SATB1在人不同前列腺癌細(xì)胞系中表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究

韓陽軍　王冰　蒙學(xué)冰　劉紅雷　谷亞明　張明華　刁英智　黃偉超　佟明

[摘要]目的：探討SATB1與前列腺癌增殖及侵襲發(fā)生的關(guān)系。方法：體外培養(yǎng)前列腺癌細(xì)胞系（LNCaP、PC3、DU145），MMT法檢測其增殖能力；Tanswell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測其侵襲能力；RT-PCR檢測其SATB1 mRNA的表達(dá)情況；Western blot檢測其SATB1蛋白質(zhì)的表達(dá)。結(jié)果：前列腺癌細(xì)胞PC3和DU145的增值能力及侵襲能力比LNCaP強(qiáng)（P<0.01），PC3和DU145細(xì)胞中SATB1 mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平均顯著高于LNCaP細(xì)胞（P<0.01）。結(jié)論：SATB1在前列腺癌表達(dá)水平可能與前列腺癌的增殖和侵襲正相關(guān)。

[關(guān)鍵詞]SATB1；前列腺癌；LNCaP；PC3；DU145

[中圖分類號(hào)]R737.25 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

隨著我國人口的老齡化、飲食結(jié)構(gòu)和生活方式的改變，以及診斷水平的提高，前列腺癌在國內(nèi)發(fā)病率與相關(guān)死亡人數(shù)也在逐年上升，在我國男性惡性腫瘤發(fā)病率排名中居第六位：死亡率在所有男性惡性腫瘤中排第九位。前列腺癌對(duì)人類健康的威脅變得越來越嚴(yán)重，已成為影響我國男性，尤其是50歲以上男性健康的一個(gè)重要因素。SATB1（special AT rich sequencebinding protein 1）是一種組織特異性表達(dá)的核基質(zhì)結(jié)合蛋白（matrix attachment regions binding protein），在胸腺細(xì)胞和前B細(xì)胞之中顯著表達(dá)，其次是造血干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞，在其他細(xì)胞中很少表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)SATB1與乳腺癌、肝癌、胃癌、食道癌、結(jié)直腸癌、黑索瘤、膀胱癌、腎癌等腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移有關(guān)。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)SATB1在前列腺癌中高表達(dá)，且其與病理分級(jí)、臨床分期密切相關(guān)。本研究通過比較不同前列腺癌細(xì)胞系（LNCaP、PC3和DU145）之間的增殖與侵襲能力及其與SATB1基因和蛋白質(zhì)表達(dá)情況，探討SATB1在前列腺癌增殖及侵襲中的作用，為前列腺癌的診斷、治療尋找一個(gè)可能的新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人前列腺癌細(xì)胞株LNCaP、PC3和DU145購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞研究中心。

1.1.2 主要試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自美國Hyclon公司：胰蛋白酶、DMSO（二甲基亞砜）和Hochest33258購自美國Sigma公司；MTT（四甲基偶氮唑鹽）購自北京中杉公司；3422 Transwell購自美國Coming公司；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；RT-PCR試劑盒、Wide RangeDNA Marker、TaqDNA聚合酶均購自日本Takara公司；羊多抗SATB1購自美國Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) LNCaP、PC3、DU145細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基（青鏈霉索各100U/mL）中，于37℃、5%C02飽和濕度下培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，每48h換液一次，細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)，按1：2或1：3進(jìn)行傳代。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法 1.2.2.1 噻唑藍(lán)（MTI"）比色法測定檢測LNCaP、PC3、DU145細(xì)胞增殖能力 將生長狀態(tài)良好的上述3種細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，按每孔10³個(gè)細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，分別將3種細(xì)胞培養(yǎng)至24h、48h、72h；每孔中加入預(yù)先配制好的MTT試劑20μL，37℃繼續(xù)孵育4h，棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，然后每孔加二甲亞砜（DMSO）150μL混合均勻在酶聯(lián)免疫檢測儀上570nm波長處檢測各孔吸光度值（A），記錄結(jié)果，取均值，以時(shí)間為橫軸，光吸收值（A）為縱軸繪制細(xì)胞生長曲線。

1.2.2.2 Tanswell細(xì)胞侵襲試驗(yàn)檢測LNCaP、PC3、DU145細(xì)胞的侵襲能力 將Corning3422 TransweH培養(yǎng)板提前一天用Fi-bronectin包被過夜：取上述3組的細(xì)胞，胰酶消化后用FBS 5%的RPMI 1640培養(yǎng)基懸?。灰?×10⁵/mL的細(xì)胞密度接種至上面的小室中，每孔100μL，下室加入600μL含F(xiàn)BS 10%的RPMI1640培養(yǎng)基中，每種細(xì)胞4個(gè)復(fù)室；培養(yǎng)24h后用Hochest33258避光染色，以穿過Transwell小室的細(xì)胞數(shù)量，作為評(píng)價(jià)侵襲能力的指標(biāo)。熒光顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，每張片取4個(gè)視野，記錄數(shù)值。

