促紅細(xì)胞生成素后處理對(duì)大鼠腎臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

孫倩倩，程遠(yuǎn)，孟曉華，史國輝

（華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院，1.腎內(nèi)科，2.心胸外科，河北 唐山 063000）

論著

促紅細(xì)胞生成素后處理對(duì)大鼠腎臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

孫倩倩1，程遠(yuǎn)2，孟曉華1，史國輝1

（華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院，1.腎內(nèi)科，2.心胸外科，河北 唐山 063000）

目的探討促紅細(xì)胞生成素（EPO）后處理對(duì)大鼠腎臟缺血再灌注損傷（IRI）的保護(hù)作用。方法將18只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）、缺血再灌注損傷組（IR I組）及EPO后處理組（EPO組）。采用全自動(dòng)生化分析儀檢測血清尿素氮（BUN）及肌酐（Cr）含量；用HE染色觀察病理組織學(xué)變化；用免疫組織化學(xué)法檢測腎組織中HSP70的表達(dá)。結(jié)果IR I組血清BUN及C r含量較Sham組明顯升高，EPO后處理組血清BUN及Cr含量介于Sham組和IRI組之間；HE染色檢測發(fā)現(xiàn)IRI組腎小管上皮細(xì)胞壞死明顯；腎小管管腔擴(kuò)張，EPO后處理組較IR I組腎小管上皮壞死明顯減輕；免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)HSP70在EPO后處理組表達(dá)最強(qiáng)，Sham組表達(dá)明顯降低，IRI組表達(dá)則介于前兩者之間。結(jié)論EPO后處理能增強(qiáng)缺血再灌注損傷過程中HSP-70的表達(dá)量，因而有助于減輕腎臟的缺血再灌注損傷。

腎臟；后處理；缺血再灌注損傷；熱休克蛋白70；大鼠

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是臨床上常見的急危重癥，具有較高的發(fā)病率和死亡率［1］，而腎臟缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）是AKI的常見病因。臨床上腎臟缺血再灌注損傷發(fā)生隱匿且病程發(fā)展迅速，往往很難做到及時(shí)預(yù)防。短時(shí)間內(nèi)快速完成血流重建是挽救器官缺血損傷最好的方法，但往往在恢復(fù)血流時(shí)易導(dǎo)致再灌注損傷。因此，研究提高機(jī)體內(nèi)在的保護(hù)機(jī)制從而減輕腎臟缺血再灌注損傷的方法具有重要的臨床意義。近年來，對(duì)腎臟缺血再灌注損傷保護(hù)作用的研究多集中在缺血預(yù)處理（ischemic preconditioning，IP），缺血預(yù)處理已經(jīng)被證實(shí)能夠減輕腎缺血后再灌注損傷［2］。目前最新研究表明，再灌注最初的幾分鐘是決定腎缺血最終結(jié)局的關(guān)鍵時(shí)間段［3］，所以，與缺血預(yù)處理相比，對(duì)再灌注前進(jìn)行干預(yù)的缺血后處理（ischemic postconditioning，IPO），可能具有更強(qiáng)的可操作性和更好的應(yīng)用前景。

激活的白細(xì)胞及活性氧進(jìn)入缺血組織，出現(xiàn)顯著的呼吸爆發(fā)，產(chǎn)生大量自由基為引起組織器官缺血再灌注損傷的原因之一。文獻(xiàn)［4］報(bào)道通過誘導(dǎo)熱休克蛋白在血管壁的表達(dá)，抑制了白細(xì)胞的浸潤及血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。

促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）臨床主要用于治療腎性貧血以及腫瘤等各種慢性疾病所伴發(fā)的貧血，近年來研究發(fā)現(xiàn)，EPO有抗氧化、抑制炎癥反應(yīng)和抗凋亡等功能［5］，對(duì)多種組織臟器（如腦、心、腎等）的IRI均有保護(hù)作用。目前，相關(guān)研究表明EPO預(yù)處理對(duì)腎臟IRI具有保護(hù)作用［6］，但EPO后處理是否可以通過抗氧化機(jī)制保護(hù)腎臟尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠IRI模型，探討EPO后處理對(duì)大鼠腎臟IRI的保護(hù)機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1一般資料

8周齡健康雄性SD（Sprasue-Dawley）大鼠18只（華北理工大學(xué)動(dòng)物中心提供），體重在240～280 g之間，清潔級(jí)；飼料為華北理工大學(xué)動(dòng)物中心提供的鈷60滅菌飼料。

