定量檢測方法的建立

王夢露，王云龍，石曉衛(wèi)，李玉林，王繼創(chuàng)，程蕾

（1.鄭州大學生命科學學院 河南 鄭州 450001；2.鄭州職業(yè)技術(shù)學院 河南 鄭州 450001；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學院三全學院 河南 新鄉(xiāng) 453003；4.河南省生物工程技術(shù)研究中心 河南 鄭州 450001）

論著

抗環(huán)瓜氨酸肽抗體膠體金定量檢測方法的建立

王夢露1，王云龍2，石曉衛(wèi)3，李玉林4，王繼創(chuàng)4，程蕾4

（1.鄭州大學生命科學學院 河南 鄭州 450001；2.鄭州職業(yè)技術(shù)學院 河南 鄭州 450001；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學院三全學院 河南 新鄉(xiāng) 453003；4.河南省生物工程技術(shù)研究中心 河南 鄭州 450001）

目的建立一種檢測人血清中抗環(huán)瓜氨酸肽（CCP）抗體含量的膠體金定量檢測方法。方法采用間接膠體金技術(shù)，對膠體金最佳標記抗體pH、最低標記抗體量、最佳T線包被濃度、金標定量儀最佳讀數(shù)時間、批內(nèi)批間精密性、回收率、臨床標本檢測等研究，建立抗CCP抗體膠體金定量檢測方法并評價其性能。結(jié)果實驗確定膠體金標記最佳pH及最低標記抗體量為1m l膠體金溶液中加入0.2mol/m l碳酸鉀K2CO33μl、鼠抗人IgG 8.8μg；T線包被濃度選擇CCP-BSA偶聯(lián)抗體1.5mg/m l；使用金標定量儀時，最佳讀數(shù)時間為14 m in。性能評價結(jié)果顯示建立的檢測方法線性范圍為50～500RU/m l，R2=0.993；精密性質(zhì)控品L1批內(nèi)CV= 2.6%，批間CV=4.52%；精密性質(zhì)控品L2批內(nèi)CV=2.5%，批間CV=4.28%；高、中、低值血清的回收率為100.96%、97.17%、91.46%；與國外試劑盒平行檢測40份抗CCP抗體臨床血清，結(jié)果顯示兩者相關(guān)性較好，回歸方程：Y=1.004X+7.968，R2=0.955。結(jié)論初步建立一種檢測人血清中抗CCP抗體含量的膠體金定量檢測方法，該方法具有較高的準確性和精密性。

抗CCP抗體；膠體金；定量檢測

類風濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種日常多見的、發(fā)病周期較慢的、致殘性較高的自身免疫性疾?。?-2］，發(fā)病期間多引起骨吸收、骨破壞、骨纖維化等不可逆性的關(guān)節(jié)病變，最終可造成患者殘疾［3］。2010年，歐洲抗風濕病聯(lián)盟（EULAR）及美國風濕病學會（ACR）共同提出了鑒定RA的新分類標準，該標準把抗環(huán)瓜氨酸肽（cyclic citrullinated peptide，CCP）抗體和類風濕因子（rheumatoid factor，RF）共同作為RA的臨床血清學診斷依據(jù)［4］，視為新的RA血清學診斷指標［5］。針對RA診斷，抗CCP抗體的敏感性為68%，特異性為98%［6］。

目前，抗CCP抗體的檢測技術(shù)主要有酶聯(lián)免疫法、化學發(fā)光法及膠體金法［7］。酶聯(lián)免疫法及化學發(fā)光法靈敏度及線性均較膠體金法好，但操作較膠體金法復雜，且適合多樣本的檢測，一次檢測需2 h左右，一定程度上限制對其的推廣。隨著金免疫層析技術(shù)的發(fā)展，金免疫層析法在定性的同時亦可實現(xiàn)定量檢測［8］，膠體金定量檢測技術(shù)具有出結(jié)果快，使用簡便，穩(wěn)定性較好，效期較長等諸多優(yōu)點［9］，適合基層醫(yī)院、室外現(xiàn)場診斷及家庭自檢使用，是現(xiàn)代“病人床邊檢測”（point of care testing，POCT）廣為應用的方法［10-13］。本實驗探索建立檢測人血清中抗CCP抗體含量的膠體金定量檢測方法，以期滿足臨床檢驗的需要。

