葡萄糖激酶基因3個(gè)標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)與2型糖尿病的相關(guān)性研究*

張秀明,孫各琴,羅楚君,李晶晶,韓　慧,陳　瓊

(1.廣東省深圳市羅湖醫(yī)院集團(tuán)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心　518000;2.中山大學(xué)附屬中山醫(yī)院，廣東中山 528403)

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葡萄糖激酶基因3個(gè)標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)與2型糖尿病的相關(guān)性研究*

張秀明1,孫各琴2,羅楚君2,李晶晶2,韓慧2,陳瓊2

(1.廣東省深圳市羅湖醫(yī)院集團(tuán)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心518000;2.中山大學(xué)附屬中山醫(yī)院，廣東中山 528403)

目的探討葡萄糖激酶(GCK)基因3個(gè)標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性(tagSNPs)位點(diǎn)rs2971672、rs2268573、rs2300587與2型糖尿病的關(guān)系。方法選取2013年8月至2014年12月在中山大學(xué)附屬中山醫(yī)院住院的中國(guó)南方漢族2型糖尿病患者499例(2型糖尿病組)，同時(shí)選擇同期在該院康體保健中心體檢的漢族健康人499例作為對(duì)照組，對(duì)GCK基因的3個(gè)tagSNPs位點(diǎn)采用改良多重高溫連接酶檢測(cè)反應(yīng)技術(shù)(iMLDR)進(jìn)行基因分型，應(yīng)用Hardy-Weinberg平衡規(guī)律檢測(cè)標(biāo)本代表性，采用χ2檢驗(yàn)、Logistic回歸分析比較2型糖尿病組和對(duì)照組基因型和等位基因頻率的差異，并在加性、顯性和隱性3種遺傳模型下對(duì)各SNP位點(diǎn)進(jìn)行相關(guān)性分析。應(yīng)用Haploview軟件構(gòu)建GCK基因3個(gè)tagSNPs位點(diǎn)的單體型，分析是否存在連鎖不平衡(LD)及不同的GCK單體型與2型糖尿病易感性的關(guān)系。結(jié)果rs2268573、rs2300587的基因型(χ2=3.361、2.076，均P>0.05)和等位基因頻率(χ2=0.222、1.980，均P>0.05)在2型糖尿病組和對(duì)照組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。rs2971672的基因型(χ2=6.896，P<0.01)和等位基因分布(χ2=4.708，P<0.05)在2型糖尿病組和對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在顯性遺傳模式下以及在加性遺傳模式下，rs2971672的基因型分布在2型糖尿病組和對(duì)照組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(顯性遺傳模式下OR=1.74，95%CI：1.17～2.57，P<0.01；加性遺傳模式下OR=1.51，95%CI：1.06～2.14，P<0.05)。GCK基因3個(gè)位點(diǎn)中的rs2971672和rs2300587有一個(gè)LD域，其中TC、TA、CA3種主要單體型，單體型TA和CA均降低個(gè)體患2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)，OR值分別為0.81(95%CI:0.66～1.00，P<0.05)和0.78(95%CI:0.62～0.98，P<0.05)。結(jié)論在漢族人群中，GCK基因區(qū)域的rs2971672位點(diǎn)與糖尿病遺傳易感性密切相關(guān)，而rs2268573、rs2300587位點(diǎn)與糖尿病遺傳易感性無(wú)明確相關(guān)性。rs2971672和rs2300587的LD域單體型TA和CA均降低個(gè)體患2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)。

