琥珀酰化燕麥分離蛋白制備條件的優(yōu)化及其結(jié)構(gòu)分析

劉金陽，趙城彬，陳　旸，張　瑤，張　揚(yáng)，吳　非（.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱50030；.黑龍江農(nóng)業(yè)工程職業(yè)學(xué)院，黑龍江哈爾濱50030）

琥珀酰化燕麥分離蛋白制備條件的優(yōu)化及其結(jié)構(gòu)分析

劉金陽1，趙城彬1，陳旸1，張瑤1，張揚(yáng)2，吳非1
（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030；2.黑龍江農(nóng)業(yè)工程職業(yè)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

為提高燕麥分離蛋白（OPI）的溶解性，采用琥珀?；▽?duì)燕麥分離蛋白進(jìn)行改性。通過單因素實(shí)驗(yàn)研究反應(yīng)溫度、pH、酸酐添加量、蛋白濃度對(duì)OPI溶解性的影響，同時(shí)采用熒光發(fā)射光譜對(duì)其結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行分析。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化出琥珀?；男匝帑湻蛛x蛋白的適宜條件：反應(yīng)溫度為50℃、pH為8.5、酸酐添加量為10%、蛋白濃度為4%，在此條件下溶解度為68.38%。熒光發(fā)射光譜檢測得出，琥珀?；驩PI的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，是由于改性后側(cè)鏈結(jié)構(gòu)展開，更多的亮氨酸暴露出來所引起。

燕麥分離蛋白，琥珀酰化，優(yōu)化，結(jié)構(gòu)

燕麥作為一種優(yōu)質(zhì)谷物，其蛋白質(zhì)含量高于其他谷物，并且氨基酸配比均衡，必需氨基酸含量都接近或略高于世界衛(wèi)生組織推薦值［1-2］。研究表明，燕麥分離蛋白（OPI）具有免疫性，可以用作嬰兒食品的添加劑以及生物醫(yī)藥制劑［3］。然而，OPI的溶解性較差，不能滿足食品加工的要求，OPI的應(yīng)用由此受到了極大的限制。琥珀酸酐是美國食品法典允許使用的食品加工助劑，而且因加工中采用氫氧化鈉調(diào)節(jié)體系的pH，反應(yīng)的產(chǎn)物中會(huì)產(chǎn)生少量的琥珀酸鈉和琥珀酸二鈉，兩者都是食品鮮味劑，可改善食品風(fēng)味。因此，琥珀?；男苑ㄊ且环N安全無毒還能提高蛋白風(fēng)味的改性方法，可以既不影響蛋白質(zhì)營養(yǎng)價(jià)值，又能提高其功能性質(zhì)。目前，國內(nèi)外對(duì)燕麥蛋白的?；男匝芯亢苌?，只能借鑒于?；男詫?duì)其他植物蛋白溶解性等功能性質(zhì)的研究［4-11］，而對(duì)改性燕麥分離蛋白結(jié)構(gòu)的測定分析更是鮮有報(bào)道。因此，本文不僅著重探尋適宜的酰化改性條件來改善OPI的溶解性，同時(shí)采用熒光發(fā)射光譜法對(duì)?；男郧昂蟮腛PI結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步分析，為OPI進(jìn)一步的深層研究提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

燕麥分離蛋白（OPI） 實(shí)驗(yàn)室自制，蛋白質(zhì)含量為85.76%；琥珀酸酐國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；G-250考馬斯亮藍(lán)上海荔達(dá)生物科技有限公司；牛血清蛋白上海伯奧生物科技有限公司；茚三酮萊陽市雙雙化工有限公司；所用其他試劑均為分析純。

LGJ-10型冷凍凍干機(jī)上海醫(yī)用離心機(jī)廠；JJ-1精密定時(shí)電動(dòng)攪拌器江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；FE20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；數(shù)顯攪拌水浴鍋常州賽普實(shí)驗(yàn)儀器廠；紫外分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；日立F4500熒光分光光度計(jì)日本HITACHI公司；其他儀器均為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1琥珀?；疧PI的制備將2 g OPI分散在50 mL去離子水中（蛋白質(zhì)濃度為4%，w/v），在室溫下攪拌1 h，用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH為8.5，然后分批加入一定量的琥珀酸酐（琥珀酸酐占OPI的質(zhì)量比為10%），反應(yīng)過程中不斷攪拌，并用1 mol/L NaOH維持pH穩(wěn)定不變，直至溶液pH不再變化反應(yīng)結(jié)束。將蛋白溶液在4℃透析24 h以除去殘余的琥珀酸酐，凍干即為酰化蛋白［12］。

