外陰、陰道和宮頸尖銳濕疣組織中HPV感染的對比研究*

單慧敏，施啟豐，耿建祥△，仲玉英，梅　靜，龍秀榮，夏　林，王宏景，趙　雪

(1．江蘇省大豐市人民醫(yī)院病理科　224100；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院病理科/江蘇省HPV協(xié)作組，南京 210001)

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外陰、陰道和宮頸尖銳濕疣組織中HPV感染的對比研究*

單慧敏1，施啟豐2，耿建祥2△，仲玉英2，梅靜2，龍秀榮2，夏林2，王宏景2，趙雪2

(1．江蘇省大豐市人民醫(yī)院病理科224100；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院病理科/江蘇省HPV協(xié)作組，南京 210001)

目的研討外陰、陰道和宮頸尖銳濕疣(CA)組織中人乳頭瘤病毒(HPV)感染型別的分布狀況以及臨床意義。方法應(yīng)用基因芯片結(jié)合PCR技術(shù)對63例外陰尖銳濕疣、61例陰道尖銳濕疣和65例宮頸尖銳濕疣組織行23種HPV基因型檢測，并分析患者的臨床病理資料。結(jié)果63例外陰尖銳濕疣組織中檢出HPV陽性者56例，HPV感染率為88.89%(56/63)；61例陰道尖銳濕疣組織中檢出HPV陽性者55例，HPV感染率為90.16%(55/61)；65例宮頸尖銳濕疣組織中檢出HPV陽性者62例，HPV感染率為95.39%(62/65)。結(jié)論HPV感染與外陰、陰道和宮頸尖銳濕疣的發(fā)病密切相關(guān),HPV6和11是主流型別，以外陰尖銳濕疣最為常見?；蛐酒Y(jié)合PCR技術(shù)是適合應(yīng)用于臨床行HPV分型診斷的一種方法，具有敏感性好、特異性高的特點。對女性外陰、陰道和宮頸尖銳濕疣的臨床診斷、治療及其疫苗的研究具有重要的意義。

尖銳濕疣；人乳頭瘤病毒；基因分型；外陰；陰道；子宮頸

人乳頭瘤病毒(HPV)感染在外陰病變中所起的作用與在陰道和宮頸的病變很相似。在外陰部，這些病變包括濕疣性病變[尖銳濕疣(CA)和扁平濕疣]、外陰上皮內(nèi)腫瘤形成(VIN)、浸潤性鱗狀細(xì)胞癌(包括尿道鱗狀細(xì)胞癌)和疣狀癌等。臨床上，鑒于上述疾病的自然病程和治療方法的明顯不同，區(qū)分這些病變是非常重要的。對于這些疾病的診斷一定要行活組織病理檢查，以明確其病理診斷，有利于臨床婦產(chǎn)科醫(yī)師對這類疾病的治療及預(yù)后的判斷。CA多發(fā)生于皮膚皺褶處，呈良性瘤樣增生性病變。發(fā)生于肛門、外生殖器部位的，又稱肛門生殖器疣(AGW)。在女性，外陰多灶發(fā)生，或在外陰、肛周或外陰、陰道、宮頸聯(lián)合發(fā)生[1-3]。

1　材料與方法

1.1一般資料收集2011年1～12月在南京市中醫(yī)院行宮頸活組織病理檢查的20例病理診斷為輕度急、慢炎且鱗狀上皮基本正常的宮頸石蠟包埋組織作為對照組，患者年齡24～65歲，平均37.05歲。收集1991年8月至2015年8月在南京市中醫(yī)院婦產(chǎn)科手術(shù)的女性CA的石蠟組織標(biāo)本，其中63例為外陰CA，患者年齡17～60歲、平均29.87歲；61例為陰道CA，患者年齡19～60歲、平均30.28歲；65例為宮頸CA，患者年齡19～71歲、平均29.34歲。病理切片均由2位高年資主治以上醫(yī)師按照WHO婦科腫瘤的組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行復(fù)閱。

