臨床分離耐甲氧西林表皮葡萄球菌SCCmec型別多樣性分析

楊永長(zhǎng)，陳　亮，肖代雯，喻　華，劉　華，黃文芳

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院/四川省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，成都 610072)

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臨床分離耐甲氧西林表皮葡萄球菌SCCmec型別多樣性分析

楊永長(zhǎng)，陳亮，肖代雯，喻華，劉華，黃文芳△

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院/四川省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，成都 610072)

目的探討臨床分離耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)SCCmec型別。方法收集臨床分離并經(jīng)全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)準(zhǔn)確鑒定的表皮葡萄球菌84株，通過PCR擴(kuò)增esp和mecA基因準(zhǔn)確鑒定MRSE，采用多重PCR對(duì)MRSE SCCmec進(jìn)行分型，分析其分布特點(diǎn)。結(jié)果PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，84株臨床分離表皮葡萄球菌均可擴(kuò)增出esp基因，mecA檢出率為76.19%(64/84)，其中血液、痰液、尿液和傷口分泌物MRSE檢出率分別為76.8%、68.8%、100.0%和71.4%。多重PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，64株MRSE中，SCCmec單一型別為22株，其中SCCmecⅠ型19株、SCCmec Ⅲ型3株；SCCmec混合型為42株，其中Ⅰ、Ⅱ混合型2株，Ⅰ、Ⅲ混合型14株，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ混合型12株，Ⅱ、Ⅲ混合型5株，Ⅲ、Ⅳ混合型9株。結(jié)論臨床分離的MRSE SCCmec型別存在明顯的多樣性，以混合SCCmec型別為主。

耐甲氧西林表皮葡萄球菌；SCCmec型別；MRSE；多樣性

近年來，隨著抗菌藥物的廣泛使用，耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)的檢出率越來越高，已成為全世界醫(yī)院感染的重要病原菌[1]。我國(guó)一項(xiàng)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，82.9%的臨床分離表皮葡萄球菌對(duì)甲氧西林耐藥[2]。攜帶mecA基因是甲氧西林耐藥的主要機(jī)制，該基因位于新型的可移動(dòng)元件SCCmec基因盒上，目前已發(fā)現(xiàn)多種SCCmec基因型，其中SCCmecⅠ、Ⅱ、Ⅲ型為醫(yī)院獲得性，SCCmecⅣ、Ⅴ型為社區(qū)獲得性。研究發(fā)現(xiàn)，凝固酶陰性的甲氧西林耐藥葡萄球菌中SCCmec型別具有明顯的多樣性[3-5]，可能同時(shí)含有1～3種SCCmec型別，以及其他新的SCCmec類型[6-8]。本文通過多重PCR檢測(cè)臨床分離MRSE的SCCmec型別，進(jìn)一步分析SCCmec型別的特點(diǎn)，為深入探討MRSE的分子特征奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1菌株來源84株表皮葡萄球菌為2012年3月至2013年3月本院門診及住院患者分離的無(wú)重復(fù)菌株，所有菌株采用全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)鑒定，其中血液分離56株，痰液分離16株，中段尿液分離5株，傷口分泌物分離7株。

1.2儀器與試劑PCR 反應(yīng)試劑、100 bp DNA Ladder 購(gòu)自北京康為世紀(jì)，PCR 擴(kuò)增儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司，電泳儀購(gòu)自美國(guó)Savant公司，凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司。esp、mecA和SCCmec分型的引物由上海英俊公司合成。

1.3檢測(cè)方法

1.3.1細(xì)菌收集與DNA提取復(fù)蘇低溫保存的表皮葡萄球菌，接種至血平板，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)24 h，收集細(xì)菌，按文獻(xiàn)[9]提取表皮葡萄球菌DNA。

1.3.2PCR擴(kuò)增esp基因按照文獻(xiàn)[10]的方法擴(kuò)增esp基因，根據(jù)凝膠電泳結(jié)果判斷臨床分離菌株是否為表皮葡萄球菌。

1.3.3PCR擴(kuò)增mecA基因按照文獻(xiàn)[10]的方法擴(kuò)增mecA基因，依據(jù)凝膠電泳結(jié)果區(qū)分MRSE和甲氧西林敏感表皮葡萄球菌(MSSE)。

1.3.4多重PCR對(duì)MRSE SCCmec分型按照文獻(xiàn)[11]合成引物，采用多重PCR擴(kuò)增MRSE菌株SCCmec基因盒上8個(gè)位點(diǎn)確定其型別。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用Excel2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2　結(jié)　　果

2.1PCR擴(kuò)增esp基因鑒定表皮葡萄球菌PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，所有臨床分離菌株均可擴(kuò)增出244 bp的esp基因片段，表明這些菌株都是表皮葡萄球菌。

2.2PCR擴(kuò)增mecA基因區(qū)分MSSE和MRSE臨床分離的84株表皮葡萄球菌中，mecA擴(kuò)增陽(yáng)性64株(76.19%)，mecA陰性20株，其中血液、痰液、尿液和傷口分泌物MRSE檢出率分別為76.8%、68.8%、100.0%和71.4%，提示不同來源分離的表皮葡萄球菌均以MRSE為主。

