野黃芩素對內(nèi)毒素血癥大鼠急性肺損傷的保護作用

王彪，袁海軍，袁娜，張文超，劉珺（.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院 急診科，湖南 衡陽 400；.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻喉科，湖南 衡陽 400）

論著

野黃芩素對內(nèi)毒素血癥大鼠急性肺損傷的保護作用

王彪1，袁海軍1，袁娜1，張文超1，劉珺2
（1.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院 急診科，湖南 衡陽 421001；2.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻喉科，湖南 衡陽 421001）

目的觀察野黃芩素對脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷的保護作用。方法將大鼠靜脈內(nèi)注射脂多糖（30mg/kg）以誘導(dǎo)急性肺損傷。1 h后分別靜脈注射不同濃度的黃芩素（0.1、0.5和1.0mmol/kg），酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測血漿中腫瘤壞死因子α，白細胞介素6和白細胞介素10的濃度；還原法檢測肺組織中亞硝酸鹽/硝酸鹽的含量；實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)和蛋白免疫印跡法（W estern blot）分別檢測一氧化氮合成酶和血紅素氧合酶-1 mRNA及蛋白的表達；HE染色觀察病理學(xué)改變情況。結(jié)果0.5和1.0mmol/kg的黃芩素能減少大鼠血漿中腫瘤壞死因子α和白細胞介素6含量，并能進一步增加白細胞介素10水平。脂多糖注射后肺組織中一氧化氮合成酶蛋白表達和血漿中一氧化氮含量顯著增加，而黃芩素處理后一氧化氮合成酶和一氧化氮水平明顯減少。脂多糖能誘導(dǎo)血紅素氧合酶-1表達，但黃芩素處理后能進一步上調(diào)血紅素氧合酶-1表達水平。血紅素氧合酶-1抑制劑錫原卟啉處理后可消除黃芩素對細胞因子及一氧化氮合成酶表達的影響。此外，黃芩素還能減少肺組織水腫及中性粒細胞滲出。結(jié)論黃芩素可能通過誘導(dǎo)血紅素氧合酶-1表達來減輕脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷。

野黃芩素；急性肺損傷；血紅素氧合酶1

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是一種以巨噬細胞、中性粒細胞過度活化為特征的臨床綜合征，病理學(xué)上表現(xiàn)為炎癥相關(guān)蛋白酶和活性氧類過度釋放以及肺內(nèi)出血而引起微血管和組織損傷、水腫和纖維蛋白沉積［1］。與急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）一樣，多種細胞因子與炎癥相關(guān)介質(zhì)參與本病的發(fā)生與發(fā)展過程，如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1（IL-1）和白細胞介素6（IL-6），高遷移率族蛋白B1（high mobility groupbox 1 protein，HMGB1）、一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase，iNOS）和一氧化氮（nitric oxide，NO）等［2］。血紅素氧合酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）是催化血紅素分解為Fe2+，膽綠素和一氧化碳CO的限速酶。研究表明，HO-1及其代謝產(chǎn)物對中性粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)具有一定的抑制作用［3］。促炎細胞因子、HMGB1以及氧化應(yīng)激均可上調(diào)HO-1表達。HO-1缺陷型小鼠中，往往伴隨有更高的氧化應(yīng)激水平與高死亡率。而給予低劑量CO誘導(dǎo)HO-1表達后，可顯著降低大鼠脂多糖（lipopolysachrides，LPS）誘導(dǎo)的肺損傷和致死性內(nèi)毒素休克。這表明HO-1對ALI的炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激具有一定的負向調(diào)控作用［4］。野黃芩素（Scutellarein，SCT）是從黃芩中分離出的一種黃酮類化合物單體。體外研究表明，SCT具有一定的抗炎與抗氧化活性，并能抑制核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factorκB，NF-κB）的激活［5-6］。但SCT對ALI是否也具有保護作用目前仍不明確。本研究旨在探究LPS誘導(dǎo)的ALI動物模型中，SCT能否調(diào)控炎癥因子與介質(zhì)的分泌，并觀察其是否與HO-1的誘導(dǎo)表達有關(guān)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

