耐力訓(xùn)練對ApoE-/-致AS小鼠IL-18和IL-10表達(dá)的影響*

王 敏，劉善云，張洪俠，王亞慧，劉 凱

耐力訓(xùn)練對ApoE-/-致AS小鼠IL-18和IL-10表達(dá)的影響*

王 敏1，2，劉善云1△，張洪俠3，王亞慧1，劉 凱1

（1.天津體育學(xué)院健康與運(yùn)動科學(xué)系 ，天津300381；2.江蘇省漣水中學(xué) ，淮安223400；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)臨床實(shí)訓(xùn)教學(xué)部 ，天津300193）

目的:深入觀察耐力訓(xùn)練對載脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）致動脈粥樣硬化（AS）小鼠白介素18（IL-18）和白介素10（IL-10）的影響 ，探討運(yùn)動防治AS的可能機(jī)制。方法:選取8周齡雄性ApoE-/-小鼠20只:隨機(jī)分為2組（n=10）:AS模型組（AC組）和運(yùn)動干預(yù)組（AE組），AE組進(jìn)行跑臺耐力訓(xùn)練；選取8周齡C57BL/6J雄性小鼠10只作為正常對照組（CC組）。實(shí)驗(yàn)持續(xù)12周，取主動脈制作冰凍切片，分別用于觀察主動脈AS斑塊和病理變化以及主動脈IL-18、IL-10蛋白表達(dá)；采用ELISA法檢測血清IL-18、IL-10水平。結(jié)果:①12周高脂膳食致ApoE-/-小鼠發(fā)生典型的AS病變，耐力訓(xùn)練使AS斑塊面積顯著減少（P＜0.01），病變程度顯著減輕。②與CC組比較，AC組、AE組小鼠血清IL-18和IL-10水平均顯著升高（P＜0.01），且AC組IL-18/IL-10比值顯著升高（P＜0.01）。AE組血清IL-18水平及IL-18/IL-10比值均顯著低于AC組（P＜0.01）。③與CC組比較，AC組、AE組小鼠主動脈IL-10和IL-18蛋白表達(dá)均顯著升高（P＜0.01），AE組IL-10表達(dá)顯著高于AC組（P＜0.05），IL-18表達(dá)顯著低于AC組（P＜0.05）。結(jié)論:耐力訓(xùn)練通過降低血液和主動脈IL-18及提高IL-10水平，增強(qiáng)了主動脈血管抗炎能力，從而發(fā)揮抗AS的作用。

耐力訓(xùn)練；動脈粥樣硬化 （AS）；白介素18（IL-18）；白介素10（IL-10）；載脂蛋白 E基因敲除（ApoE-/-）；小鼠

【DOI】10.13459/j.cnki.cjap.2016.03.009

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）已被證實(shí)是與血管內(nèi)皮功能密切相關(guān)的慢性炎癥性疾病，如何控制機(jī)體炎癥已成為AS防治的新靶點(diǎn)［1，2］。作為完整的有機(jī)體，體內(nèi)存在完善的免疫炎癥平衡系統(tǒng)，促炎因子與抗炎因子的失衡可能是AS重要的致病因素。白介素18（interleukin-18，IL-18）是新近發(fā)現(xiàn)的一種促炎癥因子，已被證實(shí)參與AS病變?nèi)^程，而IL-10作為抗炎癥因子通過抑制促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生而發(fā)揮抗AS作用。IL-18/IL-10比值能較客觀地反映機(jī)體炎癥/抗炎癥系統(tǒng)的動態(tài)平衡狀態(tài)［3，4］。

近年研究顯示，運(yùn)動具有抗炎癥效果，長期運(yùn)動引起骨骼肌的抗炎癥作用對防治慢性炎癥性疾病產(chǎn)生有益的影響［5，6］，但運(yùn)動能否通過增強(qiáng)機(jī)體抗炎能力而發(fā)揮抗AS的作用還缺乏深入研究。本研究在復(fù)制實(shí)驗(yàn)動物AS模型的基礎(chǔ)上，深入觀察長期耐力訓(xùn)練對實(shí)驗(yàn)動物血液和主動脈IL-18、IL-10的影響，以期從運(yùn)動的抗炎角度闡明運(yùn)動防治AS的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

