PARP-1表達與晚期卵巢癌組織血管生成及新輔助化療耐藥的關系研究

成　莉　李　琳　邢　輝

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PARP-1表達與晚期卵巢癌組織血管生成及新輔助化療耐藥的關系研究

成莉李琳邢輝

目的探討晚期卵巢癌組織中聚腺苦酸二憐酸核糖聚合酶(PARP-1)的表達與血管生成及新輔助化療敏感性的相關性。方法選取惡性卵巢癌患者76例、良性卵巢癌患者21例及健康對照組15例，采用RT-PCR及免疫組化法，測定三組研究對象的PARP-1及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達水平；在惡性卵巢癌患者經(jīng)過3個療程的化療后評定其化療敏感性及化療效果，并分析化療敏感性及有效性與PARP-1的表達的相關性。結果在惡性卵巢癌組織中，PARP-1及VEGF均呈高表達，且二者呈正相關關系(γ=0.3460,P=0.0022;γ=0.5469,P<0.0001)；在化療敏感及有效的患者中，PARP-1也呈高表達(P<0.05)；PARP-1的表達水平對晚期卵巢癌患者的化療敏感及有效均具有較高的靈敏度和特異度(80.95%和64.71%；94.12%和66.10%)。結論在晚期卵巢癌患者中，PARP-1呈高表達狀態(tài)，下調PARP-1的表達可以提高患者的化療敏感性，PARP-1可以作為預測患者化療敏感的生物標志物。

晚期卵巢癌；血管生成；新輔助化療

(The Practical Journal of Cancer,2016,31:1225～1229)

卵巢癌(ovarian cancer,OC)是婦科惡性腫瘤中死亡率最高的一種惡性腫瘤，其原因之一是卵巢癌發(fā)病隱匿，>70%的患者在確診時已為晚期；同時，該病具有較高的侵襲性，惡性程度高，這也是導致該病預后較差的重要原因之一[1-3]。對于惡性腫瘤的治療而言，目標之一即為促進心血管的生成，因為新生血管的形成可對腫瘤的生長速度、血行轉移產(chǎn)生重要的影響。目前已經(jīng)探明：腫瘤血管的生成與許多的細胞因子有關，如：血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血管生成素(Angiogenin)、血管營養(yǎng)素(Angiotropin)等，其中，VEGF-A被認為在血管生成中發(fā)揮著核心作用[4-7]。聚腺苦酸二憐酸核糖聚合酶(PARP)在機體內(nèi)參與細胞內(nèi)的DNA損傷修復、細胞周期、基因組穩(wěn)定等多種生物學過程。有研究結果顯示：PARP-1表達較高的大腸癌組織中，PARP-1水平與微血管密度、VEGF的表達正相關，提示：PARP-1可能具有促進腫瘤血管生成的作用[8]。研究結果顯示，PARP-1在發(fā)揮DNA修復功能的同時，對惡性腫瘤的放化療敏感性可以產(chǎn)生重要的影響，下調PARP-1表達可提高腫瘤對化療的敏感[8-9]。但是在卵巢癌中，PARP-1水平與惡性腫瘤血管生成及其放化療敏感性的研究較少，目前尚無確切結論。為了進一步探討PARP-1的表達與卵巢癌組織血管生成及新輔助化療敏感性的關系，本研究采用病例對照研究設計，觀察分析PARP-1的表達與晚期卵巢癌組織中新血管生成與新輔助化療敏感性的相關性，旨在為卵巢癌的治療提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1研究對象

選取2009年1月-2011年1月在我院接受手術治療、經(jīng)病理診斷證實為原發(fā)性晚期卵巢癌的患者76例為研究對象，患者的年齡為25～70歲，中位年齡51歲，包括漿液性腺癌52例，透明細胞癌5例，子宮內(nèi)膜樣腺癌7例，粘液性腺癌12例。選取卵巢良性腫瘤患者21例為研究對象，患者的年齡為27～71歲，中位年齡50歲，包括黏液性囊腺瘤9例、漿液性囊腺瘤12例。另取同期在我院治療的15例正常卵巢組織作為對照，該類患者為子宮肌瘤患者行附件切除者；手術后1 h內(nèi)，迅速將卵巢組織凍存于-70 ℃冰箱。

1.2納入及排除標準

1.2.1納入標準①所有卵巢組織標本均經(jīng)病理證實；②化療前經(jīng)心、肺、肝、腎功能檢查均正常，可耐受化療；③進入本研究之前未接受任何其他抗腫瘤治療；④卵巢上皮癌患者均為FIGO2000手術病理Ⅲ～Ⅳ期；⑤所有患者均接受腫瘤減滅術或分期手術，術前均未進行任何放化療、免疫治療等；⑥標本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石醋包埋；⑦對照組研究對象在年齡、性別等基本特征方面與病例組具有可比性。