SCT純度98%，錫原卟啉（Sn-protopor phyrin，SnPP）購自美國Sigma-Aldrich公司，抗HO-1多克隆抗體，抗鼠β-actin購自美國Santa Cruz公司，辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）抗體購自英國Abcam公司，Bradford蛋白濃度測定試劑盒購自美國Bio-Rad公司，腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor Alpha，TNF-α），白細胞介素 1β（interleukin-1β，IL-1β） 和白細胞介素 10（interleukin-10，IL-10）酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒購自深圳新博盛生物科技有限公司，蛋白酶抑制劑購自瑞士Roche公司，cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Applied Biosystems公司，RNA提取試劑盒購自美國GIBCO BRL公司。雄性8～10周齡SPF級Wistar大鼠［動物許可證號：SCXK（湘）2015-0001，體重260～290 g］購自南華大學(xué)實驗動物中心。

1.2儀器與設(shè)備

Imark酶標儀購自美國Bio-Rad公司，LightCycle480實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀購自瑞士Roche公司，Mini-PROTEAN電泳儀購自美國 Bio-Rad公司，Bio-Rad Trans-Blot半干轉(zhuǎn)印儀購自美國Bio-Rad公司，F(xiàn)uji DRI-CHEM FDC 3000全自動干式生化分析儀購自日本Fuji Photo Film公司。

1.3試驗方法

1.3.1ALI模型的建立與實驗分組Wistar大鼠于（23±1）℃、（55±5）℃環(huán)境下給予正常飼料喂養(yǎng)。本研究符合該校實驗動物倫理委員會批準。大鼠采用1.5 g/kg的烏拉坦腹腔內(nèi)注射麻醉后，參照參考文獻提供的方法建立體外ALI模型，并根據(jù)不同的實驗?zāi)康姆譃?組，每組10只大鼠。①對照組：大鼠于4h內(nèi)持續(xù)頸靜脈滴注9ml生理鹽水，在滴注生理鹽水1 h后經(jīng)股靜脈注入2m l林格氏液。②LPS組：將LPS（30 mg/kg）溶解于9m l生理鹽水中，4 h內(nèi)通過頸靜脈滴入。滴注1 h后，大鼠同時給予2ml林格氏液；③SCT干預(yù)組：LPS滴入1 h后，同時滴入不同濃度SCT（0.1、0.5和1.0 mmol/kg，用林格氏液溶解）；④SnPP干預(yù)組：在LPS滴入前6 h腹腔注射30mg/kg SnPP，其他同SCT干預(yù)組。

1.3.2細胞因子測定大鼠處理結(jié)束后獲取其血清，采用ELISA測定TNF-α，IL-6和IL-10濃度。根據(jù)試劑盒提供的操作步驟，在包被有相應(yīng)細胞因子抗體的微孔板中加入100μl待血清，37℃孵育2 h。經(jīng)洗滌后，按照試劑盒的步驟分別加入一抗、二抗孵育。顯色后，測定450nm處的吸光度值，并根據(jù)標準曲線計算TNF-α，IL-6和IL-10的濃度。

1.3.3亞硝酸鹽/硝酸鹽的測定獲取處理后的大鼠血漿30μl，加入60μl 95%乙醇4℃孵育30min以去沉淀血漿蛋白。14 000 r/min離心5min隨后加入1mol/L氯化氫HCl（含0.8%氯化釩VCl3），使其將樣本中的亞硝酸鹽/硝酸鹽還原為一氧化氮NO，并用Sievers一氧化氮分析儀測量其濃度，通過與標準的硝酸鈉溶液進行比較，從而間接反應(yīng)亞硝酸鹽/硝酸鹽的含量。