1.2.2.3 RT-PCR檢測LNCaP、PC3、DU145細(xì)胞SATB1 mR-NA的表達(dá) Tfizd法提取細(xì)胞的總RNA，紫外分光光度計(jì)測定RNA的濃度和純度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性；取RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；GenBank獲取人SATB1 mRNA全序列（GenBank ACCESSION：NM_002971）、人β-actin mRNA全序列（GenBank ACCESSION：NM_001101）利用Primer5.0軟件，設(shè)計(jì)引物。SATB1上游引物：5/-TGATGGCTCAGCTGCTGAAC-3/，下游弓l物5/-GGGAGGACGGCTGGGTGGTGT-3/，β-actin上游引物：5/-ATCATGTTTGAGACCTYCAACA-3/下游引物：5/-AGGTAGTCAGTCAGGTCCCGG-3/。RNA反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s；56℃退火30s；72℃延伸1min；重復(fù)30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸5min。瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，應(yīng)用GSG2002核酸，蛋白凝膠圖像分析管理系統(tǒng)進(jìn)行灰度測量，以每一樣品與其內(nèi)參β-actin的比值代表該樣品PCR產(chǎn)物的相對(duì)含量。

1.2.2.4 Western blot檢測 LNCaP、PC3和DU145細(xì)胞SATB1蛋白質(zhì)水平以細(xì)胞裂解液裂解篩選后的細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，測定蛋白的濃度，制備SDS-PAGE膠，每泳道加入10μg總蛋白，電泳。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維（NC）膜，用0.01M PBS洗膜，加入包被膜，室溫2h；加入一抗（羊抗人多克隆抗體SATB1），4℃放置12h；棄一抗，用0.01M PBS洗膜；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1：2000），室溫2h；棄二抗，0.01M PBS洗膜，加入顯色液，干燥后行條帶掃描和利用凝膠自動(dòng)分析成像軟件Chem image 5500對(duì)蛋白條帶進(jìn)行分析。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均以（x±s）表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用方差分析、q檢驗(yàn)，采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P>0.05認(rèn)為差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P≤0.05認(rèn)為差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01認(rèn)為差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LNCaP、PC3和DU145細(xì)胞增殖能力

人前列腺癌細(xì)胞PC3和DU145每24h的細(xì)胞生長速度均比較LNCaP細(xì)胞快，增殖能力比LNCaP細(xì)胞強(qiáng)（P<0.01），PC3和DU145細(xì)胞之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。見表1和圖1。

2.2 LNCaP、PC3和DU145細(xì)胞侵襲能力

以穿過Transwell小室模擬基底膜的細(xì)胞數(shù)來表示細(xì)胞的侵襲能力，3種細(xì)胞24h后穿透涂Matrigel膠基底膜的細(xì)胞數(shù)是：PC3（33.00±3.52）、DU145（30.67±4.19）、LNCaP（5.16±1.11），PC3和DU145穿過膜的細(xì)胞數(shù)明顯多于LNCaP細(xì)胞（P<0.01），而人前列腺癌細(xì)胞PC3和DU145穿過膜的細(xì)胞數(shù)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。見圖2。

2.3 LNCaP、PC3和DU145細(xì)胞SATB1 mRNA表達(dá)情況

LNCaP、PC3和DU145細(xì)胞總RNA以瓊脂糖凝膠電泳鑒定（見圖3），28S：18S=2：1，無DNA條帶的污染，RNA的完整性較好，無降解。經(jīng)紫外分光光度法評(píng)定，OD260nm/OD280nm比值均在1.8-2.0之間，表明RNA的純度較高，可用于PCR擴(kuò)增。3種細(xì)胞均有SATB1 mRNA表達(dá)，片段大小為452bp，與預(yù)計(jì)結(jié)果一致；各樣本β-actin對(duì)照均在相應(yīng)位置203bp處出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增條帶，表明RT—PCR過程良好（圖4）。SATB1 mRNA在PC3與DU145中的表達(dá)高于LNCaP細(xì)胞，其差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），而PC3與DU145之間的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（圖5）。

