狼瘡性腎炎患者腎組織中胎源性微嵌合體的表達(dá)及其臨床意義*

鄭 怡，張仕鏘，倪瑾瑤，李慧敏，馬 駿，黃朝興，陳國榮△，蔡國平，4△

狼瘡性腎炎患者腎組織中胎源性微嵌合體的表達(dá)及其臨床意義*

鄭 怡1，2，張仕鏘2，倪瑾瑤2，李慧敏2，馬 駿2，黃朝興3△，陳國榮2△，蔡國平2，4△

（1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院病理科 ，浙江 杭州310000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科 ，
3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科 ，浙江溫州325000；4.耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理科，美國康乃狄克州06520）

目的:探討胎源性微嵌合體（FMc）與狼瘡性腎炎（LN）的相關(guān)性。方法 :收集生育過男胎的24例LN和24例腎小球輕微病變（GML）的女性患者腎活檢組織 ，采用熒光原位雜交技術(shù)（FISH）檢測細(xì)胞中的Y染色體 ，并收集患者孕育史、臨床和實(shí)驗(yàn)室資料進(jìn)行分析。結(jié)果 :在9例LN和3例GML的腎組織中發(fā)現(xiàn)Y染色體陽性嵌合細(xì)胞 ，兩組發(fā)生率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但在LN組 ，嵌合細(xì)胞的出現(xiàn)與蛋白尿、血清肌酐、抗雙鏈DNA抗體、抗核抗體、補(bǔ)體C3、C4水平及SLEDAI評分等之間均無相關(guān)（P ＞0.05）。結(jié)論:FMc在女性LN患者腎組織中的發(fā)生頻率高于對照組GML患者 ，但FMc的存在很可能與LN的發(fā)病、疾病活動性和進(jìn)展性無關(guān)。

狼瘡性腎炎；微嵌合體 ；熒光原位雜交

【DOI】10.13459/j.cnki.cjap.2016.03.014

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種表現(xiàn)有多系統(tǒng)損害的慢性自身免疫性疾病，好發(fā)于育齡期女性；狼瘡性腎炎（lupus nephritis，LN）是其累及腎臟所引起的一種免疫復(fù)合物性腎炎，發(fā)病率高且難以治愈。SLE的病因及發(fā)病機(jī)制尚未明確。近年來有研究表明，微嵌合體（microchimerism，Mc）在自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中起著一定的作用，包括SLE［1］。Mc是指在個體存在少量來自不同基因個體的細(xì)胞。妊娠是Mc最主要形成機(jī)制，妊娠期胎源性細(xì)胞通過胎盤屏障進(jìn)入母體，使母體成為胎源性微嵌合體（fetal microchimerism，F(xiàn)Mc）。此外，輸血、骨髓和器官移植也可能導(dǎo)致Mc的產(chǎn)生。但對于Mc與SLE是否相關(guān)，以及Mc在SLE中的作用尚無一致結(jié)論［2］。本研究選擇有孕育史的LN女性患者腎活檢組織為研究對象，采用熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）檢測FMc的發(fā)生率，探討FMc與LN患者臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)以及其妊娠史的聯(lián)系，以期進(jìn)一步闡述LN的發(fā)病機(jī)制，為LN的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 研究對象與分組

收集溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科2010年1月至2014年4月腎穿刺活檢女性狼瘡性腎炎石蠟標(biāo)本24例（年齡20～40歲，平均33.42歲）作為研究對象，女性腎小球輕微病變（glomerularminor lesion，GML）24例作為對照（年齡20～40歲，平均36.21歲）。研究對象均生育過男胎，且無輸血史及骨髓或器官移植史（表1）。以男性腎臟組織作為陽性對照。SLE的診斷參照1997年美國風(fēng)濕病學(xué)會修訂的SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)符合4條以上［3］。SLE活動指數(shù)（SLEDAI）評分判斷SLE疾病活動性。根據(jù)2003年國際腎臟病病理協(xié)會（ISN/ RPS）有關(guān)LN病理分型標(biāo)準(zhǔn)分型［4］，診斷為LN IV型12例，LN V型2例，LN IV+V型6例，LN III型2例，LN V+III型2例。GML診斷參照1995年世界衛(wèi)生組織（WHO）第2版腎小球疾病分類［5］。