1　材料與方法

1.1材料

抗CCP抗體線性參考品（P1=900 RU/ml、P2=700 RU/ml、P3=500 RU/ml、P4=300 RU/m l、P5=200 RU/m l、P6=100RU/m l、P7=50 RU/m l、P8=20 RU/ml）、精密性質(zhì)控品（L1=200 RU/m l、L2=100 RU/ml）、羊抗鼠多克隆抗體、CCP-BSA偶聯(lián)復合物由河南省生物工程技術(shù)研究中心提供，抗CCP抗體檢測對照試劑盒購自德國歐蒙，金標定量儀由天根生化科技有限公司提供，臨床血清標本由鄭州大學第一附屬醫(yī)院提供，無溶血，乙肝（5項）、丙肝、梅毒、艾滋病檢測陰性，其他化學試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1膠體金的制備采用檸檬酸三鈉C6H5Na3O7· 2H2O還原法制備膠體金溶液。取100m l雙蒸水放入圓底燒瓶，加熱至沸騰時開始攪拌，加入10%氯金酸HAuCl4溶液100μl，沸騰2min后，加入10%檸檬酸三鈉C6H5Na3O7·2H2O溶液150μl，溶液顏色穩(wěn)定后繼續(xù)煮沸6min，自然冷卻至室溫，雙蒸水補加至100m l，置入4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2標記抗體pH值確定向膠體金溶液中加入不同量碳酸鉀K2CO3調(diào)節(jié)膠體金溶液pH值，通過OD492/OD630雙波長掃描讀數(shù)選擇最佳標記pH值，即選出加入碳酸鉀K2CO3的量。

1.2.3標記最低抗體量的確定向最佳標記pH環(huán)境的膠體金溶液中加入不同量1mg/m l鼠抗人IgG抗體，通過OD492/OD630雙波長掃描讀數(shù)選出使膠體金穩(wěn)定的最低抗體量，最低量的10%作為膠體金標記的最適抗體量。

1.2.4T線包被濃度的選擇用0.01mol/ml pH= 7.4 PBS緩沖液作稀釋液，在T線處包被CCP抗原偶聯(lián)物，濃度分別為2.0、1.5、1.0和0.5mg/ml，在C線處包被羊抗鼠IgG，濃度為1.0mg/m l，組裝成試紙條，分別用陽性血清及陰性血清檢測，根據(jù)顯色情況選擇合適的包被濃度。

1.2.5最佳線性范圍確定選擇已定值的血清參考品（P1=900RU/m l、P2=700 RU/m l、P3=500RU/m l、P4= 300RU/m l、P5=200 RU/m l、P6=100RU/m l、P7=50RU/ ml、P8=20 RU/m l）作為樣本，以金標定量儀讀數(shù)為縱坐標，定值血清參考品濃度（RU/m l）為橫坐標，繪制曲線，選擇最佳線性范圍。在金標定量儀讀數(shù)時，分別讀取峰高和峰面積兩個參數(shù)，通過曲線繪制結(jié)果，選擇最佳讀數(shù)參數(shù)。

1.2.6精密性取精密性質(zhì)控品血清L1、L2各20份，對同一批抗CCP抗體膠體金試紙條及不同批次的抗CCP抗體膠體金試紙條進行檢測，分別計算批間精密性、批內(nèi)精密性。精密性CV=SD/平均數(shù)× 100%；臨床對檢測試劑要求批間精密性CV＜15%，批內(nèi)精密性CV＜10%。

1.2.7回收率用抗CCP抗體低值血清稀釋高值血清獲得預測濃度為500、200和50 RU/ml的3份血清，通過線性參考品標定這3份血清，通過公式：回收率=測定濃度/預測濃度×100%，計算所制備的抗CCP抗體檢測試劑的回收率。

1.3臨床標本檢測

以建立的抗CCP抗體膠體金定量檢測方法，與德國歐蒙產(chǎn)抗CCP抗體試劑盒（ELISA）對比檢測40份臨床RA患者血清標本，評價制備的膠體金定量檢測方法的檢測效果，德國歐蒙產(chǎn)試劑盒為間接ELISA方法，主要方法步驟為：加樣后室溫溫育60min，洗板3次，加入酶結(jié)合物室溫溫育30min后洗板3次，加底物避光溫育30min，加終止液，酶標儀450 nm讀數(shù)，從試劑盒標準曲線中得出抗CCP抗體含量。

