基于蛋白組學(xué)技術(shù)篩選急性主動(dòng)脈夾層診斷標(biāo)記物

王河清 張喆 唐謙 鄭楠 楊波 萬(wàn)峰

基礎(chǔ)研究

基于蛋白組學(xué)技術(shù)篩選急性主動(dòng)脈夾層診斷標(biāo)記物

王河清 張喆 唐謙 鄭楠 楊波 萬(wàn)峰

目的 應(yīng)用非標(biāo)記定量蛋白組學(xué)比較急性主動(dòng)脈夾層（AAD）與急性心肌梗死（AMI）和健康人血清中的差異蛋白，篩選并驗(yàn)證潛在的夾層早期診斷標(biāo)志物。方法 前期預(yù)實(shí)驗(yàn)收集急性主動(dòng)脈夾層患者與健康人血清各3份，進(jìn)行非標(biāo)記蛋白組學(xué)檢測(cè)，篩選出差異蛋白。之后收集急性主動(dòng)脈夾層、急性冠脈綜合征患者和健康人血清各9份，對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行Elisa驗(yàn)證，同時(shí)收集夾層與正常動(dòng)脈組織進(jìn)行免疫組化驗(yàn)證。結(jié)果 譜圖計(jì)數(shù)（spectral counts）共鑒定出648種蛋白，其中夾層組較健康人組升高4倍的蛋白有12種。對(duì)其中升高明顯的紐蛋白（vinculin）進(jìn)行 Elisa驗(yàn)證，夾層組［n=9，（1366.95±394.85）pg/ml］與心梗組［n=9，（2656.91±531.98）pg/ml］、健康人組［n=9，（3949.37±314.61）pg/ml］（P＜0.05）相比并沒(méi)有升高；免疫組化發(fā)現(xiàn)主動(dòng)脈發(fā)生撕裂部位的紐蛋白（vinculin）分布較未發(fā)生撕裂部位密集。結(jié)論 非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是尋找AAD循環(huán)標(biāo)志物的一種有效手段。紐蛋白可能參與AAD的發(fā)病過(guò)程，是一種具有研究?jī)r(jià)值的AAD潛在循環(huán)標(biāo)志物。

急性主動(dòng)脈夾層； 非標(biāo)記定量蛋白組學(xué)； 紐蛋白

急性主動(dòng)脈夾層（AAD）發(fā)病急驟，臨床表現(xiàn)各異，常與其他胸部疾病混淆（急性冠脈綜合征、肺栓塞等），其傳統(tǒng)診斷依賴于影像學(xué)檢查（CT、MRI和超聲）[1，2]。與急性主動(dòng)脈夾層有關(guān)的特異循環(huán)生物標(biāo)志物如C反應(yīng)蛋白（C-reaction protein，CRP）、鈣調(diào)蛋白（Calponin）、可溶性彈性蛋白碎片（Solubleelastinfragments，sELAF）、D- 二 聚 體（D-Dimer）等[3]，在急性主動(dòng)脈夾層發(fā)病早期的確有所升高，但都缺乏足夠的敏感度、特異度或較長(zhǎng)的檢查時(shí)間窗，因此沒(méi)能應(yīng)用于臨床。非標(biāo)記蛋白組學(xué)方法（label-free proteomics）是利用在液相色-譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）系統(tǒng)中，酶解肽段（peptides）豐度與肽段信號(hào)峰面積或MS/MS質(zhì)譜指數(shù)的相關(guān)性來(lái)定量的一種方法[4]。此方法不需要同位素試劑和專業(yè)的分析軟件，其準(zhǔn)確性比基于膠的定量方法更高，且它定量的動(dòng)態(tài)范圍高于同位素標(biāo)記法[5]。當(dāng)急性主動(dòng)脈夾層發(fā)生時(shí)，主動(dòng)脈壁損傷特別是動(dòng)脈中膜的撕裂，會(huì)使大量管壁成分釋放入血。因此，本試驗(yàn)通過(guò)差異蛋白組學(xué)的方法，比較夾層患者與心?；颊吆徒】等说难宄煞植町?，從而尋找高敏感度、高特異度和較長(zhǎng)時(shí)間窗的夾層標(biāo)志物。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究前期蛋白組學(xué)預(yù)試驗(yàn)入組的3例急性主動(dòng)脈夾層病例，均來(lái)自項(xiàng)目合作單位美國(guó)密歇根大學(xué)心臟中心2014年住院患者。9例AAD病例和9例急性心肌梗死（AMI）病例均為北京大學(xué)第三醫(yī)院心臟外科2014年住院患者。患者的診斷都符合國(guó)際診斷標(biāo)準(zhǔn)。健康對(duì)照組均來(lái)自各自醫(yī)院的體檢中心。標(biāo)本采集經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)和患者本人或家屬知情同意。