Tab.1 The basic information of LN group and control group

1.2 主要試劑

Y染色體探針（CEPY）、DAPI、NP40、預(yù)處理劑（NaHCN）、胃蛋白酶均購自Abbott公司。

1.3 熒光原位雜交方法

1.3.1 FISH步驟 常規(guī)石蠟切片2μm，烤片、脫蠟、脫水。預(yù)處理劑80℃處理30min，再用0.5mg/ml胃蛋白酶37℃消化60min；經(jīng)過75%、85%、95%和100%梯度乙醇脫水各5 min，室溫風(fēng)干；將10μl CEPY探針滴于切片上，加蓋玻片，以封片膠固定；在原位雜交儀（STATSPIN公司）中經(jīng)75℃變性5 min，37℃雜交16 h；雜交后先后于室溫、72℃的0.3%NP 40中洗脫；風(fēng)干后加10μl DAPI，與細(xì)胞核做對比染色。綠色熒光信號標(biāo)記Y染色體，DAPI染細(xì)胞核為藍(lán)色。在熒光顯微鏡（Olympus，BX51）下 ，選擇適宜的濾光片通道觀察不同顏色的信號。FMc為藍(lán)色細(xì)胞核中，存在綠色信號。男性腎臟組織用不加Y染色體探針的緩沖液代替CEPY作為陰性對照。用CCD采集圖像，并以Photoshop軟件進(jìn)行彩色合成。

1.3.2 結(jié)果判定 所有標(biāo)本均由兩名不知道臨床資料的觀察員獨(dú)立評分，切片＞90%細(xì)胞核的含有熒光信號，邊緣完整的核內(nèi)有表示Y染色體的綠色信號，且綠色信號和男性腎臟陽性對照片上的綠色信號強(qiáng)度相等為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。分類變量用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行比較 ，連續(xù)變量用 t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，非正態(tài)分布的連續(xù)變量采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 Y染色體陽性細(xì)胞在LN中的陽性率

24例女性LN中有9例存在Y染色體陽性細(xì)胞，陽性率37.5%，作為對照的24例GML中有3例存在Y染色體陽性細(xì)胞，陽性率為12.5%，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表2）。

Tab.2 The number and location ofmicrochimerism in the renal biopsy tissue of LN group and controlgroup

2.2 Y染色體陽性細(xì)胞在腎活檢組織中的位置及周圍病理改變

2.2.1 Y染色體陽性細(xì)胞在LN腎活檢組織中的位置 在LN中，Y染色體陽性細(xì)胞的數(shù)量為1～6個。6例Y染色體陽性細(xì)胞為腎小管上皮細(xì)胞（圖1B），Y染色體陽性細(xì)胞數(shù)量為1～6個，1例Y染色體陽性細(xì)胞所在的腎小管上皮存在顆粒樣變性，另1例所在的腎小管上皮存在顆粒樣變性伴周圍腎小管管腔內(nèi)蛋白管型，其余Y染色體陽性細(xì)胞周圍均未見明顯病變；有2例Y染色體陽性細(xì)胞為浸潤腎間質(zhì)的單個核細(xì)胞（圖2A），Y染色體陽性細(xì)胞數(shù)量為1～2個，1例Y染色體陽性細(xì)胞存在于浸潤腎間質(zhì)的單個核細(xì)胞伴小灶狀單個核細(xì)胞浸潤中；1例Y染色體陽性細(xì)胞存在于中腎小球中（圖2B），Y染色體陽性細(xì)胞數(shù)量為1個，所在腎小球呈球性毛細(xì)血管內(nèi)細(xì)胞中重度增生伴毛細(xì)血管腔狹窄。圖3為男性陽性對照（圖1-3，見彩圖頁Ⅳ）。

2.2.2 Y染色體陽性細(xì)胞在對照組腎活檢組織中的位置在對照組，3例存在Y染色體陽性細(xì)胞，陽性細(xì)胞的數(shù)量均為1個，均為腎小管上皮，所在腎小管上皮細(xì)胞均未見明顯病變。

2.3 Y染色體陽性細(xì)胞與LN患者臨床及實(shí)驗(yàn)室參數(shù)的聯(lián)系

在LN患者中，存在Y染色體陽性細(xì)胞的女性和不存在Y染色體陽性細(xì)胞女性患者的確診疾病年齡、腎活檢年齡、蛋白尿、血清肌酐、C3、C4、抗核抗體以及抗雙鏈DNA抗體等參數(shù)之間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；LN病理分型以及狼瘡活動度SLEDAI評分之間的差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3）。