1.2儀器與試劑基因擴(kuò)增儀為新加坡生產(chǎn)的Gene Amp PCR system 2400型；分子雜交儀為江蘇省興化市分析儀器廠生產(chǎn)的FYY-3型；高速冷凍離心機(jī)為德國生產(chǎn)的Eppendorf 5810 R型；生物安全柜為江蘇省蘇州市安泰空氣技術(shù)有限公司生產(chǎn)的BHC-1300ⅡA2型；青島海爾有限公司生產(chǎn)的-20 ℃冰箱等。HPV基因分型檢測試劑盒,由亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司提供。顯色液須即用即配，根據(jù)需要的濃度用蒸餾水調(diào)配。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本的采集所有外陰、陰道和宮頸石蠟組織標(biāo)本：先去除每例石蠟組織周邊多余的石蠟，將其石蠟組織切成4 μm厚的切片，切3～5片石蠟組織即可。用專用的鑷子輕輕夾取，放入小離心管中，切第2例石蠟組織前用次氯酸鈉溶液擦刀片及鑷子各3次。

1.3.2DNA的提取將切下的石蠟組織片放入1.5 mL離心管中，加入裂解液150 μL，充分振蕩混勻，然后在金屬浴中加熱100 ℃ 10 min，立即13 000 r/min離心10 min后，取中間層DNA溶液待用。PCR擴(kuò)增、雜交、孵育和顯色按說明書進(jìn)行規(guī)范操作。每份標(biāo)本顯色后根據(jù)雜交信號的有無來判斷結(jié)果。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理宮頸正常組織、外陰CA、陰道CA及宮頸CA組織中HPV感染率及各HPV型別的比例采用HPV分型統(tǒng)計軟件(由南京倍寧醫(yī)療器械有限公司提供)進(jìn)行分析，對分析出來的相關(guān)數(shù)據(jù)應(yīng)用統(tǒng)計軟件包SPSS13.0對相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，百分率的比較采用χ2檢驗或確切概率法，顯著性檢驗水準(zhǔn)為α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)　　果

宮頸正常組織與外陰、陰道和宮頸CA組織的HPV陽性例數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=44.89、46.42、59.94，P<0.01),而外陰、陰道和宮頸CA之間HPV陽性例數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.05、1.87、1.29，P>0.05)。

2.1宮頸正常石蠟組織標(biāo)本HPV檢測結(jié)果從20例宮頸正常石蠟組織標(biāo)本中檢測出HPV陽性2例，均為一重感染(均為HPV6型)。

2.2外陰CA組織HPV檢測結(jié)果63例外陰CA患者中陽性56例，總的HPV感染率為88.89%(56/63)。其中一重HPV感染35例，占總HPV感染率的55.56%(35/63)；一重HPV感染中HPV11型18例,其陽性檢出率為28.57%(18/63)，HPV11型是最主要的感染型別，HPV6型14例,其陽性檢出率為22.22%(14/63)。多重HPV感染21例,其中二重感染13例、三重感染7例、四重感染1例、六重感染2例，其HPV感染率為33.33%(21/63)；多重HPV感染中HPV6+16型、HPV6+52型和HPV11+31型各2例,分別占多重感染的3.17%(2/63),是多重感染的主要型別。63例外陰CA患者HPV陽性檢出不同型別數(shù)合計92次，其中低危型出現(xiàn)61次，高危型出現(xiàn)31次。見表1。

2.3陰道CA組織HPV檢測結(jié)果61例陰道CA患者中陽性55例，總的HPV感染率為90.16%(55/61)。其中一重HPV感染35例，占總HPV感染率的57.38%(35/61)，一重HPV感染中HPV11型20例,其陽性檢出率為32.79%(20/61)，HPV11型是最主要的感染型別，其次是HPV6型13例,其陽性檢出率為21.31%(13/61)。多重HPV感染20例,其中二重感染14例、三重感染3例、四重感染2例、五重感染1例，其HPV感染率為32.79%(20/61)；多重HPV感染中HPV6+11型4例,占多重感染的6.56%(4/61),是多重感染的主要型別，其次是HPV11+52型3例，占多重感染的4.92%(3/61)。61例陰道CA患者HPV陽性檢出不同型別數(shù)合計85次，其中低危型出現(xiàn)62次，高危型出現(xiàn)23次。見表1。

2.4宮頸CA組織HPV檢測結(jié)果65例宮頸CA患者中陽性62例，總的HPV感染率為95.39%(62/65)。其中一重HPV感染46例，占總HPV感染率的70.77%(46/65)，一重HPV感染中HPV11型29例,其陽性檢出率為44.62%(29/65)，HPV11型是最主要的感染型別，其次是HPV6型14例,其陽性檢出率為21.54%(14/65)。多重HPV感染16例,其中二重感染13例、三重感染3例，其HPV感染率為24.62%(16/65)；多重HPV感染中，HPV6+11型4例,占多重感染的6.15%(4/65),是多重感染的主要型別，HPV11+18型2例，占多重感染的3.08%(2/65)，是多重感染的其次型別。65例宮頸CA患者HPV陽性檢出不同型別數(shù)合計81次，其中低危型出現(xiàn)65次，高危型出現(xiàn)16次。見表1。