1.2.2OPI琥珀酰化條件的單因素實(shí)驗(yàn)基本反應(yīng)條件為：反應(yīng)溫度50℃，pH8.5，琥珀酸酐添加量10%，蛋白質(zhì)濃度4%。在其他條件不變的情況下，以溶解度和酰化度為考察指標(biāo)，選擇反應(yīng)溫度為30、40、50、60、70℃，pH為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，琥珀酸酐添加量為5%、10%、15%、20%、25%，蛋白濃度為1%、2%、3%、4%、5%（w/v），進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，考察各因素對(duì)其溶解度和?；鹊挠绊?，每個(gè)樣品做3組平行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3OPI琥珀?；瘲l件的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，反應(yīng)溫度（A）、pH（B）、琥珀酸酐添加量（C）和蛋白濃度（D）為自變量，溶解度（R1）為響應(yīng)值設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了四因素三水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果采用Design-Expert 7.1軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)的因素和水平取值見表1。

表1　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1　Code of factors and levels

1.2.4溶解度的測定根據(jù)Bradford法稍作改動(dòng)。配制1%?；鞍讟悠?0 mL，于25℃磁力攪拌0.5 h，分散液以4000 r/min離心15 min，取50 μL上清液與試管中，并加入50 μL生理鹽水和5 mL考馬斯G-250振蕩1 min，放置10 min后，以100 μL生理鹽水和5 mL考馬斯G-250作空白，于595 nm處進(jìn)行比色測定，以牛血清蛋白（1 mg/mL）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.6731x+0.0067（R2=0.9974）。蛋白質(zhì)的溶解度表示為上清液蛋白濃度占總蛋白濃度的百分比。每個(gè)樣品測定三次。

1.2.5?；鹊臏y定酰化度采用茚三酮法測定：配制1%（w/v）的蛋白液，取1 mL放入試管中，再向試管中加入1 mL的茚三酮顯色劑［13］，搖勻后蓋塞，在沸水中加熱16 min，取出后在20℃的水浴中冷卻，再向試管中加入5 mL的KIO3稀釋液，振蕩搖勻，以蒸餾水作空白，測定樣品在570 nm處的吸光值。以吸光度表示燕麥分離蛋白的酰化度，吸光度越高，?；仍降?。

1.2.6燕麥分離蛋白結(jié)構(gòu)的測定采用熒光分光光度計(jì)測定，激發(fā)波長為280 nm，發(fā)射波長測定范圍為300～450 nm。將樣品稀釋到OPI濃度為0.5%［14］。

1.3數(shù)據(jù)處理

原始數(shù)據(jù)的整理采用Microsoft Exce（lOffice 2003）完成；數(shù)據(jù)均為三組平行實(shí)驗(yàn)所得的平均值，數(shù)據(jù)以表示；采用Design-Expert中心組合及混合中心設(shè)計(jì)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及方差分析。

2　結(jié)果與討論

2.1OPI琥珀酰化條件單因素實(shí)驗(yàn)分析

2.1.1反應(yīng)溫度對(duì)OPI溶解度的影響如圖1所示，在30～50℃這一區(qū)間內(nèi)，溶解度隨著溫度的升高而升高，在50℃時(shí)達(dá)到最大值為66.2%。這是由于在一定溫度范圍內(nèi)，反應(yīng)溫度升高，粒子運(yùn)動(dòng)速率就會(huì)增加，反應(yīng)速度加快，琥珀?；瘜?duì)OPI的改性程度增大，OPI的?；纫搽S之升高，這樣OPI引入親水基團(tuán)（琥珀羧基），消除了蛋白質(zhì)中的氨基陽離子，增加了蛋白質(zhì)分子的凈負(fù)電荷，減弱了分子間聚集作用，從而提高了其親水性。隨著反應(yīng)溫度的繼續(xù)升高，OPI的溶解度趨于穩(wěn)定，而酰化度略有下降，這可能是由于，反應(yīng)溫度的升高導(dǎo)致粉末狀的琥珀酸酐加速了使蛋白分子沉淀的現(xiàn)象，從而使?；扔兴档汀Ｒ虼?，50℃為適宜的反應(yīng)溫度。

圖1　反應(yīng)溫度對(duì)琥珀?；疧PI溶解度的影響Fig.1　The effect of reaction temperature on the solubility of succinylated OPI

2.1.2pH對(duì)OPI的溶解度的影響如圖2所示，琥珀?；m宜在中性偏堿的條件下進(jìn)行，當(dāng)反應(yīng)pH在7～8.5之間時(shí)，溶解度隨著pH提高而增加；pH8.5達(dá)到最大值68.5%，而后pH增大溶解度略有下降。這是由于琥珀?；瘯r(shí)引入親水基團(tuán)，增加了蛋白質(zhì)的凈負(fù)電荷，pH的升高導(dǎo)致凈負(fù)電荷更多，更易于分散，所以pH越高，溶解度越大，反應(yīng)速度越快，進(jìn)而琥珀?；瘜?duì)OPI的改性程度增大，OPI的?；壬?。但超過一定范圍，pH越大，OH-濃度也越大，?；狈磻?yīng)程度越高，從這方面講，pH越高不利于酰化反應(yīng)的進(jìn)行，因此，選取8.5為適宜的pH。