1.3.4實時定量PCR檢測iNOS和HO-1mRNA表達用Trizol試劑提取大鼠肺組織總RNA并測量其濃度。取2μg RNA將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。設(shè)計并合成HO-1，iNOS與β-actin引物，其中HO-1引物序列分別為：5'-CGTGCAGAGAATTCTGAGTTC-3'（正向引物）和5’-AGACGCTTTACGTAGTGCTG-3'（反向引物）；iNOS：5'-GCAGGTTGAGGATTACTTCTT CCA-3'（正向引物）和5'-GCCCTTTTTTGCTCCATAG GAAA-3'（反向引物）；β-actin：5'-CCTGTATGCCTC TGGTCGTA-3'（正向引物）和5'-CCATCTCTTGCTCG AAGTCT-3'（反向引物）。將上述cDNA產(chǎn)物置于Miniopticon實時定量PCR儀器上，設(shè)置反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10min，95℃變性10 s、61℃退火20 s、72℃延伸10 s，共35個循環(huán)。通過比較iNOS和HO-1和β-actin的Ct值，計算其相對倍數(shù)表示（2-ΔΔCt）。

1.3.5蛋白免疫印跡法（W estern blot）檢測蛋白表達將肺組織中加入含蛋白酶抑制劑的Cocktails并制成勻漿。采用Pierce公司提供的RAPI蛋白提取試劑盒提取總蛋白，并用Bradford法測定蛋白濃度。并獲取20μl蛋白用于SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后采用半干轉(zhuǎn)印方法將其轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上。纖維素膜用5%牛血清白蛋白室溫封閉2 h，隨后分別用相應(yīng)的一抗和二抗孵育，增強化學(xué)發(fā)光法顯影、拍照。

1.3.6病理組織學(xué)分析肺組織用10%福爾馬林固定，用石蠟包埋后制備成厚度為4μm的切片后用蘇木精和曙紅染色，并基于組織水腫和中性粒細胞滲出對肺組織的病理損傷進行評分（損傷程度分為0～3級）［7］，最終分數(shù)為水腫和滲出評分之和。

1.3.7乳酸脫氫酶檢測LPS處理6 h后，獲取大鼠血漿，全自動生化儀上測定其乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）含量。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較用方差分析，組間比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1SCT對血漿TNF-α，IL-6和IL-10水平的影響

對照組大鼠血漿中TNF-α，IL-6和IL-10濃度較低。給予LPS注射后，其含量顯著增高。同時給予不同濃度的SCT處理后，TNF-α和IL-6有所降低，而IL-10明顯增高，各組經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）。其中，0.1mmol/kg SCT組中TNF-α與IL-6的水平，與LPS組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.186和0.261，P=0.726和0.624）；而IL-10水平與LPS組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.954，P=0.000）。若給予SnPP處理后，可顯著消除SCT對TNF-α，IL-6和IL-10的影響（與1.0 mmol/kg SCT組比較，t值分別為3.268、3.917和4.415，P=0.002，0.000和0.000）。見附表。

2.2SCT對血漿硝酸鹽/亞硝酸鹽含量及肺iNOS蛋白表達的影響

LPS注射后6 h，血漿硝酸鹽/亞硝酸鹽含量明顯增高。與LPS組比較，不同濃度SCT（0.1、0.5和1.0 mmol/kg）處理后可明顯抑制該效應(yīng)。Western blot結(jié)果顯示，對照組大鼠肺組織勻漿中iNOS蛋白表達較低，而LPS可顯著誘導(dǎo)iNOS蛋白表達。雖然SCT 0.1mmol/kg和SCT 0.5mmol/kg并不能明顯影響iNOS的表達，但1.0mmol/kg SCT處理后，iNOS表達水平顯著減少。而同時給予SnPP處理后，可消除SCT對iNOS的抑制效應(yīng)。見圖1。

附表　不同濃度SCT對ALI大鼠血漿細胞因子水平的影響?。ǎ?/p>

附表　不同濃度SCT對ALI大鼠血漿細胞因子水平的影響?。ǎ?/p>

IL-10/（pg/m l）對照組　31.5±11.7　15.5±8.1　22.3±5.2 LPS組　858.4±51.3　106.6±12.8　486.8±26.4 SCT組（0.1mmol/kg）　858.4±51.3　96.5±9.7　902.4±44.2 SCT組（0.5mmol/kg）　476.2±18.2　62.5±10.7　752.6±36.2 SCT組（1.0mmol/kg）　465.6±29.4　45.3±8.2　978.5±25.6 SnPP+SCT組（1.0mmol/kg） 85.4±33.6　78.1±6.5　589.1±37.5 F值　17.832　13.052　25.564 P值　0.000　0.000　0.000組別TNF-α/（ng/m l）IL-6/（ng/ml）