表1　　外陰、陰道及宮頸CA HPV感染者不同型別感染頻率及百分率的比較[n(%)]

注：對多重感染者，各型別的陽性率重復(fù)計算。

3　討　　論

HPV是外陰、陰道和宮頸CA形成的必要因素，部分HPV型別可導(dǎo)致這些部位CA的瘤變和癌變[1，3-4],現(xiàn)已引起病理科和婦產(chǎn)科醫(yī)師的高度重視，尤其是含有高危型或伴有高危型HPV感染的CA。因此，對外陰、陰道和宮頸CA組織行HPV分型檢測意義重大。

濕疣是由HPV感染引起的性傳播性疾病，通常是低危型，以6和11型為主，伴有少量的高危型[1，5-6]。CA是了解比較清楚的一型濕疣，大體特征為一個或多個隆起而質(zhì)軟的、大小不一的腫塊。挖空細(xì)胞是診斷CA的重要依據(jù)，但不能作為唯一的依據(jù)，因為挖空細(xì)胞并非隨時可表達(dá)，在病變的早期，挖空細(xì)胞尚未形成，而在病變的晚期，挖空細(xì)胞可能消退[1，3，6]。因此，現(xiàn)階段，女性生殖器CA的診斷采用的是臨床病史、病理組織學(xué)加HPV分型檢測三結(jié)合的診斷法。

本研究提示：(1)20例正常宮頸組織中HPV陽性者2例。63例外陰CA患者中陽性者56例。61例陰道CA患者中陽性者55例。65例宮頸CA患者中陽性者62例。宮頸正常組織與外陰、陰道和宮頸CA組織的HPV陽性人數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),而外陰、陰道和宮頸CA之間HPV陽性人數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。(2)63例外陰CA組織中一重(35例)和多重(21例)感染之比為1.67∶1；61例陰道CA組織中一重(35例)和多重(20例)感染之比為1.75∶1；65例宮頸CA組織中一重(46例)和多重(16例)感染之比為2.88∶1。三者比較從外陰CA，到陰道CA，再到宮頸CA，其組織中一重HPV感染數(shù)與多重HPV感染數(shù)之比，呈現(xiàn)出逐步升高的趨勢，這種現(xiàn)象是患者機(jī)體不同部位內(nèi)外環(huán)境造成的，還是原本就是這種感染狀況，還有待于大樣本的研究。(3)從外陰、陰道和宮頸CA組織HPV感染分類來看，56例外陰CA HPV感染者中，低危型36例，低高危型18例，高危2例；55例陰道CA HPV感染者中，低危型40例，低高危型14例，高危型1例；62例宮頸CA HPV感染者中，低危型48例，低高危型10例，高危型4例。三組比較HPV感染都表現(xiàn)出從低危型到低高危型及高危型依次降低的現(xiàn)象，提示外陰、陰道和宮頸CA都是以低危型為主，低高危型和高危型為輔的感染模式。(4)從外陰、陰道和宮頸CA組織的高、低危型HPV感染出現(xiàn)率來看，56例外陰CA HPV感染者中，低危型出現(xiàn)61次，高危型出現(xiàn)31次，低高型感染之比為1.97∶1；55例陰道CA HPV感染者中，低危型出現(xiàn)62次，高危型出現(xiàn)23次，低高型感染之比為2.70∶1；62例宮頸CA HPV感染者中，低危型出現(xiàn)65次，高危型出現(xiàn)16次，低高型感染之比為4.06∶1。三組HPV感染頻率比較都表現(xiàn)出低危型出現(xiàn)頻率遠(yuǎn)多于高危型出現(xiàn)頻率的狀況，外陰、陰道和宮頸CA組織HPV感染，從女性生殖道由外向內(nèi)，其病變的低高危型感染率之比隨之增加，這是一種HPV感染的常態(tài)，還是女性生殖道內(nèi)環(huán)境的使然，值得進(jìn)行深入的研究。(5)2006年6月始，西方國家率先使用了以預(yù)防為目的的HPV疫苗來預(yù)防宮頸癌瘤[1，7-9]，如使用這種預(yù)防性疫苗(HPV 6、11、16、18型預(yù)防性四價疫苗)可起保護(hù)作用。本文外陰CA 62.50%(35/56)的患者(單一型感染者32例，多型感染者3例)、陰道CA 72.73%(40/55)的患者(單一型感染者33例，多型感染者7例)、宮頸CA 85.48%(53/62)的患者(單一型感染者44例，多型感染者9例)的女性可免遭這4型低高危HPV感染而誘發(fā)生殖道的CA，過半的女性生殖道CA患者可從中獲益。(6)外陰、陰道和宮頸均可發(fā)生鱗狀上皮內(nèi)病變。鱗狀上皮內(nèi)病變可單獨發(fā)生，也可在CA病變中發(fā)生。CA合并外陰、陰道和宮頸上皮內(nèi)病變(VIN、VaIN和CIN)，尤其合并CINⅠ級和CINⅠ-Ⅱ級更為常見?，F(xiàn)已證實，外陰、陰道和宮頸的鱗狀上皮癌的發(fā)生與16和18型HPV感染最為密切[1，10-12]。因此，對患有外陰、陰道和宮頸CA的患者，婦產(chǎn)科醫(yī)師一定要給患者行CA病變的活組織檢查，一可明確診斷，二可及時發(fā)現(xiàn)有無伴有癌瘤情況，同時也要行CA組織HPV分型檢測，對HPV16型和HPV18型的患者即使活組織檢查正常，也要給予定期隨訪。