圖2　pH對(duì)琥珀?；疧PI溶解度的影響Fig.2　The effect of pH on the solubility of succinylated OPI

2.1.3琥珀酸酐添加量對(duì)OPI的溶解度的影響如圖3所示，當(dāng)琥珀酸酐添加量為小于10%時(shí)，溶解度隨著琥珀酸酐添加量的增加而呈遞增趨勢(shì)，在琥珀酸酐添加量為10%時(shí)溶解度達(dá)到最大值為68.8%。當(dāng)琥珀酸酐添加量繼續(xù)增加時(shí)，溶解度將趨于平穩(wěn)，?；纫糙呌谄胶狻＿@是因?yàn)楫?dāng)?；冗_(dá)到92.4%時(shí)，被修飾的ε-NH2殘基基本反應(yīng)完全，產(chǎn)物的溶解度隨酰化度達(dá)到最大并趨于平衡，所以琥珀酸酐添加量并不是越大越好。所以，適宜的琥珀酸酐添加量為10%。

圖3　琥珀酸酐添加量對(duì)琥珀酰化OPI溶解度的影響Fig.3　The effect of addition of succinic anhydride on the solubility of succinylated OPI

2.1.4蛋白濃度對(duì)OPI的溶解度的影響如圖4所示，蛋白濃度較小時(shí)，溶解度隨著蛋白濃度的增大而增加，當(dāng)達(dá)到4%時(shí)，溶解度達(dá)到最大值67.4%，而后溶解度和?；炔辉僭黾泳呌谄骄?。原因是當(dāng)燕麥分離蛋白濃度較低時(shí)，蛋白質(zhì)分子處于溶解狀態(tài)，與琥珀酸酐分子碰撞的幾率大，所以?；仍黾?；當(dāng)?shù)鞍诐舛仍黾拥?%時(shí)，許多蛋白分子呈非溶狀態(tài)，

圖4　蛋白濃度對(duì)琥珀?；疧PI溶解度的影響Fig.4　The effect of the concentration of OPI on the solubility of succinylated OPI

在反應(yīng)體系中，不能再與琥珀酸酐分子發(fā)生有效碰撞，因此酰化度不再增大。燕麥分離蛋白的蛋白濃度不超過4%時(shí)，其?；仍酱?，溶解度也越高，因?yàn)轷；仍酱螅胗H水性琥珀酸酐基團(tuán)越多，凈負(fù)電荷越多，靜電斥力越大，蛋白質(zhì)與水的相互作用越強(qiáng)，溶解度提高。所以選取4%為適宜的蛋白濃度。

2.2OPI琥珀?；瘲l件響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)分析

表2　Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2　Experiment design and results table of Box-Behnken

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原則，確定了響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素的0水平為：A反應(yīng)溫度為50℃、B pH為8.5、C琥珀酸酐添加量為10%和D蛋白濃度為4%。

響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案和實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，利用Design-Expert 7.1軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次回歸分析，計(jì)算OPI溶解性R1的回歸方程并進(jìn)行方差分析（見表3）。根據(jù)表3的方差分析對(duì)Box-behnken模型方程進(jìn)行優(yōu)化，剔除影響不顯著項(xiàng)，得到優(yōu)化后的回歸模型為：R1=67.92+0.49A+3.34B+3.63C+1.99D-0.90BC-0.75BD-1.56A2-3.69B2-3.39C2-2.11D2

表3　方差分析結(jié)果Table 3　The test results of variance analysis

由表3可知，方程因變量與自變量之間的線性關(guān)系明顯，該模型回歸顯著（p＜0.0001），失擬項(xiàng)不顯著（p＞0.05），并且該模型R2=0.9872，R2Adj=0.9744，說明該模型與實(shí)驗(yàn)擬合良好，自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，可以用于該反應(yīng)的理論推測。由F檢驗(yàn)可以得到因子貢獻(xiàn)率為：C＞B＞D＞A，即琥珀酸酐添加量＞pH＞蛋白濃度＞反應(yīng)溫度。