1.2儀器與試劑

注射用重組人促紅細(xì)胞生成素（rhEPO）3 000 IU/支（沈陽三生制藥廠，批號(hào)：201502028S）；Benckman全自動(dòng)生化儀；Olympus顯微鏡；HSP70免疫組織化學(xué)SABC試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3方法

健康雄性SD大鼠18只按隨機(jī)數(shù)字表法分成3組，每組6只：假手術(shù)組（Sham組）、缺血再灌注損傷組（IRI組）和EPO后處理組。Sham組僅開腹，切除右腎，游離左側(cè)腎臟，分離腎蒂但不夾閉，45 min后關(guān)腹。IRI組手術(shù)操作與Sham組相同，僅在切除右腎和游離左腎之后，將左腎動(dòng)脈夾閉45min再開放血管。EPO后處理組缺血45min，于再灌注前5min rhEPO（3 000 IU/kg）腹腔注射。以上3組持續(xù)再灌注24 h后留取血清及腎組織標(biāo)本。

采用Benckman全自動(dòng)生化儀測定各組大鼠腎功能指標(biāo)尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）；腎組織石蠟包埋后切片，行HE染色，Olympus顯微鏡下觀察腎組織病理學(xué)改變；采用免疫組織化學(xué)法對(duì)HSP70在大鼠腎組織內(nèi)的表達(dá)進(jìn)行分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，在方差分析有意義的基礎(chǔ)上，再采用LSD-t檢驗(yàn)法進(jìn)行兩兩比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1腎功能檢測結(jié)果

IRI組大鼠BUN、Cr水平顯著高于Sham組（P＜0.05），EPO后處理組BUN、Cr水平顯著低于IRI組（P＜0.05），見表1。

2.2HE染色顯微鏡觀察結(jié)果

HE染色顯示，Sham組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)未見明顯異常；各組腎小球光鏡下未見明顯病理改變，IRI組腎小管結(jié)構(gòu)異常，腎間質(zhì)水腫，大量炎癥細(xì)胞浸潤，腎小管上皮細(xì)胞壞死，擴(kuò)張管型形成；EPO后處理組腎小管上皮輕度水腫，炎癥細(xì)胞少見，管型罕見，病理損傷程度顯著輕于IRI組，見圖1。

表1　EPO后處理對(duì)腎臟缺血再灌注大鼠血漿BUN和Cr含量的影響 （n=6，）

表1　EPO后處理對(duì)腎臟缺血再灌注大鼠血漿BUN和Cr含量的影響 （n=6，）

注：1）與Sham組比較，P＜0.05；2）與IRI組比較，P＜0.05

組別　尿素氮（mmol/L）Sham組　6.91±0.24 IRI組　13.73±0.761）肌酐（μmol/L）52.19±3.39 121.47±9.821）EPO后處理組F值P值73.08±4.261）2）180.318 0.000 9.01±0.501）2）248.082 0.000

2.3免疫組織化學(xué)法觀察結(jié)果

采用DAB染色，并行核復(fù)染，陽性結(jié)果為棕黃色顆粒。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HSP70陽性表達(dá)主要在細(xì)胞質(zhì)，腎小球?yàn)殛幮?。Sham組中均無或少見HSP70表達(dá)，EPO后處理組HSP70表達(dá)最強(qiáng)，IRI組HSP70表達(dá)稍強(qiáng)于Sham組，但明顯弱于EPO后處理組，見圖2。

圖1　各組大鼠腎臟病理HE染色比較 （×400）

圖2　各組大鼠腎臟免疫組織化學(xué)比較 （×400）

3　討論

腎臟缺血再灌注損傷是指腎重新獲得血流后，通過各種途徑最終導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷，線粒體喪失功能，最后細(xì)胞死亡，腎臟功能受損［7］。近年來研究表明，造成腎缺血再灌注損傷的主要機(jī)制有：氧自由基增多、炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、能量代謝障礙及某些激素代謝失調(diào)等［8-10］。其中，氧化是腎臟IR最重要的病理機(jī)制之一。

EPO是由CHO細(xì)胞發(fā)酵表達(dá)的有生物活性的蛋白，其最主要的功能就是促進(jìn)紅系細(xì)胞的生長和分化，增加紅細(xì)胞的數(shù)量，糾正貧血，除此之外，EPO還可以發(fā)揮調(diào)節(jié)因子的作用使機(jī)體對(duì)缺氧產(chǎn)生適應(yīng)。最近幾年研究發(fā)現(xiàn)，EPO可與機(jī)體其他各處的EPO受體結(jié)合，發(fā)揮直接的組織保護(hù)作用，其通過抗氧化凋亡、促進(jìn)新生血管形成、抑制過度炎癥反應(yīng)等對(duì)心、腦、腎臟缺血再灌注損傷產(chǎn)生保護(hù)作用［11-14］。但目前尚未有研究表明EPO后處理對(duì)腎臟IRI的影響。

