血小板聚集功能檢測(cè)方法及參數(shù)的探索與研究

楚杜武，任軍偉，叢玉隆

(1.北京世紀(jì)壇醫(yī)院檢驗(yàn)科　100038；2.兵器工業(yè)北京北方醫(yī)院檢驗(yàn)科,北京 100089；3.解放軍總醫(yī)院西院檢驗(yàn)科，北京 100853)

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血小板聚集功能檢測(cè)方法及參數(shù)的探索與研究

楚杜武1，任軍偉2，叢玉隆3△

(1.北京世紀(jì)壇醫(yī)院檢驗(yàn)科100038；2.兵器工業(yè)北京北方醫(yī)院檢驗(yàn)科,北京 100089；3.解放軍總醫(yī)院西院檢驗(yàn)科，北京 100853)

目的采用5種血小板聚集功能分析儀探討研究血小板聚集功能檢測(cè)的可靠方法與準(zhǔn)確參數(shù)。方法利用二磷酸腺苷(ADP)誘導(dǎo)光比濁血小板聚集儀(LTA)實(shí)驗(yàn)，流式細(xì)胞儀(FC)血小板膜糖蛋白分子PAC-1(Fg、Ca2+、GPⅡb/Ⅲa形成復(fù)合物的受體)、CD62p(P選擇素)活化百分率檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，英諾華PL-11血小板分析儀實(shí)驗(yàn)，VerifyNow抗血小板治療監(jiān)測(cè)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)(VerifyNow)與血栓彈力圖實(shí)驗(yàn)(TEG)同時(shí)檢測(cè)對(duì)照組與單服用氯吡格雷組的血小板聚集功能。結(jié)果(1)對(duì)照組與患者組ADP%，ADP激活的PAC-1、CD62p受體活化百分率，MAR%，INHI%，TEG測(cè)得ADP誘導(dǎo)的MA(mm)值6個(gè)參數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；BASE、P2Y12受體的PRU，凝血酶誘導(dǎo)的MA(mm)值3個(gè)參數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(2)ADP%與(100-INHI)%，MAR%，ADP激活的CD62p、PAC-1受體活化百分率呈正相關(guān)(r分別是0.565、0.939、0.769和0.583，P<0.05)；與TEG測(cè)得ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率值(%Agg)無(wú)相關(guān)性(r=0.127，P>0.05)。結(jié)論(1)氯吡格雷有抗血小板聚集的效果。(2)LTA操作便捷、廉價(jià)、結(jié)果穩(wěn)定，在醫(yī)院普及率高，是臨床監(jiān)測(cè)血小板聚集功能的首選方法。

血小板；流式細(xì)胞儀；血小板膜糖蛋白；二磷酸腺苷

目前，我國(guó)心血管疾病患者人數(shù)已超過(guò)2.7億，按全國(guó)人口14億計(jì)算，近5個(gè)中國(guó)人中就有1人罹患心血管疾病。氯吡格雷現(xiàn)在已經(jīng)成為心血管病患者最常用的抗血小板藥物之一，如何更有效、更準(zhǔn)確掌握個(gè)體患者的服藥效果，科學(xué)施治，就要求有更好的臨床檢驗(yàn)監(jiān)測(cè)手段。當(dāng)前，主要方法包括：光比濁法血小板聚集儀(LTA)實(shí)驗(yàn)是觀察氯吡格雷藥效的金標(biāo)準(zhǔn)[1]；流式細(xì)胞儀(FC)血小板膜糖蛋白分子檢測(cè)是一種在分子水平觀察血小板聚集功能的新方法；VerifyNow抗血小板治療監(jiān)測(cè)系統(tǒng)(VerifyNow)是近幾年在國(guó)際上逐漸推廣應(yīng)用的新型比濁法抗血小板藥物治療監(jiān)測(cè)系統(tǒng)；血栓彈力圖(TEG)最早應(yīng)用于輸血的監(jiān)測(cè)，目前經(jīng)過(guò)改良后作為凝血監(jiān)測(cè)方案已經(jīng)在全世界40多個(gè)國(guó)家使用[2]。阻抗法連續(xù)監(jiān)測(cè)血小板聚集的新型儀器包括英諾華PL-11分析儀等。這些方法各有怎樣的優(yōu)勢(shì)和缺陷？本文通過(guò)對(duì)其功能與參數(shù)的對(duì)比、探討，希望能夠得出穩(wěn)定、準(zhǔn)確的測(cè)試方法及參數(shù)，使臨床工作者選擇準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、有效、直接、快速的實(shí)驗(yàn)方法服務(wù)于患者。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑CHRONO-LOG MODEL700血小板聚集分析儀及其配套試劑(美國(guó)CHRONO-LOG公司)；BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀(FC)及其配套原裝試劑(美國(guó)BD公司)；VerifyNow抗血小板治療監(jiān)測(cè)系統(tǒng)(香港新儀儀器有限公司引進(jìn))及其配套光路質(zhì)控板，試劑質(zhì)控物，P2Y12阻斷劑檢測(cè)板，枸櫞酸鈉真空采血管；Thrombelastograph分析儀、配套高嶺土試劑瓶及一次性測(cè)試杯(美國(guó)Haemoscope公司)；PL-11血小板聚集分析儀及配套試劑(南京神州英諾華醫(yī)療科技有限公司)；Thermo IEC CL40離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)；Sysmex XE-2100血細(xì)胞分析儀及其配套試劑(日本Sysmex公司)；枸櫞酸鈉抗凝管(美國(guó)BD公司)。