2　結(jié)果

2.1最佳標記pH值確定

向容量300μl的10孔板條內(nèi)每孔加入200μl膠體金溶液；每孔分別加入0、2.0、4.0、5.0、6.0、7.0、11.0、16.0、20.0和24.0μl，0.02mol/m l碳酸鉀K2CO3，1.0 mg/m l的鼠抗人 IgG抗體 2.5μl，10%氯化鈉NaCl 40μl，室溫靜置2 h，OD492/OD630雙波長掃描讀數(shù)，實驗重復3次。結(jié)果見表1，第4～6孔的膠體金顏色最為穩(wěn)定，且OD值較為穩(wěn)定，即200μl膠體金溶液中，0.02mol/m l碳酸鉀K2CO3加入5～7μl時，溶液最為穩(wěn)定，取中間值，即0.02mol/ml K2CO3加入6μl時，達到最佳標記pH值。

2.2最低標記抗體量確定

將10支1.5ml離心管中分別加入1m l膠體金溶液，3μl 0.2mol碳酸鉀K2CO3，分別加入0、1、2、3、4、5、6、7、8和9μl 2.0mg/m l鼠抗人IgG抗體，10%氯化鈉NaCl 40μl，室溫靜置2h，OD492/OD630雙波長掃描讀數(shù)，實驗重復3次。從表2酶標儀讀數(shù)可以發(fā)現(xiàn)，向1ml膠體金溶液中加入鼠抗人IgG≥8μg時溶液較穩(wěn)定。按照2、4、6、8、10、12、14、16和18μg抗體量標記膠體金，包被量質(zhì)控C線一致、檢測T線一致，加入相同量的參考品血清P4（300 RU/m l），相同時間下觀察T線顯色情況，低于8μg顯色逐漸減弱，與酶標儀檢測結(jié)果相一致。以最低量增加10%作為膠體金標記最佳抗體量，因此1ml膠體金溶液選擇最適標記抗體量為8.8μg。

2.3T線包被濃度的選擇

當同時用血清參考品P4（300 RU/ml）檢測時，結(jié)果見圖1所示，包被濃度為1.5mg/ml時，條帶顯色最佳。將P1（900 RU/m l）血清不斷梯度稀釋，下一個濃度為上一個濃度的1/2，用4種不同包被濃度的試紙條檢測梯度血清，包被量為1.5mg/ml的顯色梯度最明顯，結(jié)果最穩(wěn)定。最終選擇T線包被濃度為1.5mg/ml。

2.4線性范圍確定

室內(nèi)血清質(zhì)控品檢測結(jié)果分別用峰高及峰面積表示，對應曲線見圖2A、圖2B，兩者對于不同濃度室內(nèi)血清參考品檢測結(jié)果的總體趨勢基本相同，分析兩條曲線可知，在P3（500 RU/m l）～P7（50 RU/m l）范圍內(nèi)，兩者均有良好的線性；通過對P3（500RU/m l）～P7（50RU/m l）范圍內(nèi)峰高及峰面積結(jié)果最線性分析，均有良好的線性關(guān)系。其中對峰高數(shù)據(jù)分析，線性方程為：Y=1.12X-44.67，R2=0.993；對峰面積數(shù)據(jù)分析，線性方程為Y=1.085X-46.93，R2=0.990，均符合R2＞0.98的要求，見圖2C、圖2D。綜上分析可知，檢測結(jié)果用峰高或峰面積表示均可，用峰高檢測最佳，試紙條最佳線性范圍為50～500RU/mL，R2=0.993。

圖1　檢測T線不同包被濃度檢測結(jié)果

表1　確定最佳pH實驗酶標儀OD492/OD630雙波長掃描讀數(shù)

表2　確定最佳標記蛋白量實驗酶標儀OD492/OD630雙波長掃描讀數(shù)

圖2　最佳線性范圍確定

2.5精密性實驗

用建立的抗CCP抗體定量檢測方法及精密性質(zhì)控品L1、L2分別對同批次及不同批次的膠體金試紙條進行精密性檢測，由表3可知，精密性質(zhì)控品L1批內(nèi)CV=2.6%，批間CV=4.52%；精密性質(zhì)控品L2批內(nèi)CV=2.5%，批間CV=4.28%，均滿足精密度批內(nèi)＜10%，批間＜15%的要求。

2.6回收率實驗

用低值血清稀釋高值血清獲得的高中低值3份血清進行回收率檢測。結(jié)果顯示，高值血清的回收率為100.96%；中值血清的回收率為97.17%；低值血清的回收率為91.46%，滿足回收率控制在85%～115%的要求。見表4。

2.7臨床標本檢測

本研究建立的抗CCP抗體膠體金定量檢測方法與德國歐蒙產(chǎn)抗CCP抗體檢測試劑盒（ELISA）同時對40份臨床血清進行檢測，見圖3。結(jié)果顯示，兩者具有很好的相關(guān)性，回歸方程為：Y=1.004X+7.968，R2=0.955。