2型糖尿病；基因；葡萄糖激酶；多態(tài)性，單核苷酸

糖尿病是一組由胰島素分泌不足或新陳代謝紊亂所導(dǎo)致的高血糖病。據(jù)估計(jì)，2013年在中國(guó)就有9 800萬(wàn)糖尿病患者，居世界首位[1]。遺傳因素在糖尿病的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)是一種通過(guò)對(duì)大規(guī)模人群進(jìn)行測(cè)試、統(tǒng)計(jì)，從而發(fā)現(xiàn)與疾病表型或相關(guān)性狀關(guān)聯(lián)的遺傳位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)研究[2]，一般以單核苷酸多態(tài)性(SNPs)作為標(biāo)記物[3]。近年來(lái)，GWAS候選基因方法已被廣泛用于解釋糖尿病的遺傳基礎(chǔ)[4]，并發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與糖尿病相關(guān)的基因[5]。但是，糖尿病相關(guān)的基因數(shù)目和特性、潛在的遺傳模型以及與環(huán)境因素的相互作用還不清楚[6]。葡萄糖激酶(GCK)是糖酵解的關(guān)鍵酶，也是通過(guò)β細(xì)胞維持葡萄糖自身穩(wěn)定的傳感器[7]。GCK基因位于7號(hào)染色體(7p15.3-p15.1)上，由12個(gè)外顯子組成，編碼由465個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)[8]。通過(guò)對(duì)GCK基因的標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性(tagSNPs)網(wǎng)上系統(tǒng)分析和文獻(xiàn)查閱，與糖尿病相關(guān)的GCK基因3個(gè)tagSNPs位點(diǎn)rs2971672、rs2268573、rs2300587引起了筆者的關(guān)注。因此，本研究對(duì)GCK基因上的這3個(gè)位點(diǎn)與中國(guó)漢族人2型糖尿病易感性的關(guān)系進(jìn)行探討。

1　資料與方法

1.1一般資料選取2013年8月至2014年12月在中山大學(xué)附屬中山醫(yī)院診治的2型糖尿病患者499例(2型糖尿病組)，均符合1999年WHO糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]，其中男257例、女242例，年齡28～93歲、平均58.6歲。另取同期體檢健康者499例作為對(duì)照組，其中男290例、女209例，年齡27～86歲、平均55.7歲。本研究已通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核，患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2儀器與試劑DU800核酸檢測(cè)儀、5415D高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendof公司)，DYY-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京六一儀器廠)，UVP凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)UVP公司)，血液基因組提取試劑盒(Gentra Puregene Blood Kit，美國(guó)Qiagen公司)。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集入選者知情同意后簽字，分別抽取靜脈血5 mL，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，室溫放置15 min，2 000 r/min離心10 min，吸取上層血漿，有核細(xì)胞層經(jīng)紅細(xì)胞裂解液處理后，置-70 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2基因組DNA提取采用Gentra Puregene Blood Kit基因組提取試劑盒，提取標(biāo)本外周血白細(xì)胞基因組DNA，DNA 標(biāo)本經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)其進(jìn)行完整度檢查，核酸檢測(cè)儀測(cè)定濃度，并將標(biāo)本DNA稀釋到工作濃度(5～10 ng/L)。

1.3.3基因檢測(cè)SNP位點(diǎn)的檢測(cè)使用改良多重高溫連接酶檢測(cè)反應(yīng)技術(shù)(iMLDR)，所需PCR擴(kuò)增引物和多重單堿基延伸反應(yīng)延伸引物(表1)均由上海天昊生物科技有限公司設(shè)計(jì)，上海生工生物科技有限公司合成，按要求稀釋到指定濃度。由于待測(cè)的SNP附近有其他高頻的SNP，設(shè)計(jì)連接引物時(shí)因?yàn)楸仨毦o挨目的位點(diǎn)，所以必定要覆蓋到這些附近的SNP，因此在設(shè)計(jì)連接引物時(shí)兩種堿基都合成，這樣才不會(huì)因?yàn)橹辉O(shè)計(jì)其中一種而另一種多態(tài)的染色體因?yàn)楹鸵锎嬖阱e(cuò)配而效率低甚至不出現(xiàn)堿基峰從而導(dǎo)致基因型判讀錯(cuò)誤。分型實(shí)驗(yàn)委托上海天昊生物科技有限公司進(jìn)行。反應(yīng)體系(10 μL)包含：1×GCI buffer，3.0 mmol/L Mg2+，0.3 mmol/L dNTP，1 U HotStar Taq polymerase，1 μL標(biāo)本DNA 和1 μL多重PCR引物。PCR循環(huán)程序：95 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s、65 ℃和-0.5 ℃/cycle 40 s、72 ℃ 90 s，共11 個(gè)循環(huán)；94 ℃ 20 s、59 ℃ 30 s、72 ℃ 90 s，24個(gè)循環(huán)；4 ℃ 60 min；在PCR產(chǎn)物中加入試劑盒中的ExoⅠ/SAP酶1 μL，37 ℃溫浴1 h，然后75 ℃滅活15 min；取10×連接緩沖液2 μL、高溫連接酶0.2 μL、連接引物混合液1 μL與純化后多重PCR產(chǎn)物3 μL、ddH2O 3.8 μL，混勻。連接程序：94 ℃ 1 min、56 ℃ 4 min，38個(gè)循環(huán)；4 ℃ 60 min；取0.5 μL稀釋后的連接產(chǎn)物，與0.5 μL Liz500 SIZE STANDARD、9 μL HiDi 混勻，95 ℃變性5 min后上ABI 3130 XL 測(cè)序儀；收集的原始數(shù)據(jù)用 Gene Mapper 4.1(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)分析并輸出結(jié)果。