熱休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）是細(xì)胞在受到外來刺激后誘導(dǎo)合成的一組細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，具有維持細(xì)胞蛋白自穩(wěn)，提高細(xì)胞對(duì)應(yīng)激原的耐受性，保持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性，起到保護(hù)細(xì)胞的作用［15］。HSP70是分子量約為70 kD的蛋白，在熱刺激、炎癥、缺血和缺氧等情況下都可以誘導(dǎo)產(chǎn)生，對(duì)缺血和缺氧較敏感，它對(duì)細(xì)胞有明確的內(nèi)源性保護(hù)作用而成為HSPs中最受關(guān)注、研究最深入的一種［16-17］。國內(nèi)外多項(xiàng)研究表明熱休克蛋白70在缺血、缺氧及缺血再灌注中能通過抑制氧化應(yīng)激、抵抗炎性因子對(duì)器官產(chǎn)生保護(hù)作用。其中，KIM等［18］證明，藥物誘導(dǎo)HSP70生成增加可以明顯減輕腎損傷。

本研究中與Sham組比較，IRI組大鼠光鏡下觀察腎組織損傷嚴(yán)重，肌酐和尿素氮水平明顯升高，符合AKI病理表現(xiàn)，說明成功制備腎IRI動(dòng)物模型。EPO后處理組與IRI組比較，大鼠腎小管上皮細(xì)胞壞死，炎癥細(xì)胞浸潤及管型明顯減少，肌酐和尿素氮水平顯著下降。除上述病理學(xué)及血清學(xué)表現(xiàn)外，免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：Sham組可見無或少見HSP70表達(dá)，IRI組HSP70表達(dá)稍強(qiáng)，與Sham組比較，差異顯著，但明顯弱于EPO后處理組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)EPO后處理組HSP70表達(dá)明顯增強(qiáng)的研究結(jié)果，提示EPO可以促進(jìn)HSP70的表達(dá)，其機(jī)制可能是EPO對(duì)腎缺血細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上調(diào)HSP70的表達(dá)，從而使HSP70合成增加，增強(qiáng)腎臟對(duì)缺血及氧化損傷的抵抗力，從而減少大鼠腎缺血再灌注損傷。

綜上所述，EPO可以通過誘導(dǎo)HSP70生成增加，抑制腎小管上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激、減輕腎臟缺血，對(duì)腎臟產(chǎn)生保護(hù)作用。而EPO后處理由于其較缺血預(yù)處理有更好的可操作性及安全性，可望作為一種新型治療手段應(yīng)用于臨床。

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（張蕾編輯）

Effect of erythropoietin postconditioning on renal ischem iareperfusion injury in rats

Qian-qian Sun1，Yuan Cheng2，Xiao-hua Meng1，Guo-hui Shi1
（1.Department of Nephrology，Tangshan North China University of Science and Technology Affiliated Hospital，Tangshan，Hebei063000，China；2.Departmentof Cardio-thoracic Surgery，Tangshan North China University of Science and Technology Affiliated Hospital，Tangshan，Hebei 063000，China）

Objective To investigate the effectoferythropoietin（EPO）postconditioningon renal ischemia-reperfusion injury（IRI）in rats.M ethods A total of 18male Sprasue-Dawley（SD）ratswere random ly allocated to three groups: Sham group，ischemia-reperfusion injury（IRI）group，EPO postconditioning group，respectively.Serum blood urea nitrogen（BUN）and creatinine（Cr）were analyzed with automatic biochemical analyzer.Histopathological changes were observed with HE staining.The expression of HSP70 in kidney was checked by immunohistochemistry.Results Serum BUN and serum Cr in IRI group were significantly higher than those in Sham group，while levels of serum BUN and serum Cr in EPO postconditioning group were between the Sham group and IRIgroup.Significant necrosis of tubular epithelial cells and tubular lumen expansion in hematoxylin were found in IRIgroup.Compared with IRI group，tubular necrosis significantly reduced in EPO postconditioning group.Immunohistochemistry showed that the expression of HSP70 in EPO postconditioning group was the strongest，and significantly decreased in the Sham group，and IRIgroup was between them.Conclusions EPO postconditioning enhances the expression of HSP70 after IRI，which helps to reduce kidney injury.

kidney；postconditioning；ischemia-reperfusion injury；HSP70；rats

R 692；R 332

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.12.003

1005-8982（2016）12-0011-04

2016-01-19

史國輝，E-mail：saint40@sina.com