表3　精密性檢測結(jié)果

表4　回收率檢測結(jié)果

圖3　40份臨床血清檢測結(jié)果

3　討論

當前針對抗CCP抗體檢測的技術(shù)方法主要有：酶聯(lián)免疫法，化學發(fā)光法，膠體金免疫層析法等［14］。酶聯(lián)免疫法和化學發(fā)光法可以精準定量，但檢測時間較長，對檢測環(huán)境要求較高，操作較為繁瑣；膠體金法簡便快速［15］，但現(xiàn)在市面僅有定性檢測試劑盒。本研究擬建立一種膠體金定量檢測技術(shù)，具有出結(jié)果快，使用簡便，穩(wěn)定性較好等諸多優(yōu)點，適合基層臨床醫(yī)院、室外現(xiàn)場診斷及家庭自診等使用。

在膠體金標記過程中，最為關(guān)鍵的兩個環(huán)節(jié)是控制pH值及標記蛋白的量，只有在pH值接近或略高于蛋白等電點時，兩者產(chǎn)生吸附力更強。每種蛋白等電點不同，需找出實驗標記抗體蛋白的最佳pH值，在膠體金溶液中，碳酸鉀K2CO3用量影響膠體金pH值，可通過控制碳酸鉀K2CO3用量，調(diào)節(jié)溶液pH值，確定碳酸鉀K2CO3用量即確定了標記蛋白最佳pH值?？贵w蛋白標記過多，既浪費抗體，又容易使試紙條產(chǎn)生拖帶現(xiàn)象，蛋白標記過少，降低試紙條靈敏度及穩(wěn)定性。在最佳標記pH環(huán)境中，加入不同量抗體蛋白，對膠體金溶液穩(wěn)定性產(chǎn)生影響，通過酶標儀檢測，可確定膠體金穩(wěn)定時，加入蛋白的量，考慮到操作過程的損失及膠體金溶液的穩(wěn)定性，選擇使膠體金穩(wěn)定的最少蛋白量的110%為試紙條加入抗體蛋白最低量。膠體金定量檢測中使用金標定量儀，檢測結(jié)果以光譜峰的形式顯示，會出現(xiàn)與峰對應的峰高、峰面積及峰寬等一組數(shù)據(jù)。通過對室內(nèi)質(zhì)控品檢測發(fā)現(xiàn)，峰高及峰面積與待檢物濃度相關(guān)性較好，為今后金標定量儀的使用提供一定的參考。

本研究初步建立了一種檢測人血清中抗CCP抗體含量的膠體金定量檢測方法，為進一步研制出適用于臨床診斷的抗CCP抗體膠體金定量檢測方法打下了良好的基礎。

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（張蕾編輯）

Establishm ent of colloidal gold quantitative detection method of anti-CCP antibody

Meng-lu Wang1，Yun-longWang2，Xiao-wei Shi3，Yu-lin Li4，Ji-chuangWang4，Lei Cheng4
（1.School of Life Science，Zhengzhou University，Zhengzhou，Henan 450001，China；2.Zhengzhou Technical College，Zhengzhou，Henan 450001，China；3.Sanquan college of Xinxiang Medical University，Xinxiang，Henan 453003，China；4.Henan Biotechnology Research Center，Zhengzhou，Henan 450001，China）

Objective To establish a colloidal gold quantitativemethod for detection of anti-CCP antibody levels in human serum.M ethods Indirect colloidal gold technique was used to detect colloidal gold labeled antibody best pH，minimum amountof labeled antibody，the best package concentration of T line，optimal reading time of Colloidal gold quantitative instrument，precision，recovery and clinical samp les.Anti-CCP antibody colloidal gold quantitative detectionmethod was established and its performance was evaluated.Results The colloidal gold marked optimal pH and minimum amount of labeled antibody was 1ml colloidal gold solution with 0.2mol/ml K2CO33μl，rat IgG 8.8 μg；T lines has been selected CCP-BSA coupling antibody 1.5mg/m l.The best reading time of colloidal gold quantitativemeter was 14min.Linear ranged 50～500 RU/ml，R2=0.993.Conclusions A quantitative colloidal gold kit for detection of anti-CCPwith high performance is established.

Anti-CCP antibody；colloidal gold；quantitative detectioneficiency

中國分類號：R 392.22A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.12.006

1005-8982（2016）12-0025-05

2016-03-22