2.3臨床分離MRSE SCCmec分型結(jié)果多重PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，64株MRSE中，SCCmec單一型別為22株(34.38%)，其中 SCCmecⅠ型19株(29.69%)，SCCmec Ⅲ型3株(4.69%)。SCCmec混合型為42株(65.62%)，其中Ⅰ、Ⅱ混合型2株(3.13%)，Ⅰ、Ⅲ混合型14株(21.88%)，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ混合型12株(18.75%)，Ⅱ、Ⅲ混合型5株(7.81%)，Ⅲ、Ⅳ混合型9株(14.06%)。部分菌株的多重PCR凝膠電泳結(jié)果見圖1。

注：泳道1～7為臨床分離MRSE SCCmec；M為100 bp DNA Ladder。

3　討　　論

SCCmec是葡萄球菌屬所特有的一種遺傳結(jié)構(gòu)，至今未發(fā)現(xiàn)在其他菌種含有該元件，它主要由mec基因復(fù)合體、盒式染色體重組酶基因(ccr)和無(wú)功能J區(qū)組成，根據(jù)mec和ccr可將SCCmec分為SCCmecⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ。目前，MRSA的SCCmec分型研究比較成熟，而耐甲氧西林的凝固酶陰性葡萄球菌(MRCNS)中SCCmec的研究則相對(duì)較少，且所攜帶的SCCmec也相對(duì)比較復(fù)雜，研究中不斷發(fā)現(xiàn)新的型別和亞型。因此，研究SCCmec型別對(duì)了解MRCNS的分子特征具有重要意義。

由于地域和抗菌藥物使用習(xí)慣的不同，各國(guó)流行的MRCNS菌株存在一定的差異，美國(guó)主要以SCCmecⅣ型MRSE為主[12]，而巴西醫(yī)源性MRCNS主要攜帶SCCmecⅠ、Ⅲ型[13]。芬蘭一家醫(yī)療單位分離出的61 例MRCNS中，49 例(80%)為MRSE，SCCmec類型分布具有多樣性：20例(33%)Ⅳ型,11例(18%)Ⅴ型,4例(6%)Ⅰ型,3例(4%)Ⅱ型,還有23例(38%)是新類型[14]。國(guó)內(nèi)有關(guān)MRCNS研究顯示SCCmec型別也具有明顯的多樣性[5]。本研究應(yīng)用Oliveira法對(duì)64株MRSE的SCCmec分型顯示，SCCmecⅠ型占29.69%，SCCmec Ⅲ型占4.69%，SCCmec混合型占65.62%(包括3.13%的Ⅰ、Ⅱ混合型，21.88%的Ⅰ、Ⅲ混合型，18.75%的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ混合型，7.81%的Ⅱ、Ⅲ混合型，14.06%的Ⅲ、Ⅳ混合型)，大量混合型SCCmec菌株的出現(xiàn)反映了MRSE中SCCmec型別的多樣性。

目前世界各地不斷有新的SCCmec基因型被報(bào)道。愛爾蘭學(xué)者發(fā)現(xiàn)在MRSA中存在SCCmecⅠ-pls型(不含pls)、SCCmecⅢ-pI258/Tn554型(不含pI258/Tn554)和SCCmec Ⅳ-dcs型(無(wú)dcs區(qū))等變異體[15]。我國(guó)學(xué)者在海南省分離的MRSA中檢測(cè)出包括缺少dcs區(qū)的Ⅰ型、缺少dcs區(qū)但包含mecⅠ區(qū)的Ⅰ型等7種SCCmec新型別[16]。本文研究結(jié)果顯示MRSE中混合型SCCmec占絕大多數(shù)，筆者推測(cè)可能是由于SCCmec基因變異率高，自身不斷地發(fā)生突變、插入、缺失或重組，使某些菌株不能用現(xiàn)有方法進(jìn)行分型。

本研究利用多重PCR發(fā)現(xiàn)，臨床分離的MRSE SCCmec具有明顯的多樣性，主要以混合型SCCmec為主，為進(jìn)一步了解MRSE的分子特征奠定了基礎(chǔ)。

[1]Raad I,Hanna H,Maki D.Intravascular catheter-related infections:advances in diagnosis,prevention,and management[J].Lancet Infect Dis,2007,7(10):645-657.

[2]Xiao YH,Wang J,Li Y.Bacterial resistance surveillance in China:a report from Mohnarin 2004-2005[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2008,27(8):697-708.

[3]Vitali LA,Petrelli D,Lamikanra A,et al.Diversity of antibiotic resistance genes and staphylococcal cassette chromosome mec elements in faecal isolates of coagulase-negative staphylococci from Nigeria[J].BMC Microbiol,2014,54(11):106-109.