選取8周齡雄性ApoE基因敲除（apolipoprotein Egene knockout，ApoE-/-）小鼠20只（購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物中心），隨機(jī)分為AS模型組（AC組）和運(yùn)動干預(yù)組（AE組）（n=10），飼喂高脂高膽固醇飼料（膽固醇為0.15%，脂肪為21%）。另選取10只同品系8周齡C57BL/6J雄性小鼠作為正常對照組（CC組），飼喂標(biāo)準(zhǔn)動物飼料。將各組小鼠分籠飼養(yǎng)，每籠3～5只，自由進(jìn)食進(jìn)水（飲用潔凈水）。每天進(jìn)行紫外線消毒20min，室溫（22～24）℃，相對濕度40%～60%，自然光照。

1.2 運(yùn)動方案

令A(yù)E組小鼠在跑臺上進(jìn)行耐力訓(xùn)練（ZH-PT動物跑臺，安徽正華儀器設(shè)備有限公司）。運(yùn)動負(fù)荷為:由跑臺速度10m/min、運(yùn)動時間30min/count（第1～2周），逐漸增加至13m/min、1 h/count（第3～12周）。每周訓(xùn)練5次，每天上午訓(xùn)練1次，共持續(xù)12周。

1.3 取材及組織處理

實(shí)驗(yàn)周期結(jié)束后將動物處死并取材，AE組停止運(yùn)動24 h，分別取血和主動脈等組織。采取腹腔注射10%水合氯醛，摘眼球取血，從眼眶靜脈叢采血約1.5～2 ml，離心分離血清，置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

主動脈標(biāo)本制作和切片制備:動物取血后，立即將小鼠固定于手術(shù)臺，打開腹腔和胸腔，取出全心臟及主動脈根部（靠近主動脈瓣尖部約0.5 cm），剝離血管外附著組織后進(jìn)行固定和包埋，液氮速凍后放置-80℃冰箱保存，以備制作冰凍切片。切片制作過程［7］:從心底部開始作橫斷面連續(xù)切片（從主動脈瓣尖出現(xiàn)起作連續(xù)橫切），切片厚度7μm，在顯微鏡下觀察并選取切片，每間隔10張選取1張，分別用于主動脈斑塊面積評估和病理分析以及炎癥因子表達(dá)測定等。

1.4 檢測指標(biāo)與方法

1.4.1 血清IL-18和IL-10水平測定 采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫法（ELISA法）測定血清IL-18和IL-10水平（美國R&D分裝）。

1.4.2 主動脈斑塊面積評估及病理形態(tài)學(xué)分析

取各組主動脈根部油紅O（ORO）染色切片5張，采用計算機(jī)全自動圖像分析系統(tǒng)Leica Qwin V3對主動脈斑塊面積進(jìn)行評估。以斑塊面積占血管腔總面積的比值表示斑塊大小。取各組主動脈切片，采用蘇木素-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)特征及不同階段的AS病變。

1.4.3 主動脈IL-18和IL-10蛋白表達(dá)測定 取各組主動脈切片，采用免疫組化法測定主動脈IL-18 和IL-10蛋白表達(dá)。陽性細(xì)胞染成棕黃色，細(xì)胞核為藍(lán)色。每張切片在高倍鏡下隨機(jī)選取4個視野，利用IPP 6.0軟件測量染色部位陽性表達(dá)率，用每組切片平均光密度（MOD）值表示陽性細(xì)胞表達(dá)量［8］。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 耐力訓(xùn)練對ApoE-/-小鼠AS形成的干預(yù)效果

實(shí)驗(yàn)動物主動脈ORO染色切片顯示，CC組小鼠主動脈無任何AS斑塊。而20周齡ApoE-/-小鼠主動脈內(nèi)膜上可見大量被染成紅色的脂質(zhì)斑塊，斑塊面積占血管腔總面積的（40.39±10.13）%。AE組小鼠主動脈斑塊面積（21.37±1.70）%顯著低于AC組（表1）。主動脈HE染色切片顯示，CC組小鼠主動脈壁內(nèi)膜光滑，未發(fā)生任何AS病變。AC組小鼠主動脈內(nèi)膜明顯增厚，可見許多脂紋-纖維斑塊期病變以及少量由膽固醇結(jié)晶（針狀空隙）和泡沫細(xì)胞構(gòu)成的粥樣斑塊。與AC組比較，AE組主動脈病變程度顯著減輕，多為脂紋期和纖維斑塊期病變（圖1，見彩圖頁Ⅲ）。