1.2 血清樣本的采集 使用血清分離膠促凝采血管（SST）收集患者靜脈血10 ml。室溫下靜置20 min，4℃，3000 rpm，離心10 min。取上清分裝后于-80℃保存。

1.3 動(dòng)脈組織的采集 收集于我院行血管置換術(shù)所得的撕裂夾層動(dòng)脈組織，4%多聚甲醛4℃固定24 h，脫水、透明、石蠟包埋標(biāo)本，連續(xù)切片 5 μm厚，粘于玻片上備用。

1.4 蛋白組學(xué)獲取差異血清蛋白 利用Pierce H-12親和柱去除12種人血清高峰度蛋白質(zhì)。取20 μg處理后的樣本，室溫下用50 mmol/L的碘乙酰胺進(jìn)行烷基化1 h，37℃下胰蛋白酶酶解4 h，加入50%乙氰和2%甲酸，真空離心，取上樣進(jìn)行LC-MS/MS分析。通過(guò)超高效液相色譜系統(tǒng)（NanoAcquity HPLC）—線性離子阱/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀（LTQ-Orbitrap Velos）進(jìn)行質(zhì)譜分析。色譜柱（C18，50.0 mm×2.1 mm，1.7 μm） 于 75 μm 分析柱中，以流速為350 nl/min進(jìn)行洗脫。流動(dòng)相A為含0.1%甲酸的水溶液，流動(dòng)相B為含0.1%甲酸的乙氰進(jìn)行梯度洗脫。通過(guò)靜電場(chǎng)軌道阱正離子全掃描模式完成一級(jí)質(zhì)譜（MS）掃描，根據(jù)一級(jí)質(zhì)譜的結(jié)果選擇15個(gè)峰度最高的肽段，即母離子，通過(guò)線性離子阱數(shù)據(jù)以掃描模式完成二級(jí)質(zhì)譜（MS/MS）掃描。運(yùn)用數(shù)據(jù)庫(kù)搜索軟件Mascot（Matrix Science Ltd）檢索Swissport Human數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)生物質(zhì)譜進(jìn)行鑒定分析，并通過(guò) Scaffold算法對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。每個(gè)樣本進(jìn)行3次質(zhì)譜技術(shù)重復(fù)用于評(píng)價(jià)整個(gè)分析過(guò)程的質(zhì)譜穩(wěn)定性和重復(fù)性。

1.5 驗(yàn)證紐蛋白濃度 按照紐蛋白Elisa試劑盒（Uscn Life Science Inc.，美國(guó)）說(shuō)明書完成對(duì)血清紐蛋白濃度的測(cè)定。

1.6 免疫組化驗(yàn)證紐蛋白分布 切片常規(guī)脫蠟水化，高溫修復(fù)抗原5 min，用3%H2O2阻滯內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性10 min。加入1∶50稀釋的兔抗人vinculin單克隆抗體（Cell Signaling，CST公司，美國(guó)），室溫下孵育1 h，再加入通用型二抗PV6000工作液（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），室溫下孵育30 min。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，0.1%鹽酸酒精分化，自來(lái)水沖洗返藍(lán)。常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片、觀察。以PBS液取代一抗做空白對(duì)照。上述染色步驟均在室溫下進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用±s表示，應(yīng)用t檢驗(yàn)、卡方檢驗(yàn)、單因素方差分析判斷組間差異。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蛋白組學(xué)結(jié)果 夾層患者（n=3）與健康人（n=3）基本信息見(jiàn)表1，健康人年齡和性別與患者相匹配。應(yīng)用Mascot軟件對(duì)Swissprot Human數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索，共鑒定到血清蛋白648種，通過(guò)t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析（FC＞4.00倍或＜0.25倍，P＜0.05）為差異顯著的蛋白，最終得到了12種差異顯著蛋白（表2）。其中紐蛋白（P18206）的含量要明顯高于其他蛋白。文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，紐蛋白是一種主要分布在細(xì)胞-細(xì)胞連接處及細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)黏著斑部位的細(xì)胞骨架蛋白兼黏著斑蛋白，其可能為夾層撕裂時(shí)主動(dòng)脈釋放出的蛋白。因此，紐蛋白即為本研究目標(biāo)蛋白。