[4]Rolo J,de Lencastre H,Miragaia M.Strategies of adaptation of Staphylococcus epidermidis to hospital and community:amplification and diversification of SCCmec[J].J Antimicrob Chemother,2012,67(6):1333-1341.

[5]Zong Z,Peng C,Lü X.Diversity of SCCmec elements in methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci clinical isolates[J].PLoS One,2011,6(5):e20191.

[6]Qi W,Ender M,O′Brien F,et al.Molecular epidemiology of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in Zurich,Switzerland(2003):prevalence of type Ⅳ SCCmec and a new SCCmec element associated with isolates from intravenous drug users[J].J Chin Microbiol,2005,43(10):5164-5170.

[7]Bispo PJ,Hofling-Lima AL,Pignatari AC.Characterization of ocular methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis isolates belonging predominantly to clonal complex 2 subcluster Ⅱ[J].J Clin Microbiol,2014,52(5):1412-1417.

[8]LebeauxD,BarbierF,AngebaultC,etal.Evolutionofnasalcarriageofmethicillin-resistantcoagulase-negativestaphylococciinaremotepopulation[J].

Antimicrob Agents Chemother,2012,56(1):315-323.

[9]楊永長(zhǎng),陳亮,肖代雯,等.SCCmec相關(guān)的psm-mec在血液來源人葡萄球菌中的分布[J].成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2014,9(3):266-270.

[10]楊永長(zhǎng),陳亮,肖代雯,等.SCCmec相關(guān)psm-mec在臨床分離表皮葡萄球菌中的分布和特征分析[J].四川醫(yī)學(xué),2015,36(4):484-487.

[11]陳亮,楊永長(zhǎng),肖代雯,等.SCCmec相關(guān)的psm-mec在血液來源人葡萄球菌中的基因定位[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2015,36(1):27-29.

[12]Wisplinghoff H,Rosato AE,Enright MC,et al.Related clones containing SCCmec type Ⅳ Predominate among clinically significant Staphylococcus epidermidis isolates[J].Antimicrob Agents Chemother,2003,47(11):3574-3579.

[13]Mombach PM,Reiter KC,Paiva RM,et al.Distribution of staphylococcal cassette chromosome mec(SCCmec)types Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ and Ⅳ in coagulase-negative staphylococci from patients attending a tertiary hospital in southern Brazil[J].J Med Microbiol,2007,56(Pt10):1328-1333.

[14]Ibrahem S,Salmenlinna S,Virolainen A,et al.Carriage of methicillin-resistant staphylococci and their SCCmec types in a long-term-care facility[J].J Clin Microbiol,2009,47(1):32-37.

[15]Shore A,Rossney AS,Keane CT,et al.Seven novel variants of staphylococcal chromosomal cassette mec in methicillin-resistant Staphlococcus aureus isolates from Ireland[J].Antimicrob Agents Chem,2005,49(5):2070-2083.

[16]歐陽(yáng)范獻(xiàn),卜平鳳,黃惠琴,等.MRSA的7種新SCCmec型別及其抗藥特性[J].微生物學(xué)報(bào),2007,47(2):201-207.

Diversity of SCCmec type diversity in clinically isolated methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis

YANGYongchang,CHENLiang,XIAODaiwen,YUHua,LIUHua,HUANGWenfang△

(DepartmentofClinicalLaboratory,SichuanProvincialAcademyofMedicalSciences/SichuanProvincialPeople′sHospital,Chengdu,Sichuan610072,China)

ObjectiveTo investigate the SCCmec types of clinically isolated methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis (MRSE).MethodsEighty-four strains of clinically isolated Staphylococcus epidermidis identified by the fully automatic microbiological identification system were collected and performed the MRSE identification by PCR for amplifying esp and mecA genes and SCCmec typing.Its distribution characteristics were analyzed.ResultsEsp gene was amplified in 84 strains and the detection rate of mecA was 76.19% (64/84),in which the MRSE detection rates in blood,sputum,urine and wound secretion were 76.8%，68.8%，100% and 71.4% respectively.The multiple PCR amplification displayed that among 64 strains of MRSE,19 strains were SCCmec simple type,in which 19 strains were SCCmec type Ⅰ and 3 strains were SCCmec type Ⅲ;42 strains were SCCmec mixed type,in which 2 strains were SCCmec mixed type Ⅰ and Ⅱ,14 strains were SCCmec mixed type Ⅰ and Ⅲ,12 strains were SCCmec mixed type Ⅰ,Ⅱ and Ⅲ,5 strains were SCCmec mixed type Ⅱ and Ⅲ,a strains were and SCCmec mixed type Ⅲ and Ⅳ.ConclusionThe SCCmec type in clinically isolated MRSE shows obvious diversity and its majority is SCCmec mixed type.

methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis;SCCmec type；MRSE；diversity

楊永長(zhǎng)，男，主管技師，主要從事臨床微生物研究?！?/p>

,E-mail：huangwf2002@21cn.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.16.026

A

1673-4130(2016)16-2273-03

2016-01-24

2016-03-29)