1.2觀察對(duì)象及標(biāo)本采集(1)使用隨機(jī)數(shù)字法選取從2011年7～10月在解放軍總醫(yī)院健康體檢的17例健康志愿者，其中男15例，女2例，年齡最大者69歲，最小者46歲，平均59歲；使用隨機(jī)數(shù)字法選取2011年7～11月在解放軍總醫(yī)院心血管內(nèi)科就診的單獨(dú)服用氯吡格雷(75 mg/d)10 d以上的心腦血管病患者10例，年齡最大者74歲，最小者49歲，平均61歲。(2)用5支3.8%枸櫞酸鈉抗凝和1支肝素抗凝真空采血管采集靜脈血：5支3 mL，1支2 mL。其中1支3 mL枸櫞酸鈉抗凝血樣在離心前先取出混勻全血5 μL用于FC血小板膜糖蛋白PAC-1、CD62p受體檢測(cè)，然后進(jìn)行英諾華PL-11血小板分析儀實(shí)驗(yàn)；2支3 mL血樣進(jìn)行LTA實(shí)驗(yàn)；1支2 mL血樣進(jìn)行VerifyNow實(shí)驗(yàn)；1支3 mL枸櫞酸鈉抗凝和1支3 mL肝素抗凝血樣進(jìn)行TEG實(shí)驗(yàn)。

1.3方法(1)二磷酸腺苷(ADP)激活FC血小板膜糖蛋白PAC-1、CD62p受體活化百分率檢測(cè)：在室溫24～28 ℃[3]，熒光素標(biāo)記的抗血小板單克隆免疫熒光染色，在陰性對(duì)照管中加鼠IgG1-FITC、CD61-PE各20 μL，測(cè)定管中加入CD62P-FITC、PAC-1-FITC各20 μL，再分別加入5 μL全血。置室溫避光反應(yīng)15 min，立即加入110 mL1%多聚甲醛(2～6 ℃)混勻，2～8 ℃陰暗處放置30 min，立即上機(jī)獲取數(shù)據(jù)，檢測(cè)血小板膜糖蛋白PAC-1、CD62p受體活化百分?jǐn)?shù)。(2)加入10 μmol/L ADP誘導(dǎo)劑進(jìn)行LTA實(shí)驗(yàn)，用血細(xì)胞分析儀測(cè)定富血小板血漿(PRP)的血小板濃度，用貧血小板血漿(PPP)調(diào)整PRP血小板濃度為(200～300)×109/L[3]，檢測(cè)ADP誘導(dǎo)血小板聚集率。(3)VerifyNow實(shí)驗(yàn)：先做光路質(zhì)控，然后取2 mL的Verifynow專(zhuān)用枸櫞酸鈉抗凝真空采血管標(biāo)本，于24～28 ℃穩(wěn)定10 min[3]，上下顛倒混勻10次，倒插入分析儀中，3 min后打印結(jié)果。(4)TEG實(shí)驗(yàn)：運(yùn)行ADP血小板圖檢測(cè)需采用3個(gè)通道，嚴(yán)格按照儀器說(shuō)明書(shū)操作。第1個(gè)通道：枸櫞酸化高嶺土激活全血測(cè)試；第2個(gè)通道：A激活劑激活的樣品測(cè)試；第3個(gè)通道：ADP激活樣品測(cè)試，合成3個(gè)測(cè)試圖得出血小板的氯吡格雷(ADP受體抑制藥物)抑制率。(5)英諾華PL-11實(shí)驗(yàn)：將標(biāo)本置于儀器的待測(cè)試位置，按“檢測(cè)”鍵，直至儀器提示“加入誘聚劑”，用移液器抽取40 μL的誘聚劑加入標(biāo)本中即可，等待測(cè)試完畢，打印結(jié)果。