表1 AAD組與健康組基本信息［±s，例數(shù)及百分率（%）］

表1 AAD組與健康組基本信息［±s，例數(shù)及百分率（%）］

組別 例數(shù) 男性 年齡（歲） 高血壓 采血至發(fā)病時(shí)間（h）AAD 組 3 3（100） 51.67±11.29 3（100） 18.19±5.47健康組 3 3（100） 59.67±4.41 0（0） -

2.2 驗(yàn)證血清紐蛋白濃度 對(duì)9例AAD、9例AMI患者及9例正常健康志愿者的血清標(biāo)本中紐蛋白濃度進(jìn)行檢測(cè)（患者基本臨床信息見(jiàn)表3），夾層組紐蛋白濃度［n=9，（1366.95±394.85）pg/ml］低于心梗組［n=9，（2656.91±531.98）pg/ml］和健康人組［n=9，（3949.37±314.61）pg/ml］（P＜0.05），見(jiàn)表 3、圖1。

表2 通過(guò)蛋白組學(xué)分析得到的血清中12種差異蛋白

表3 試驗(yàn)組與對(duì)照組基本信息［±s，例數(shù)及百分率（%）］

表3 試驗(yàn)組與對(duì)照組基本信息［±s，例數(shù)及百分率（%）］

組別 例數(shù) 男性 年齡（歲） 高血壓 采血至發(fā)病時(shí)間（h）AAD 組 9 7（77.78） 41.7±10.0 7（77.78） 57.5±16.0 AMI組 9 6（66.67） 65.78±12.8 7（77.78） 22.06±5.40健康組 9 7（77.78） 31.0±5.1 0（0） -P值 ＞0.05 ＜0.01 ＞0.05 ＞0.05

2.3 免疫組化結(jié)果 AAD主動(dòng)脈壁組織vinculin均呈陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率100%，對(duì)比撕裂處的主動(dòng)脈壁組織與未發(fā)生撕裂的主動(dòng)脈壁組織，主動(dòng)脈壁組織發(fā)生撕裂處代表vinculin的棕黃色顆粒陰影明顯比未撕裂處要密集。見(jiàn)圖2、3。

3 討論

紐蛋白（Vinculin）最早在1979年被Geiger發(fā)現(xiàn)，其相對(duì)分子質(zhì)量為117 kD，由1066個(gè)氨基酸組成，基因定位于人類染色體10q11.2qter。紐蛋白是黏著斑處的一個(gè)非常關(guān)鍵的接頭蛋白。它通過(guò)自身結(jié)構(gòu)與其他黏著斑蛋白，如踝蛋白（talin）、樁蛋白（paxillin）及細(xì)胞骨架蛋白，如F-肌動(dòng)蛋白（F-actin）、α-輔肌動(dòng)蛋白（α-actinin）相互作用以調(diào)節(jié)黏著斑及細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)[6]。在整合素介導(dǎo)的細(xì)胞黏附過(guò)程中，當(dāng)整合素與細(xì)胞外基質(zhì)接觸時(shí)，便受到細(xì)胞外基質(zhì)的應(yīng)力，而這種應(yīng)力作用通過(guò)細(xì)胞的力-化學(xué)信號(hào)傳導(dǎo)促使紐蛋白活化，并向黏著斑處聚集，活化的紐蛋白使黏著斑穩(wěn)定、增大，減少細(xì)胞的移動(dòng)[7]。在腫瘤細(xì)胞中，紐蛋白作為黏著斑的另一個(gè)組成蛋白，當(dāng)使用siRNA阻斷紐蛋白的表達(dá)后，細(xì)胞遷移明顯增加，說(shuō)明紐蛋白有抑制細(xì)胞遷移的作用[8,9]。