1.2.2化療方案76例原發(fā)性晚期卵巢癌患者術后均接受3個療程以上以鉑類為基礎的聯(lián)合化療，方案以"鉑類+環(huán)磷酞胺"或"紫杉醇+鉑類"為主。

1.3實驗步驟

1.3.1主要實驗儀器及試劑主要實驗儀器：PCR儀器(Leica公司，德國)；冰箱-70 ℃(海爾公司，中國)；微型水平電泳槽(Bio-Rad公司，美國)；高速低溫臺式離心機(Sigma3K30，德國)；凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司，美國)；離心機(Sigma，美國)；電泳儀、電泳槽(SCIE-PLAS Biochrom，英國)；微量電子天平(北京博遠祥德科學儀器有限公司)。

主要實驗儀器：RT-PCR試劑盒、蛋白酶K、瓊脂糖、DNA Marker (500 bp)等由生工生物工程(上海)股份有限公司提供；Tris堿、三氯甲烷、異戊醇、異丙醇、乙醇等由西安化學試劑優(yōu)先公司提供。

1.3.2RT-PCR實驗購買Trizol Reagent試劑盒，從約100 mg冷凍的卵巢癌組織標本中分離總RNA；高容量cDNA反轉錄基因試劑盒將1 μg RNA合成cDNA。行實時定量PCR實驗測定PARP-1及VEGF mRNA的表達水平；并以18 S為內(nèi)參，采用2-△△Ct法[10]換算上述基因mRNA相對表達量后，進行定量分析。

引物序列如下。PARP-1引物序列：上游引物，5'-CAGCTGACCCGAGCATTCCTCGCAG-3'；下游引物：5'-GAAGGAGGGCACCGAACACCA-3'。VEGF引物序列：上游引物，5'-GCCAGCTGTAGGCCAGACCCTGGCA-3'；下游引物，5'-GACAGGGGCAAAGTGAGTGACCTGC-3'。18S引物序列：上游引物，5'-CTGTACCCTTACTCATCG-3'；下游引物：5'-CTACACATATCCTGCCATC-3'。

上述mRNA引物及其他PCR實驗相關試劑盒均由北京六合華大基因科技股份有限公司合成或提供。

1.3.3PARP-1免疫組化染色及結果判定收集卵巢癌患者的癌組織標本，用D-Hank液沖洗干凈后剪成約1 mm的組織塊，經(jīng)0.25%的胰酶充分消化收集單細胞懸液，離心后取懸液的乳白色層，Power vision二步法進行PARP-1免疫組化染色，嚴格按照說明書進行操作，陽性信號定位于細胞核或細胞質。參照文獻[10-11]的方法計算細胞核或細胞質指數(shù)LI=陽性卵巢癌細胞/1000×100%，計分標準如下：0分，LI≤10%；1分，10%

1.4療效等級評定

1.4.1化療療效等級評定[6-10]化療完畢4周后，行盆腔及腹部檢查、CA-125水平檢測及B超、CT等影像檢查，并根據(jù)WTO推薦的實體惡性腫瘤的近期化療療效評價標準判定化療療效，具體如下。完全緩解(CR)：可見腫瘤完全消失，至少持續(xù)4周；部分緩解(PR)：腫瘤體積縮小>50%，無疾病進展表現(xiàn)，至少4周；穩(wěn)定(SD)：腫瘤體積縮小<50%，增大<25%，至少4周；進展(PD)：腫瘤體積增大>25%或出現(xiàn)新病灶。76例惡性腫瘤組患者在3個療程化療結束后進行療效評定，CR+PR為化療有效，SD+PD為化療無效。

1.4.2化療敏感性評定化療敏感界定為接受化療后有效，停藥半年內(nèi)無復發(fā)；化療不敏感界定為接受化療后有效，停藥半年內(nèi)出現(xiàn)復發(fā)。

1.5統(tǒng)計分析

2　結果

2.1兩組患者基本特征比較

經(jīng)χ2檢驗，惡性卵巢腫瘤組、良性卵巢腫瘤組和對照組研究對象的性別、年齡、職業(yè)等基本特征比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，即可認為本研究的研究對象無偏性，見表1。