總之，女性生殖道CA是一類性傳播性疾病，致病因子是HPV，降低其發(fā)病率要做到預(yù)防和治療相結(jié)合[13-16]。預(yù)防女性生殖道CA的最好辦法是盡早發(fā)現(xiàn)和治療患者及其性伴侶，對高發(fā)病年齡段的群體進(jìn)行衛(wèi)生宣傳和教育，并管控不良性行為，提倡廣泛使用陰莖套以及男性和女性接種四價HPV(6、11、16、18型)預(yù)防性疫苗。這樣多管齊下，防治并舉，可最大限度地降低女性生殖道CA的發(fā)生率、瘤變率和癌變率，可造福于廣大女性患者。

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A comparative study of HPV infection in condyloma acuminate tissues of vulva,vagina and cervix*

SHANHuimin1,SHIQifeng2,GENGJianxiang2△,ZHONGYuying2,MEIJing2，LONGXiurong2,XIALin2,WANGHongjing2,ZHAOXue2

(1.DepartmentofPathology,DafengMunicipalPeople′sHospital,Dafeng,Jiangsu224100，China;2.DepartmentofPathology,ThirdAffiliatedHospital,NanjingTraditionalChineseMedicalUniversity,Nanjing,Jiangsu210001,China)

ObjectiveTo study the distribution status and clinical significance of human papillomavirus(HPV) infection genotypes in condyloma acuminate(CA) tissues of vulva,vagina and cervix.MethodsThe gene-chips combined with polymerase chain reaction (PCR) technology were utilized for detecting 23 kinds of HPV genotypes in tissue specimens from 63 cases of vulval CA,61 cases of vaginal CA and 65 cases of cervical CA.Their clinical pathological data were analyzed.ResultsIn 63 cases of vulval CA,56 cases were HPV positive with the HPV infection rate of 88.89%(56/63),in 61 cases of vaginal CA,55 cases were HPV positive with the HPV infection rate of 90.16%(55/61),and in 65 cases of cervical CA,62 cases were HPV positive with the HPV infection rate of 95.39%(62/65).ConclusionHPV infection is closely related to the CA pathgenesis in vulva,vagina and cervix.HPV6 and HPV 11 are main stream genotypes,in which vulval CA is most common.The gene-chips combined with PCR technology is a method suitable for HPV typing diagnosis,and has the characteristics of good sensitivity and high specificity,which has an important significance for clinical diagnosis,treatment and vaccine study of CA in femal vulva,vagina and cervix.

condyloma acuminata；human papillomavirus；genotyping;vulva；vagina；cervix

江蘇省南京市衛(wèi)生局中醫(yī)專項資助項目(2009-92)。

單慧敏，女，副主任醫(yī)師，主要從事HPV感染相關(guān)性疾病的研究。△

,E-mail：dyc720@163.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.16.013

A

1673-4130(2016)16-2239-03

2016-03-25

2016-06-22)