1.4觀察指標(biāo)ADP誘導(dǎo)LTA測(cè)得血小板聚集率(ADP%)；FC測(cè)得ADP激活血小板膜糖蛋白PAC-1和CD62p受體活化百分率；VerifyNow測(cè)得血小板聚集基線(BASE)、P2Y12受體的Reaction Units值(PRU)，血小板聚集抑制百分?jǐn)?shù)(INHI%)；TEG測(cè)得ADP誘導(dǎo)最大幅度(MA)(mm)值，凝血酶誘導(dǎo)MA(mm)值；英諾華PL-11測(cè)得最大聚集率(MAR%)。

2　結(jié)　　果

2.1對(duì)照組與患者組觀察指標(biāo)對(duì)比兩組檢測(cè)的ADP%，ADP激活的PAC-1、CD62p受體活化百分率， BASE、P2Y12受體的PRU，INHI%，TEG測(cè)得ADP誘導(dǎo)的MA(mm)值，凝血酶誘導(dǎo)的MA(mm)值，MAR%結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　　各儀器測(cè)得對(duì)照組與單服氯吡格雷組參數(shù)對(duì)比

2.2LTA、FC、VerifyNow、TEG、PL-11測(cè)得所有觀察對(duì)象相關(guān)性本實(shí)驗(yàn)觀察對(duì)象的ADP%，ADP激活的PAC-1、CD62p受體活化百分率，INHI%，TEG測(cè)得ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率值(TEGADP%)，MAR%統(tǒng)計(jì)學(xué)雙變量相關(guān)性參數(shù)見(jiàn)表2。

表2　　LTA、FC、VerifyNow、TEG、PL-11測(cè)得所有觀察對(duì)象相關(guān)性

注：*P>0.05，表示相關(guān)性差，且單變量方差分析斜率差異性檢驗(yàn)P<0.05，即直線斜率、截距有差異；其他參數(shù)P<0.05，相關(guān)性良好，且單變量方差分析斜率差異性檢驗(yàn)P>0.05，即直線斜率、截距無(wú)差異。

3　討　　論

血小板活化后，顆粒膜蛋白CD62p、PAC-1活性顯著性改變[4]。PAC-1與血小板表面的GPⅡb/Ⅲa和纖維蛋白原(Fg)結(jié)合[5]，在Ca2+的協(xié)助下發(fā)生血小板聚集[2]。所以，檢測(cè)血小板聚集功能對(duì)于早期血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，闡明疾病的病理機(jī)制及臨床治療方案的選擇有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)中，5個(gè)儀器測(cè)得的健康對(duì)照組與單服氯吡格雷組參數(shù)對(duì)比，發(fā)現(xiàn)VerifyNow測(cè)得的PRU、BASE與TEG測(cè)得的MA(凝血酶)(mm)3個(gè)參數(shù)之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？赡茉颍築ASE是凝血酶通路的血小板聚集率，MA(凝血酶)(mm)也是凝血酶激活的血小板聚集幅度值，這兩個(gè)參數(shù)無(wú)差異。這說(shuō)明本次實(shí)驗(yàn)健康對(duì)照組與患者組在凝血酶引起的凝血功能方面差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但并不能下結(jié)論：凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集功能無(wú)差別。原因有二：(1)凝血酶是人體凝血系統(tǒng)最主要的節(jié)點(diǎn)，它不僅與血小板功能相關(guān)性強(qiáng)，與凝血因子的功能相關(guān)性也很強(qiáng)。此結(jié)果的產(chǎn)生很可能是兩者共同合力的作用，本研究并未分析凝血因子方面的狀況。(2)本實(shí)驗(yàn)中，觀察例數(shù)還不足，普遍性有待進(jìn)一步的研究。其他ADP%、ADP激活的PAC-1、CD62p受體活化百分率，INHI%，TEG測(cè)得ADP誘導(dǎo)的MA(mm)值6個(gè)參數(shù)有差異，證明氯吡格雷有一定的抗血小板聚集功能，但是抑制強(qiáng)度不強(qiáng)?？赡苁瞧渌幮П容^溫和，或者是與遺傳變異性、患者依從性差、氯吡格雷劑量不足以及CYP3A4相關(guān)的藥物間相互作用等因素有關(guān)[8]。從表2的結(jié)果可以看出其中相關(guān)性最好的是ADP%和MAR%。同時(shí)，ADP%與其他參數(shù)(TEG測(cè)得的%Agg除外)相關(guān)性都較好，說(shuō)明了LTA是檢查血小板聚集功能的良好方法。而其他儀器參數(shù)之間相關(guān)性一般，說(shuō)明 VerifyNow、FC兩種方法與LTA比較起來(lái)，優(yōu)點(diǎn)并不明顯。TEG結(jié)果和其他4種儀器的分析結(jié)果基本無(wú)相關(guān)性，原因有：(1)本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)例數(shù)較少，偶然性較大；(2)此方法學(xué)存在缺憾。具體原因需要同行們進(jìn)行更深入的研究。