由圖5和圖6可知，在固定兩個(gè)因素（水平值為0）水平值時(shí)，其他兩個(gè)因素的3D曲面圖的總體形狀較為相似，都是隨著另一因素的變化一直升高后趨于平緩。綜合上述圖形等高線和方差分析結(jié)果，pH（B）和琥珀酸酐添加量（C）、pH（B）和蛋白濃度（D）的交互作用影響顯著（p＜0.05）。應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化分析方法對(duì)回歸模型進(jìn)行分析，并根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行修正后得到OPI琥珀?；顑?yōu)條件為：反應(yīng)溫度為50℃、pH為8.5、琥珀酸酐添加量為10%、蛋白濃度為4%。按照最優(yōu)工藝條件進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，得到琥珀?；男匝帑湹鞍追磻?yīng)條件下溶解度為68.38%，與預(yù)測值68.62%的誤差在±2%以內(nèi)，預(yù)測值與實(shí)驗(yàn)值之間的良好擬合性證實(shí)了模型的有效性。表明所得出的回歸方程可以很好的反映反應(yīng)溫度、pH、琥珀酸酐添加量、蛋白濃度與溶解度之間的關(guān)系，說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的工藝條件準(zhǔn)確可靠，按照建立的模型進(jìn)行預(yù)測實(shí)際實(shí)驗(yàn)是可行的。

圖5　pH和琥珀酸酐添加量對(duì)OPI溶解性的影響Fig.5　Effect of pH and addition of succinic anhydrideon the solubility of OPI

圖6　pH和蛋白濃度對(duì)OPI溶解性的影響Fig.6　Effect of pH and the concentration of OPI on the solubility of OPI

2.3琥珀?；昂驩PI的熒光光譜分析

蛋白質(zhì)的熒光性由芳香族氨基酸如色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸引起的。色氨酸的熒光發(fā)射通常用作蛋白構(gòu)想變化的指示器。因?yàn)樗鼘?duì)局部環(huán)境的高靈敏性，因此，蛋白質(zhì)的最大發(fā)射波長反映水相中暴露色氨酸殘基的平均值［15］。圖7顯示改性前后OPI的熒光發(fā)射光譜。與OPI相比，琥珀?；蟮腛PI的熒光強(qiáng)度增加。這可能由于琥珀?；^程中蛋白質(zhì)側(cè)鏈展開，使更多的亮氨酸暴露出來，因此在347 nm處最大吸收峰增大，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。經(jīng)琥珀?；男院?，肽鏈伸展，空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，分子柔韌性提高，使得其溶解性大大提高。

圖7　OPI和琥珀酰化OPI的熒光光譜圖Fig.7　Typical emission fluorescence spectra of untreated and succinylated OPI sample

3　結(jié)論

采用琥珀?；▽?duì)燕麥分離蛋白進(jìn)行改性，利用響應(yīng)面法優(yōu)化得到琥珀酰化OPI優(yōu)化工藝條件為：反應(yīng)溫度50℃、pH8.5、琥珀酸酐添加量10%、蛋白濃度4%。該條件下制備的琥珀酰化OPI的溶解度為68.38%，預(yù)測值與實(shí)驗(yàn)值之間的良好擬合性證實(shí)了模型的有效性，說明利用本實(shí)驗(yàn)建立的模型的優(yōu)化結(jié)果與實(shí)際情況吻合。琥珀?；驩PI的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，可能是改性后側(cè)鏈結(jié)構(gòu)展開，更多的亮氨酸暴露出來引起的。經(jīng)琥珀酰化改性后，肽鏈伸展，空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，分子柔韌性提高，使得其溶解性大大提高，為以后功能性質(zhì)的深入研究及應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。

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Optimization of preparation conditions and structural analysis of succinylated oat protein isolate

LIU Jin-yang1，ZHAO Cheng-bin1，CHEN Yang1，ZHANG Yao1，ZHANG Yang2，WU Fei1（1.College of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China；
2.Heilongjiang Agricultural Engineering Vocational College，Harbin 150030，China）

In order to improve the solubility of oat protein isolate（OPI），succinylation was used to modify the proteins.The effects of the temperature of reaction，pH，the ratio of succinic anhydride，and the concentration of proteins on solubility were studied by single factor experiments.The changes of structure of OPI were analyzed by fluorescence emission spectra.Through the response surface methodology，the optimal conditions were as follows：the temperature of reaction 50℃，pH8.5，the ratio of succinic anhydride 10%and the concentration of proteins 4%.The solubility of OPI reaches to 68.38%in the optimal conditions.Fluorescence intensity of succinylated oat protein isolate increased，which was obtained by fluorescence emission spectra.The increasing of fluorescence intensity was due to more exposed leucine which were caused by the expanding of the structure of side chains.

oat protein isolate；succinylation；optimization；structure

TS201.1

B

1002-0306（2016）04-0294-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.04.050

2015－07－06

劉金陽（1991-），女，碩士研究生，研究方向：植物蛋白，E-mail：jinnyliu2011@163.com。

吳非（1968-），女，博士，教授，研究方向：植物蛋白，E-mail：wfneau@163.com。

黑龍江省科技攻關(guān)項(xiàng)目（GC13B213）。