2.2 各組小鼠血清IL-18和IL-10水平的變化

與CC組比較，AC組和AE組小鼠血清IL-18、IL-10水平均顯著升高（P＜0.01）。與AC組比較，AE組IL-18水平顯著降低（P＜0.01），IL-10水平呈升高趨勢，但無顯著性差異。與CC組相比，AC組小鼠血清IL-18/IL-10比值顯著升高（P＜0.01），AE組與CC組無顯著性差異；與AC組比較，AE組IL-18/IL-10比值顯著降低（P＜0.01，表2）。

Tab.1 Effects of endurance training on aortic plaque area in ApoE-/-mice（±s，n =10）

Tab.1 Effects of endurance training on aortic plaque area in ApoE-/-mice（±s，n =10）

AC:Atherosclerosismodel group；AE:Atherosclerosis exercise group**P＜0.01 vs AC group

?

Tab.2 Effects of endurance training on the serum levels of IL-18 and IL-10 in ApoE-/-mice（±s，n =10）

Tab.2 Effects of endurance training on the serum levels of IL-18 and IL-10 in ApoE-/-mice（±s，n =10）

AC:Atherosclerosismodel group；AE:Atherosclerosis exercise group；CC:Atherosclerosis control group；IL:Interleukin**P＜0.01 vs CC group；##P＜0.01 vs AC group

?

2.3 各組小鼠主動脈IL-18和IL-10蛋白表達(dá)的變化

CC組小鼠主動脈壁只有少量IL-18和IL-10蛋白表達(dá)量；AC組和AE組主動脈IL-18、IL-10蛋白表達(dá)量均顯著高于CC組（P＜0.01）。與AC組比較，AE組IL-18表達(dá)顯著降低，IL-10表達(dá)顯著升高（P ＜0.05，表3）。

Tab.3 Effects of endurance training on the protein expressionsof IL-18 and IL-10 in ApoE-/-mice（±s，n =10）

Tab.3 Effects of endurance training on the protein expressionsof IL-18 and IL-10 in ApoE-/-mice（±s，n =10）

AC:Atherosclerosismodel group；AE:Atherosclerosis exercise group；CC:Atherosclerosis control group；IL:Interleukin**P＜0.01 vs CC group；#P＜0.05 vs AC group

Group　IL-18　IL-10 CC　0.21±0.01　0.18±0.04 AC　0.46±0.07**　0.39±0.09**AE　0.37±0.06**#　0.48±0.11**#

3 討論

采用基因敲除技術(shù)培育成功的ApoE-/-小鼠是目前AS研究中較理想的實(shí)驗(yàn)動物模型。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，8周齡ApoE-/-小鼠經(jīng)12周高脂高膽固醇飼料飼養(yǎng)后，AS模型組主動脈內(nèi)膜可見大量的AS斑塊及不同時期的AS病變，表明本實(shí)驗(yàn)中已成功復(fù)制實(shí)驗(yàn)動物AS模型。與模型組相比，運(yùn)動干預(yù)組主動脈斑塊面積顯著縮小，AS病變程度顯著減輕，表明12周耐力訓(xùn)練能夠有效地抑制或延緩ApoE-/-小鼠AS病變的形成。

許多研究已表明，炎癥貫穿AS發(fā)生發(fā)展的全過程，炎癥在介導(dǎo)AS發(fā)病機(jī)理中扮演重要的角色［1，2］。IL-18是新近發(fā)現(xiàn)的一種促炎癥因子，已被證實(shí)參與AS病變?nèi)^程［9］，血清IL-18水平升高可使動脈粥樣斑塊的不穩(wěn)定性增加［10］。而IL-10作為抗炎癥因子，可通過抑制多種促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生、下調(diào)細(xì)胞黏附分子表達(dá)和抑制免疫反應(yīng)等，從而發(fā)揮抗AS的作用。IL-18/IL-10比值能較客觀地反應(yīng)機(jī)體炎癥/抗炎癥系統(tǒng)的動態(tài)平衡狀態(tài)，其比值增大表明了炎癥/抗炎癥失衡以及炎癥反應(yīng)的增強(qiáng)，二者平衡失調(diào)可能是促使AS病變進(jìn)展的重要原因［11］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ApoE-/-小鼠體內(nèi)存在較高的炎癥水平以及促炎癥細(xì)胞因子/抗炎癥細(xì)胞因子平衡系統(tǒng)的失調(diào)。但與AS模型組比較，運(yùn)動干預(yù)組IL-18水平和IL-18/IL-10比值均顯著降低，表明12周耐力訓(xùn)練可能通過降低血清炎癥因子水平、糾正機(jī)體促炎癥因子/抗炎癥因子平衡系統(tǒng)失調(diào)，進(jìn)而阻礙AS病變的進(jìn)程。