2.4 Y染色體陽性細(xì)胞與LN患者孕育史的關(guān)系

LN中存在Y染色體陽性細(xì)胞的女性懷孕次數(shù)1～4次（平均1.67次），均只有一個兒子，年齡1～14歲，平均9.33歲；無Y染色體陽性細(xì)胞的女性懷孕1～2次（平均1.47次），兒子1～2個，年齡1～19歲，平均8.07歲。懷孕次數(shù)、懷男孩次數(shù)、流產(chǎn)次數(shù)和大兒年齡在兩組之間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表4）。

Tab.3 Clinical data and results ofwomen with lupus nephritis

Tab.4 Reproductive data and results ofwomenwith lupus nephritis atbiopsy

3 討論

目前認(rèn)為狼瘡性腎炎的發(fā)病機(jī)制可能與遺傳因素及免疫調(diào)節(jié)功能的異常有關(guān)［6］，但這些不足以解釋其發(fā)病原因。近年來 ，移植受體內(nèi)微嵌合狀態(tài)的形成，被認(rèn)為可能是誘導(dǎo)移植免疫耐受的機(jī)制之一［7］。慢性移植物抗宿主病（cGVHD）可以產(chǎn)生微嵌合體現(xiàn)象，其臨床和病理特征與某些自身免疫性疾病非常相似，且在系統(tǒng)性硬化癥、橋本氏甲狀腺炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等［8］自身免疫性疾病中也已證實(shí)存在FMc?；谶@些發(fā)現(xiàn)與相關(guān)研究，一些學(xué)者認(rèn)為微嵌合體可能是某些自身免疫性疾病的重要病因。

本研究以有孕育男胎的女性LN（包括LN-Ⅲ型、Ⅳ型和Ⅴ型，平均SLEDAI評分中度）患者為對象，所有對象均已排除輸血史和骨髓或器官的移植史，故可認(rèn)為檢出的Y染色體陽性細(xì)胞是胎源性嵌合細(xì)胞（FMc）。本研究顯示LN女性患者腎臟活檢組織中Y染色體陽性細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)率明顯高于對照組，與Hovinga等［9］的研究結(jié)果一致。我們在腎小球、腎小管及間質(zhì)均檢出嵌合細(xì)胞 ，但數(shù)量較少。Hovinga等［8］認(rèn)為嵌合細(xì)胞的表型比數(shù)量的多少更有意義。他們的研究發(fā)現(xiàn)CD3+嵌合細(xì)胞和CD34+嵌合細(xì)胞，表明在腎臟中的嵌合細(xì)胞有一部分可能為CD3+T細(xì)胞，并認(rèn)為CD3+嵌合T細(xì)胞可能是SLE的效應(yīng)細(xì)胞。而CD34+嵌合細(xì)胞為無害的旁觀者，因?yàn)樘ピ葱訡D34+嵌合細(xì)胞可以在健康女性中存在長達(dá)20多年［10］。但是，目前還沒有證據(jù)表明CD3+嵌合細(xì)胞的致病性。

據(jù)我們觀察，F(xiàn)Mc與LN病理類型及鄰近組織病變之間多缺乏明確的聯(lián)系，F(xiàn)Mc與患者的尿蛋白、血清肌酐、抗核抗體、抗ds-DNA抗體、補(bǔ)體C3、C4水平及SLEDAI活動指數(shù)無關(guān)聯(lián)，這似乎提示FMc可能不參與LN的疾病發(fā)生發(fā)展。Johnson等［11］發(fā)現(xiàn)一例生過男胎的SLE女性患者的甲狀腺、脾、腎、心、肺、小腸和大腸組織中均存在FMc，并認(rèn)為FMc可能與SLE的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。但該例病人SLE表現(xiàn)不典型，且肌肉和關(guān)節(jié)滑膜是該患者的主要靶器官，卻沒有研究，使得FMc與患者SLE引起的器官病理改變難以做出關(guān)聯(lián)性的結(jié)論。另一項(xiàng)研究［12］發(fā)現(xiàn)在女性SLE患者心、肺、腎、肝、脾、皮膚、甲狀腺、淋巴結(jié)組織中均存在Y染色體陽性嵌合體細(xì)胞。但是與SLE患者正常的器官相比，SLE相關(guān)損傷和非SLE相關(guān)損傷組織中的嵌合細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)率一樣高。因此，該作者認(rèn)為很有可能嵌合細(xì)胞祖細(xì)胞發(fā)育成實(shí)質(zhì)細(xì)胞和組織損傷后更換受損的宿主細(xì)胞。但仍沒有確切的實(shí)驗(yàn)證明嵌合細(xì)胞的作用。