2.2三組PARP-1、VEGF mRNA表達水平比較

三組PARP-1、VEGF mRNA相對表達量比較結果見表2，經(jīng)單因素方差分析，三組的PARP-1、VEGF mRNA相對表達量比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；進而采用LSD法進行兩兩比較，結果顯示：PARP-1、VEGF mRNA相對表達量均在惡性卵巢腫瘤組中最高，其次為良性卵巢腫瘤組，在健康對照組患者中最低。

表2　三組PARP-1、VEGF mRNA相對表達量比較

注：經(jīng)LSD法兩兩比較，*為VS對照組，P<0.05；#為VS良性卵巢腫瘤組，P<0.05。

2.3PARP-1、VEGF mRNA表達水平的相關性分析

惡性卵巢腫瘤組PARP-1與VEGF mRNA表達水平呈相關關系(γ=0.3460,P=0.0022)，具有統(tǒng)計學意義；在惡性卵巢腫瘤組、良性卵巢腫瘤組、對照組患者中，PARP-1、VEGF mRNA表達水平也呈相關關系(γ=0.5469,P<0.0001)，見圖1。

2.4PARP-1表達與化療敏感性的關系

76例惡性腫瘤患者均完成了3個療程的化療，隨訪半年，42例(55.26%)患者為化療敏感；34例(44.74%)患者為化療不敏感?；熋舾屑安幻舾薪M的PARP-1mRNA相對表達及PARP-1免疫組化陽性表達細胞計分比較見表3，經(jīng)t檢驗，兩組患者的PARP-1表達具有統(tǒng)計學差異(t=4.317，P=0.0028)；經(jīng)秩和檢驗，PARP-1陽性卵巢癌細胞計分兩組比較也具有統(tǒng)計學差異，化療敏感組患者的PARP-1表達水平明顯低于對照組(P<0.05)。

2.5PARP-1表達量對化療敏感性的預測價值

采用ROC曲線分析PARP-1表達量對化療敏感性的預測價值，結果顯示：ROC曲線下的面積具有統(tǒng)計學意義(AUC：0.6320～0.8591,P=0.0002)；當PARP-1 mRNA相對表達量=0.5658，靈敏度和特異度均達到最高值，分別為80.95%和64.71%，見圖2。

A為惡性卵巢腫瘤組；B為惡性卵巢腫瘤組、良性卵巢腫瘤組及對照組。

圖2　PARP-1表達量預測化療敏感性的ROC曲線

2.6PARP-1表達與化療療效的關系

76例惡性腫瘤患者完成3個療程的化療4周后，根據(jù)盆腔及腹部檢查、CA-125水平檢測及B超、CT等影像檢查結果評估治療效果，共有59例(77.63%)患者化療有效，17例(22.37%)化療無效。化療有效組PARP-1 mRNA相對表達量為(0.37±0.27)，化療無效組PARP-1 mRNA相對表達量為(0.78±0.21)，經(jīng)t檢驗，化療有效組的PARP-1相對表達量明顯低于化療無效組(t=4.943,P<0.0001)，見圖3。采用ROC曲線分析PARP-1表達量對化療療效的預測價值，分析結果顯示：ROC曲線下的面積具有統(tǒng)計學意義(AUC：0.7523～0.9406,P<0.0001)；當PARP-1 mRNA相對表達量=0.4814，靈敏度和特異度均達到最高值，分別為94.12%和66.10%，圖4。

圖3　化療有效和無效組PARP-1相對表達量的比較

圖4　PARP-1表達量預測化療效果的ROC曲線

3　討論

卵巢癌是目前世界范圍內(nèi)廣大婦女受威脅最大的婦科惡性腫瘤，雖然在過去的二十年內(nèi)，卵巢癌的手術治療技術及新輔助化療方案取得了很大進展，但其5年生存率仍然較低，據(jù)報道：卵巢癌的5年生存率僅為30%左右[10-12]。隨著分子生物學的發(fā)展，人們逐漸探明：惡性腫瘤是1種多因素作用的復雜型疾病，在此過程中，個體遺傳因素發(fā)揮了重要作用。目前人們認為：卵巢癌是1種多基因疾病，特別是癌基因的激活表達、抑癌基因的失活可以促進卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展[13]。關于卵巢癌的治療，一般以手術治療和新輔助化療相結合的綜合性治療方案，其療效與多種因素有關。從病理學角度而言，卵巢癌組織新生血管的發(fā)育和生成，可促進治療效果的改善；有學者甚至認為：惡性腫瘤組織中新血管的生成可以作為治療方案有效的生物標志物之一[14]。近年來，人們已知血管的生成與眾多的細胞因子有關，其中VEGF因子在心血管生成的過程中發(fā)揮著核心作用，因此，可以講VEGF的表達作用惡性腫瘤心血管生成的生物標志物[14-17]。