表1　　擴(kuò)增SNPs 的引物序列

1.3.4相關(guān)定義如果雙親的性狀同時(shí)在F1個(gè)體上表現(xiàn)出來(lái)，這種顯性表現(xiàn)稱為共顯性，或叫并顯性。顯性就是表現(xiàn)出來(lái)的特征，隱性是沒(méi)有表現(xiàn)出來(lái)但是自身攜帶。比如rs2235321(G>A)，G為野生型、A為突變型。共顯性模型假設(shè)等位基因G和A均顯性表達(dá)，致病基因型為GA、AA型；顯性模型假定突變型A為顯性致病基因，致病基因型為GA、AA型；隱性模型假定突變型A為隱性致病基因，致病基因型為AA型；超顯性模型假定純合子不發(fā)病而雜合子發(fā)病，致病基因型為GA型。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理運(yùn)用Hardy-Weinberg平衡規(guī)律檢測(cè)標(biāo)本代表性；SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理基因型和等位基因頻率結(jié)果，計(jì)數(shù)資料各百分率比較用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；運(yùn)用Haploview軟件進(jìn)行GCK的3個(gè)位點(diǎn)tagSNPs單體型的構(gòu)建；http://bioinfo.iconcologia.net/snpstats/start.htm在線分析LD，分析是否存在LD及不同的GCK 單體型與2型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。

2　結(jié)　　果

2.1候選SNPs基因型與等位基因頻率采用iMLDR多重SNP分型試劑盒對(duì)998份標(biāo)本的3個(gè)SNP 進(jìn)行分型。經(jīng)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)所有SNP位點(diǎn)均符合Hardy-Weinberg檢驗(yàn)平衡定律，提示所選人群具有較好代表性。通過(guò)多變量回歸分析，rs2268573、rs2300587的基因型(χ2=3.361、2.076，均P>0.05)和等位基因頻率(χ2=0.222、1.980，均P>0.05)在2型糖尿病組和對(duì)照組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。rs2971672的基因型(χ2=6.896，P<0.01)和等位基因分布(χ2=4.708，P<0.05)在2型糖尿病組和對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示此位點(diǎn)SNP多態(tài)性與2型糖尿病相關(guān)，見(jiàn)表2。在顯性遺傳模式下(OR=1.74，95%CI：1.17～2.57，P<0.01)以及在加性遺傳模式下(OR=1.51，95%CI：1.06～2.14，P<0.05)rs2971672的基因型分布在2型糖尿病組和對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表3，提示此位點(diǎn)在顯性和加性遺傳模式下與2型糖尿病的易感性相關(guān)。

2.2GCK單體型的構(gòu)建及與2型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系運(yùn)用Haploview軟件進(jìn)行單體型構(gòu)建。GCK基因3個(gè)位點(diǎn)中的2個(gè)位點(diǎn)組成LD 域，即rs2971672和rs2300587。GCK的兩個(gè)位點(diǎn)rs2971672和rs2300587共存在TC、TA、CA 3種主要單體型(表4)，其中兩種差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)：?jiǎn)误w型TA和CA均降低了個(gè)體患2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)，OR值分別為0.81(95%CI:0.66～1.00，P<0.05)和0.78(95%CI:0.62～0.98，P<0.05)。