2.3SCT對肺HO-1mRNA和HO-1蛋白表達的影響

與對照組比較，大鼠注射LPS后肺HO-1mRNA表達增高。不同濃度SCT處理后HO-1mRNA水平進一步（P＜0.05），HO-1蛋白表達與qPCR結(jié)果類似。見圖2。

2.4SCT對肺組織病理變化的影響

LPS所致的ALI以水腫和炎癥細胞浸潤為主要特征。光學(xué)顯微鏡結(jié)果表明，肺臟正常組織學(xué)評分為1。注射LPS后不僅引起肺泡間質(zhì)彌漫性水腫，同時引起肺泡含氣空間明顯減少，其組織學(xué)評分為5。1.0mmol/kg SCT處理LPS大鼠后，肺組織學(xué)評分降低至3分。見圖3。

2.5SCT對LPS誘導(dǎo)所致細胞損傷的影響

LPS處理6h后，血漿中LDH的水平顯著高于對照組（P＜0.05）。而0.1、0.5和1.0mg/kg劑量SCT處理后，可顯著降低血漿LDH的水平增加（P＜0.05），但不同劑量SCT對LDH的影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義。而SnPP預(yù)處理后可逆轉(zhuǎn)SCT對LDH的抑制效應(yīng)（P＜0.05）。見圖4。

圖1　SCT對血漿硝酸鹽/亞硝酸鹽含量及肺iNOS蛋白表達的影響

圖2　SCT對肺HO-1 m RNA和HO-1蛋白表達的影響

圖3　SCT對肺組織病理變化的影響 （×200）

圖4　SCT對LPS誘導(dǎo)所致細胞損傷的影響

3　討論

ALI和ARDS一樣，其病理生理學(xué)改變是廣泛性肺泡毛細血管損傷，導(dǎo)致其透性增加而引起肺水腫和中性粒細胞滲出，從而導(dǎo)致呼吸功能受損和低氧血癥發(fā)生。因此，抑制肺部炎癥反應(yīng)強度是治療ALI的重要途徑。有研究表明，SCT具有多種藥理學(xué)活性，包括抗炎、抗氧化應(yīng)激損傷等效應(yīng)［5］。本研究采用不同濃度SCT處理ALI大鼠后，發(fā)現(xiàn)它能降低ALI大鼠血漿中IL-6的濃度，同時也能增加IL-10的水平。IL-6是一種促炎細胞因子，它在啟動炎癥反應(yīng)和休克早期高凝狀態(tài)發(fā)揮至關(guān)重要作用。而IL-10對炎癥具有抑制作用，它能負向調(diào)控微生物所致的感染性休克［8-9］。本研究結(jié)果也顯示，SCT能下調(diào)巨噬細胞中iNOS的表達與TNF-α的分泌。iNOS是催化L-精氨酸為NO的限速酶，是一種誘導(dǎo)型酶類。生理條件下細胞內(nèi)iNOS活性很低。LPS、細胞因子等因素可顯著上調(diào)其表達水平，并產(chǎn)生高濃度的NO。NO可誘導(dǎo)細胞內(nèi)產(chǎn)生大量cGMP，后者對血管平滑肌細胞具有舒張作用，同時NO也能影響血管對其他活性分子的敏感性，從而進一步降低血壓、加重休克的發(fā)生［10］。此外，NO可產(chǎn)生過氧亞硝酸鹽，它具有細胞毒性［11］。本研究也發(fā)現(xiàn)，SCT處理后，細胞內(nèi)亞硝酸鹽含量也明顯減少，這表明SCT能明顯抑制由LPS誘導(dǎo)的亞硝酸鹽/硝酸鹽形成，最終抑制NO的產(chǎn)生。