在AAD的發(fā)病過(guò)程主動(dòng)脈發(fā)生撕裂部位的整合素受到應(yīng)力刺激，通過(guò)細(xì)胞的力-化學(xué)信號(hào)傳導(dǎo)促使紐蛋白向其所在的黏著斑處聚集，并由非活化狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)。這些聚集在撕裂處的黏著斑蛋白在疾病初期可能還未能形成牢固的附著。這時(shí)受到高壓血流的沖擊，撕裂處細(xì)胞受損，破裂的細(xì)胞釋放出紐蛋白，使其在血清中的濃度短暫升高。本研究用于進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究的AAD血清采集于患者出現(xiàn)癥狀24 h內(nèi)，并且入院后尚未進(jìn)行臨床治療，在蛋白質(zhì)組學(xué)的檢測(cè)結(jié)果中AAD患者血清中紐蛋白的濃度要高于健康對(duì)照組，雖然結(jié)果未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但我們認(rèn)為主要是受到了樣本量少的影響。

隨著發(fā)病后時(shí)間的延長(zhǎng)及臨床上通過(guò)干預(yù)措施使AAD患者血壓下降等，主動(dòng)脈撕裂延緩，而處在活化狀態(tài)紐蛋白與其他黏著斑蛋白及細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合緊密，不易脫落，免疫組化染色也發(fā)現(xiàn)撕裂處的紐蛋白分布明顯集中，因而使得血清中紐蛋白濃度迅速下降。本研究用于驗(yàn)證的AAD血清樣本采集時(shí)，患者出現(xiàn)癥狀時(shí)間均已超過(guò)24 h，并且接受了藥物等臨床治療，高血壓等危險(xiǎn)因素已得到較好的控制，通過(guò)ELISA檢測(cè)這部分患者血清中紐蛋白的含量要低于AMI對(duì)照組及健康對(duì)照組。說(shuō)明紐蛋白在AAD患者血清中的濃度變化曲線符合AAD的疾病發(fā)展過(guò)程。

但本研究樣本量較少，而且未能分時(shí)段進(jìn)行血清樣本的收集及在進(jìn)行臨床干預(yù)前后分別收集，未能對(duì)同一患者出現(xiàn)癥狀后不同時(shí)段及進(jìn)行臨床干預(yù)前后血清中紐蛋白的變化進(jìn)行比較。紐蛋白作為AAD循環(huán)標(biāo)志物的價(jià)值還有待進(jìn)一步的研究來(lái)明確。

（本文圖片第672頁(yè)）

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Screening diagnostic biomarkers of acute aortic dissection by proteomics

WANG He-qing，ZHANG Zhe，TANG Qian，et al.Department of Cardiac Surgery，Peking University Third Hospital，Beijing 100091，China

Objective To screen and identify potential serum biomarkers for acute aortic dissection using label-free proteomics.Methods Serum samples were collected from 3 AAD patients and 3 healthy people.Label free quantitation proteomic approach was used to identify the proteins in serum.The proteins with significant difference are validated as the candidate proteins（fold changes>4 or<0.25，P＜0.05）.Then collected serum samples from 9 AAD patients and 9 AMI patients and 9 healthy controls were detected for target protein by Elisa，andAAD and normal aortic tissues were collected to verify the location of target protein.Results Among 648 types of proteins which were identified by proteomic，12 proteins were significantly different（fold changes>4 or<0.25，P＜0.05）.The protein，vinculin，was significantly higher than the other proteins.The serum levels of vinculin by ELISA showed that the AAD group was lower than the AMI group and the healthy group［（1366.95±394.85）pg/ml vs（2656.91±531.98）pg/ml vs（3949.37±314.61）pg/ml，P＜0.05］though immunohistochemistry staining demonstrated that vinculin distributed more intensively at the laceration site.Conclusion Our study indicates that labelfree quantitation proteomics may be an available method for finding circulation biomarkers for AAD diagnosis.Vinculin，which is probably involved in the pathogenesis of AAD，is a potential circulation biomarker for AAD.

Acute aortic dissection； Label-free proteomics； Vinculin

ZHANG Zhe，E-mail：zhangzhe@bjmu.edu.cn

北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部-密歇根大學(xué)醫(yī)學(xué)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)與臨床聯(lián)合研究所（項(xiàng)目編號(hào)：BMU20140469）

100091 北京市，北京大學(xué)第三醫(yī)院心外科

張喆，E-mail：zhangzhe@bjmu.edu.cn

10．3969/j．issn．1672－5301．2016．07．021

R543.1

A

1672-5301（2016）07-0654-04

2016-01-08）