2.4 SATB1蛋白質(zhì)在PC3、DU145與LNCaP細(xì)胞中的表達(dá)情況

在相對(duì)分子量115kDa附近，PC3、DUl45與LNCaP細(xì)胞均有陽性條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。圖6、圖7顯示SATB1蛋白質(zhì)在PC3、DU145細(xì)胞中的表達(dá)高于LNCaP細(xì)胞（P<0.01），而PC3與DU145細(xì)胞之間的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

3 討論

本次研究，我們選用了LNCaP、PC3和DU145三種人前列腺癌細(xì)胞株。LNCaP細(xì)胞為雄激素依賴型前列腺癌細(xì)胞株，PC3和DU145是雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞株，均為發(fā)生前列腺外轉(zhuǎn)移的細(xì)胞株。無限性增殖是腫瘤細(xì)胞的基本特征，也是腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)和前提，隨著細(xì)胞的增殖導(dǎo)致腫瘤組織內(nèi)部壓力增高，這種擴(kuò)張性的壓力有利于癌細(xì)胞向壓力低的方向侵襲和轉(zhuǎn)移。我們用MTr法檢測三種前列腺癌細(xì)胞株的增殖生長情況，結(jié)果顯示PC3、DU145細(xì)胞的增殖能力比LNCaP細(xì)胞強(qiáng)（P<0.01），而PC3和DU145細(xì)胞之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），與Engl等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。Tanswell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)是目前體外研究腫瘤細(xì)胞侵襲行為的最經(jīng)典方法。本次我們利用這種實(shí)驗(yàn)檢測3種人前列腺癌細(xì)胞株的侵襲能力，結(jié)果顯示人前列腺癌PC3和DU145穿膜細(xì)胞數(shù)多于LNCaP細(xì)胞（P<0.01），而PC3、DU145穿膜細(xì)胞數(shù)差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），表明PC3和DU145細(xì)胞的侵襲能力高于LCaP細(xì)胞，與以往體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致。這可能與雄激素依賴性前列腺癌和雄激素非依賴性前列腺癌的臨床特性相關(guān)。前列腺癌臨床上早期多為激素依賴性的，中晚期或復(fù)發(fā)后的前列腺癌大都獲得了激素非依賴性生長和多藥耐藥的特性，且多發(fā)生遠(yuǎn)處器官的轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致常規(guī)治療的失敗，患者病死率高。

SATB1通過限定多個(gè)基因組的位點(diǎn)和補(bǔ)充染色質(zhì)修飾酶來調(diào)節(jié)染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和基因的表達(dá)。我們用RT-PCR和Western Blot檢測SATB1在PC3、DU145和LNCaP細(xì)胞中的表達(dá)，經(jīng)方差分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)SATB1 mRNA和蛋白在人前列腺癌細(xì)胞PC3、DU145和LNCaP中的表達(dá)水平不盡相同（P<0.01），采用多樣本均數(shù)間的兩兩比較q檢驗(yàn)分析，PC3和DU145細(xì)胞中的表達(dá)水平高于LNCaP細(xì)胞，其差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），而PC3與DU145之間的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說明SATB1 mRNA和蛋白在不同的前列腺癌細(xì)胞中表達(dá)水平不同。本次研究與其他學(xué)者的研究結(jié)果相似。國外學(xué)者Han等對(duì)乳腺癌的一項(xiàng)研究表明SATB1蛋白是乳腺癌細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)移性所必需的，其在具有侵襲性的乳腺癌細(xì)胞中有所表達(dá)，而在正常細(xì)胞中并不出現(xiàn)。SATB1 mR-NA的表達(dá)可能與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生和淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)。體外、體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)通過抑制SATB1的表達(dá)，可以抑制前列腺癌的生長和轉(zhuǎn)移。在具有較強(qiáng)侵襲性的癌細(xì)胞中敲除SATB1基因，可以改變腫瘤細(xì)胞的極性而逆轉(zhuǎn)腫瘤的發(fā)生，抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。我們本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SATB1在人前列腺癌細(xì)胞PC3、DU145中的表達(dá)高于LNCaP，而且人前列腺癌細(xì)胞PC3、DU145的增殖及侵襲能力強(qiáng)于LNCaP，表明SATB1的表達(dá)可能與前列腺癌的增殖及侵襲性呈正相關(guān)。

隨著對(duì)前列腺癌機(jī)制研究的逐步深入和對(duì)SATB1結(jié)構(gòu)和功能認(rèn)識(shí)的提高，我們可能借助于檢測SATB1在前列腺癌中的表達(dá)，評(píng)估前列腺癌的預(yù)后，同時(shí)我們也有可能通過以SATB1為作用靶點(diǎn)尋找到一種新型高效的治療前列腺癌途徑。

（收稿日期；2015-07-20）