綜上所述，PL-11有一定的準(zhǔn)確性與可靠性，可供臨床選擇；FC特異性好、靈敏度高，但費(fèi)用昂貴，對(duì)操作技能要求高，可作為常規(guī)結(jié)果的輔助性確認(rèn)；VerifyNow操作簡(jiǎn)便，適用于急診、床邊檢驗(yàn)(POCT)；TEG展示凝血全過(guò)程，其中可發(fā)現(xiàn)各環(huán)節(jié)的缺陷與異常，適于凝血系統(tǒng)異常的觀察判斷。LTA操作便捷、廉價(jià)、結(jié)果穩(wěn)定，在醫(yī)院普及率高，是臨床監(jiān)測(cè)血小板聚集功能的首選方法。

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Investigation of detection methods for aggregation function of platelets

CHUDuwu1,RENJunwei2,CONGYulong3△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,BeijingShijitanHospital,Beijing100038,China;2.DepartmentofClinicalLaboratory,BeijingNorthHospitalofChinaNorthIndustriesGroupCorporation(CNGC),Beijing100089,China;3.DepartmentofClinicalLaboratory,WestBranchHospital,GeneralHospitalofPLA,Beijing100853,China)

ObjectiveTo adopt 5 kinds of platelets aggregation function analyzer to explore and study the reliable method for detecting the platelets aggregation function and accurate parameters.MethodsThe platelets aggregation function in the control group and the single clopidogrel group was simultaneously detected by utilizing the ADP induced light turbidimetric platelet aggregation analyzer (LTA) test,flow cytometry for PAC-1(receptor of Fg,Ca2+,GPⅡb/Ⅲa forming complex) and CD62p(P selectin) activation percentage detection test,Innova PL-11 for platelets analysis test,VerifyNow anti-platelet therapy monitoring system and thrombelastogram(TEG).Results(1)The 6-parameter differences of ADP%,PAC-1 and CD62p receptor activation percentage activated by ADP，MAR%，INHI%， ADP induced MA value(mm) detected by TEG had statistical differences between the control group and the case group(P<0.05);PRU of BASE and P2Y12 receptor,thrombin induced MA value (mm) had no statistical differences between these two groups(P>0.05).(2)ADP% was positively correlated with (100-INHI)%,MAR%,ADP activated CD62p and PAC-1 receptor activation percentage(r=0.565,0.939,0.769,0.583，P<0.05 );while which had no correlation with ADP induced platelets aggregation value(%Agg) detected by TEG(r=0.794,0.715,0.889).Conclusion(1)Clopidogre has the anti-platelets effect.(2)LTA is easily operating,cheap and stable in detection results,has high popularizing rate in hospitals and is the first option method for clinically monitoring the platelets aggregation function.

platelet;flow cytometry;PAC-1;CD62p;ADP

楚杜武,男,主管技師,主要從事醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)工作?！?/p>

，E-mail：yulongc@263.net。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.16.025

A

1673-4130(2016)16-2270-03

2016-02-28

2016-06-27)