血管內(nèi)皮是各種炎癥因子攻擊的主要靶器官。已有研究表明，IL-18參與AS斑塊形成的過程，在不穩(wěn)定斑塊中IL-18的表達(dá)明顯高于穩(wěn)定斑塊。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，發(fā)生AS的ApoE-/-小鼠主動脈有大量的炎癥因子IL-18表達(dá)，表明IL-18與AS病變形成有密切關(guān)系，而12周耐力訓(xùn)練可顯著減少主動脈IL-18表達(dá)，并使抗炎癥因子IL-10的表達(dá)增加。近年研究認(rèn)為，有氧運(yùn)動具有調(diào)節(jié)血脂以外的抗AS途徑，長期規(guī)律的有氧運(yùn)動具有顯著的抗炎癥效應(yīng)，因此在防治慢性炎癥性疾病中發(fā)揮有益的作用［12，13］。本研究表明 ，長期規(guī)律的耐力訓(xùn)練可能通過減少血管局部炎癥因子表達(dá)，減輕血管內(nèi)膜的炎癥反應(yīng)，并增強(qiáng)血管內(nèi)皮的抗炎癥能力，進(jìn)而對ApoE-/-小鼠AS形成起到良好的干預(yù)效果。

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The effects of endurance training on IL-18 and IL-10 in atherogenic ApoE-/-mice

WANGMin1，2，LIU Shan-yun1△，ZHANG Hongia3，WANG Ya-hui1，LIU Kai1
（1.Sport Department of Health and Exercise Science，Tianjin University of Sport，Tianjin 300381；2.Lian ShuiMiddle School，HuaiAn 223400；3.Teaching Departmentof Clinic，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

【ABSTRACT】Objective:To investigate theeffectsof endurance training on interleukin-18（IL-18）and IL-10 in atherogeniceapolipoprotein E gene knockout（ApoE-/-）mice and explore its possiblemechanism preventing atherosclerosis occurrence.Methods:Twentymale ApoE-/-mice （age:8 weeks）were randomly divided into atherosclerosis（AS）model group（AC）and exercise group（AE）and chosemale C57BL/6Jmice （age:8 weeks）as controlgroup（CC）.After12 weeks，the aortic trunk closed heartwas prepared for frozen section，whichwere used to observe the changesof plaque area and pathology.The expressionsof IL-18 and IL-10 proteins and the levelsofblood IL-18 and IL-10weremeasured by ELISA.Results:①Twelveweeks high fatdietsignificantly resulted in typical AS lesion，however，endurance trainingmarkedly decreased ASplaque area and pathology in ApoE-/-mice（P＜0.01）.②Compared with CC group，serum IL-18 and IL-10 levelswere significantly increased in AC group and AE group and IL-18/IL-10 ratiowas also increasedmarkedly in AE group（P＜0.01）.Serum IL-18 level and IL-18/IL-10 ratio in AE groupwere all significantly lower than those in AC group（P＜0.01）.③Comparedwith CC group，the expressions of IL-10 and IL-18 proteins in aortawere significantly increased in ACgroup and AEgroup（P＜0.01）.Theexpression of IL-10 protein in aorta in AE groupwasmarkedly higher than that in AC group but IL-18 protein expressionwas significantly lower.Conclusion:Endurance training can prevent ASappeared through enhancing aortic anti-inflammatory capability by decreasing serum and aortic IL-18 levelsand by increasing serum and aortic IL-10 level.

endurance training； atherosclerosis； interleukin-18； interleukin-10； apolipoprotein E gene knockoutmice

G804.3

A

1000-6834（2016）03-225-04

天津市科技計劃項目（08JCYBJC06000）；天津體育學(xué)院博士科研基金項目

2015-03-30

2015-10-19

Tel:022-23012352；E-mail:liu shanyun@163.com