表3　化療敏感與不敏感組PARP-1相對表達水平比較(例，%)

聚腺苦酸二憐酸核糖聚合酶[poly(ADP-ribose) polymerase,PARP]在機體內(nèi)的一種重要的生物酶，參與細胞內(nèi)的DNA損傷修復、細胞周期、基因組穩(wěn)定等多種生物學過程。在大腸癌等惡性腫瘤組織中，人們發(fā)現(xiàn)PARP-1與新血管的生成具有一定關系，但在晚期卵巢癌組織中上午報道。本研究以晚期卵巢癌患者為研究對象，同時選取良性惡性卵巢癌患者及健康對照者為研究對象，采用RT-PCR實驗分析檢測了3組研究對象的PARP-1 mRNA及VEGF mRNA的表達水平，結果顯示：在惡性卵巢癌組織中PARP-1及VEGF均呈高表達，同時二者呈明顯正相關關系，因此本研究認為：在晚期卵巢癌組織中，PARP-1可能促進惡性卵巢組織中新生血管的生成。至于二者在惡性卵巢癌患者中均呈高表達的原因，我們推測：惡性腫瘤細胞的存在，刺激機體產(chǎn)生某種應激反應，在這種應激反應的背景下，VEGF水平和PARP-1水平升高，以應對腫瘤組織心血管生成的生理應激[18-19]。

由于個體存在差異性，同樣的新輔助化療方案未必取得同等的治療效果，該機制至今尚不明確。以往有研究表明：PARP-1與惡性腫瘤的放化療效果有一定的關系，下調PARP-1的表達可以提高化療的敏感性，改善化療效果[20-22]。本研究分析結果顯示：PARP-1在晚期卵巢癌患者中，也有相似的表達規(guī)律，在化療敏感的個體中，PARP-1 mRNA明顯下調；同時PARP-1的相對表達量在預測晚期卵巢癌患者對鉑類為基礎的化療方案敏感性方面具有較高的靈敏度和特異度?；熋舾行耘c化療的療效直接相關，在化療有效的晚期卵巢癌患者中，PARP-1表達也是下調的，在預測化療效果方面也具有較高的預測價值。

綜上：在晚期卵巢癌患者中，PARP-1呈高表達狀態(tài)，下調PARP-1的表達可以提高患者的化療敏感性，可將PARP-1作為預測患者化療敏感的生物標志物。

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(編輯：吳小紅)

Relationship between the Expression of PARP-1 and Angiogenesis and Effect of New Adjuvant Chemotherapy in Advanced Ovarian Cancer Tissues

CHENG Li,LI Lin,XING Hui.

Xiangyang Central Hospital Affiliated to Hubei University of Arts and Science,Xiangyang,441021

ObjectiveTo explore the expression of poly gland bitter acid fluidized acid ribose polymerase-1 (PARP-1) and angiogenesis and effect of new adjuvant chemotherapy in advanced ovarian cancer tissues.Methods76 patients with malignant ovarian cancer,21 benign ovarian cancer patients and 15 healthy controls were selected into this study.PARP-1 and vascular endothelial growth factor (VEGF) expression levels were measured by RT-PCR and immunohistochemistry.The sensitivity and efficacy of chemotherapy were evaluated after 3 courses of treatment for patients with malignant ovarian cancer.ResultsIn malignant ovarian cancer,VEGF and PARP-1 were highly expressed and VEGF and PARP-1 showed a positive correlation (γ=0.3460,P=0.0022;γ=0.5469,P<0.0001);PARP-1 was also highly expressed in patients with sensitive and effective response to chemotherapy (P<0.05).The expression level of PARP-1 had high sensitivity and specificity (66.10% and 80.95%;94.12% and 64.71%) in predicting the effect of the new adjuvant chemotherapy for patients with advanced ovarian cancer.ConclusionPARP-1 is highly expressed in patients with advanced ovarian cancer,and down regulation of the expression of PARP-1 can improve the sensitivity of chemotherapy in patients with advanced ovarian cancer.

Advanced ovarian cancer;Angiogenesis;Neoadjuvant chemotherapy

湖北省衛(wèi)生廳青年科技人才基金項目(編號：2012FFB01904)

441021 湖北文理學院附屬襄陽巿中心醫(yī)院

邢輝

10.3969/j.issn.1001-5930.2016.08.003

R737.31

A

1001-5930(2016)08-1225-05

2015-09-09

2016-05-31)