根據(jù)現(xiàn)有的研究結(jié)果，Mc在SLE中的作用尚未明確，關(guān)于Mc在SLE中的作用有3個假設(shè)［13］。第一個假設(shè)，嵌合細(xì)胞是T細(xì)胞，誘導(dǎo)移植物抗宿主（GVH）反應(yīng)。因?yàn)樽陨砻庖咝约膊∨cGVH?。℅VHD）有著諸多相似性，且現(xiàn)有證據(jù)表明一部分嵌合細(xì)胞為T細(xì)胞。但是尚未有研究證明在SLE中的嵌合性T細(xì)胞是否具有免疫活性。第二個假設(shè)，嵌合細(xì)胞是宿主抗移植物（HVG）反應(yīng)的靶細(xì)胞。嵌合體細(xì)胞的抗原誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，導(dǎo)致自身免疫性樣反應(yīng)。因?yàn)镕Mc包含繼承于父親的抗原，可被視為外來細(xì)胞，在母體組織中可能引起類似于器官移植后急性排異反應(yīng)的母體HVG反應(yīng)。第三個假設(shè)，嵌合細(xì)胞不直接參與自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制 ，組織損傷后嵌合祖細(xì)胞進(jìn)入實(shí)質(zhì)細(xì)胞替換受損的宿主細(xì)胞，進(jìn)而修復(fù)受損組織。

本研究顯示，F(xiàn)Mc可存在于女性LN患者腎組織的小管上皮細(xì)胞、腎間質(zhì)和腎小球中，雖然FMc與鄰近組織病變之間多缺乏明確的聯(lián)系，但尚未明確是何種類型細(xì)胞，不能完全排除第一種假設(shè)。其次，LN為主要累及腎小球的由免疫復(fù)合物介導(dǎo)的疾病，對于HVG反應(yīng)的發(fā)生，嵌合細(xì)胞必須是存在于病變組織。但是本研究顯示FMc主要存在于腎小管和腎間質(zhì)，僅個別在腎小球節(jié)段性分布，嵌合細(xì)胞的存在缺乏與LN病理類型的聯(lián)系，也不能解釋LN（特別是彌漫性LN）的免疫病理表現(xiàn)，故不太支持第二種假設(shè)。第三，本研究顯示患者腎組織中FMc的存在與LN臨床表現(xiàn)（尿蛋白定量，血清肌酐水平）及狼瘡活動指標(biāo)（抗核抗體、抗雙鏈DNA抗體和補(bǔ)體水平，SLEDAI活動指數(shù)）均無關(guān)聯(lián)，提示FMc很可能沒有參與LN疾病的發(fā)生發(fā)展。FMc更大可能是來自血循環(huán)，可能由于LN疾病導(dǎo)致腎小球基底膜損傷，濾過膜通透性增加，加之小管胞飲作用，從而使血液中的FMc遷移到病變組織。

此外，我們的研究表明，LN女性患者腎組織檢出Y染色體陽性細(xì)胞與懷孕次數(shù)、懷男胎次數(shù)、流產(chǎn)次數(shù)及大兒年齡之間不存在明確關(guān)系。這與Hovinga等［14］的研究結(jié)果一致，可能不是每次懷孕都可能導(dǎo)致FMc的持續(xù)存在，即使FMc都持續(xù)存在，每次懷孕產(chǎn)生的FMc在數(shù)量上可能會不同。Ariga等［15］的研究表明在分娩時所有的母親都存在胎兒來源的細(xì)胞，但在分娩后1個月，只有10%女性的血液中有FMc。這一結(jié)果表明，可能只有特定的FMc可以存在更長的時間。

因正常女性腎組織難以獲取，本實(shí)驗(yàn)未設(shè)正常女性對照組。本實(shí)驗(yàn)研究總體數(shù)量較少，這可能影響研究結(jié)果。

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lupus nephritis； microchimerism； fluorescence in-situ hybridization

R692.3

A

1000-6834（2016）03-241-04

浙江省科技廳國際合作項(xiàng)目（2013C24031）；溫州高層次人才創(chuàng)新重點(diǎn)資助（604090352/173）

2015-05-12

2016-01-31

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