IL-10的另一個重要生物學(xué)作用是能上調(diào)HO-1的表達。HO-1是催化血紅素降解為一氧化碳CO、鐵離子Fe2+和膽綠素的限速酶，它在機體的炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激中發(fā)揮細胞保護作用［12］。HO-1主要是通過其代謝產(chǎn)物來發(fā)揮作用。CO和膽綠素不僅可抑制巨噬細胞中iNOS的轉(zhuǎn)錄表達和TNF-α生成，同時也能增加抗炎癥細胞因子IL-10的表達，形成正反饋而調(diào)控炎癥反應(yīng)。如有研究顯示給予HO-1誘導(dǎo)劑CoPP能明顯抑制TNF-α和HMGB11的表達，從而緩解LPS所致ALI的病情［13］。此外，HO-1缺陷型小鼠IL-10水平降低，但IL-6產(chǎn)生增加，并且對內(nèi)毒素的敏感性大大增強［14］。這些結(jié)果證明HO-1能負向調(diào)節(jié)IL-6、正向調(diào)節(jié)IL-10的分泌，從而減少內(nèi)毒素所致器官損傷。本研究也證實，SCT處理后，大鼠肺組織中HO-1的表達水平明顯增高，而采用其抑制劑SnPP處理后，可明顯消除SCT對細胞因子分泌以及iNOS和LDH的抑制作用，這表明SCT最終可能通過上調(diào)HO-1的表達而參與其對ALI的保護作用。

HO-1的調(diào)控機制非常復(fù)雜，絲裂原活化蛋白激酶、核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2以及活性氧類均是誘導(dǎo)其表達的重要因素［12，15］。有研究顯示，SCT可以影響絲裂原活化蛋白激酶的活性［16］，因此它可能參與HO-1表達的調(diào)控，但這仍有待進一步研究。此外，在本研究當(dāng)中筆者使用的SCT劑量范圍相對較窄。大劑量SCT或整個實驗過程中持續(xù)輸注SCT可能更為有效?？傊?，本研究證實SCT能有效改善LPS所致的ALI，其細胞保護作用可能歸因于其抑制TNF-α、IL-6的分泌以及iNOS的表達，以及促進IL-10和HO-1表達有關(guān)。

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（張蕾編輯）

Protective effect of scutellarein on acute lung injury in endotoxem ic rats

BiaoWang1，Hai-jun Yuan1，Na Yuan1，Wen-chao Zhang1，Jun Liu2
（1.Department of Emergency，the Second Affiliated Hospital of Nanhua University，Hengyang，Hunan 421001，China；2.Departmentof Otorhinolaryngology，the First Affiliated Hospital of Nanhua University，Hengyang，Hunan 421001，China）

Objective To observe the protective effect of scutellarein on acute lung injury（ALI）in endotoxem ic rats.M ethods Rats were administered LPS（30 mg/kg）by intravenous infusion to induce ALI.Scutellarein（0.1，0.5 and 1.0 mmol/kg）was given 1 h after LPS initiation.Levels of TNF-α，IL-6 and IL-10 in serum and levels of nitrite/nitrate production weremeasured by ELISA and reduction method respectively.Expression of the mRNA and protein of iNOSand HO-1 were detected by qPCR and Western blot，respectively.The tissue injury was analyzed by histopathology.Results Scutellarein（0.5 and 1.0mmol/kg）attenuated plasma levels of TNF-αand IL-6 caused by LPS，and increased IL-10 levels compared with the LPS group.At 6 h after LPS initiation，the expression of iNOS protein in lung and the lever of NO in plasma weremarkedly increased，which were reduced by scutellarein（1.0 mmol/kg）.LPS caused a significant HO-1 induction，whereas administration of scutellarein（1.0 mmol/kg）significantly induced higher HO-1 expression compared with the LPSgroup.The beneficial effects of scutellarein on cytokines and iNOS expression were reversed with HO-1 inhibitor SnPP.The edema and infiltration of neutrophils into lungs was reduced by scutellarein.Conclusions Scutellarein may induce the expression of HO-1 to alleviate LPS-induced ALI.

scutellarein；acute lung injury；hemeoxygenase-1

R 453.9；R-332

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.12.004

1005-8982（2016）12-0015-06

2016-03-28

劉珺，E-mail：liujunusc@sina.com；Tel：13786431102