表2　　SNPs位點(diǎn)基因型及等位基因分布在2型糖尿病組與對(duì)照組之間的分析

表3　　不同遺傳背景下各SNP位點(diǎn)分析

表4　　rs2300587 C/T、rs2971672C/A位點(diǎn)配對(duì)單體型頻率比較

注：-表示無(wú)數(shù)據(jù)。

3　討　　論

近年來(lái)，遺傳因素在糖尿病發(fā)生和發(fā)展中的作用備受關(guān)注。已有研究表明，鈣蛋白酶10(Calpain-10)基因、KIR6.2基因、HNF-4α基因、TCF7L2基因等與糖尿病的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)[10]。本研究通過(guò)對(duì)GCK基因的tagSNPs網(wǎng)上系統(tǒng)分析和文獻(xiàn)查閱，選取GCK基因3個(gè)tagSNPs位點(diǎn)rs2971672、rs2268573、rs2300587，探討其與中國(guó)漢族人2型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。本研究在挑選位點(diǎn)時(shí)，基于以下兩點(diǎn)：(1)在疾病相關(guān)基因中，基因編碼區(qū)、5′非編碼區(qū)(5′UTR)、3′非編碼區(qū)(3′UTR)、5′附近的基因(5′near gene)、3′附近的基因(3′near gene)的SNP位點(diǎn)，最小等位基因頻率(MAF)一般大于5%，進(jìn)入美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的SNP數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)，輸入目的基因，找出MAF頻率大于0.05的多態(tài)性位點(diǎn)，這些位點(diǎn)在基因的編碼區(qū)、5′UTR、3′UTR、5′near gene、3′near gene。同時(shí)，注意選擇人種，因?yàn)椴煌娜朔N各SNP的頻率是不同的。(2)一個(gè)基因上有很多個(gè)SNP位點(diǎn)，并且基因上位點(diǎn)間往往是有關(guān)聯(lián)的，可以用一個(gè)位點(diǎn)或多個(gè)位點(diǎn)的組合代表另外的位點(diǎn)或單體型，所以可以挑選有代表性的位點(diǎn)來(lái)代表基因上其他的位點(diǎn)或人群中存在的常見(jiàn)單體型。在選取tagSNPs時(shí)主要考慮序列范圍(一般常用基因前5 kb和后2 kb)、SNP入選頻率標(biāo)準(zhǔn)(MAF≥0.05)和r2標(biāo)準(zhǔn)(r2≥0.8)。

在dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢得到：rs2971672位點(diǎn)的MAF值C在非洲裔美國(guó)人和中國(guó)南方漢族人群分別占0.475和0.461。有文獻(xiàn)報(bào)道，非洲裔美國(guó)人2型糖尿病和2型糖尿病伴發(fā)終末期腎病患者，GCK都起著重要作用，但未發(fā)現(xiàn)rs2971672位點(diǎn)突變與非洲裔美國(guó)人2型糖尿病和2型糖尿病伴發(fā)終末期腎病有關(guān)[11]。本研究結(jié)果顯示，GCK位點(diǎn)rs2971672與2型糖尿病有關(guān)，在對(duì)背景、年齡和性別作出調(diào)整后，仍與2型糖尿病相關(guān)。在顯性遺傳模式和加性遺傳模式下，rs2971672位點(diǎn)的基因型分布在2型糖尿病組和對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示該位點(diǎn)在顯性和加性遺傳模式下與2型糖尿病的易感性密切相關(guān)，可能增加個(gè)體患2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)，但與文獻(xiàn)[11]的研究不符，這可能與種族和地區(qū)差異有關(guān)。此外，有文獻(xiàn)還報(bào)道印第安人群rs2268573突變與2型糖尿病有相關(guān)性[12]，rs2300587則與空腹血糖的水平無(wú)關(guān)[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，GCK位點(diǎn)rs2268573和rs2300587等位基因及基因型分布頻率與健康人群相比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與上述研究不完全一致，提示這些基因與糖尿病及糖代謝的關(guān)系尚需深入研究。單體型研

究結(jié)果顯示，SNP位點(diǎn)rs2300587、rs2971672形成LD域，表達(dá)顯著關(guān)聯(lián)(P<0.05)，表明在這2個(gè)SNP位點(diǎn)中有基因-基因相互作用。

總之，本研究初步驗(yàn)證了在漢族人群中，GCK基因區(qū)域的rs2971672位點(diǎn)與糖尿病遺傳易感性密切相關(guān)，而rs2268573、rs2300587位點(diǎn)與糖尿病遺傳易感性無(wú)明確相關(guān)性。rs2300587和rs2971672的LD域有基因-基因相互作用。rs2971672和rs2300587 LD 域單體型TA和CA均降低了個(gè)體患2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)。這些突變基因的作用機(jī)制值得深入研究。

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Study on relationship between glucokinase gene 3 tag single nucleotide polymorphism sites and type 2 diabetes*

ZHANGXiuming1，SUNGeqin2，LUOChujun2,LIJingjing2，HANHui2，CHENQiong2

(1.MedicalLaboratoryCenter,LuohuHospitalGroup,Shenzhen,Guangdong518000,China;2.AffiliatedZhongshanHospitalofSunYat-senUniversity,Zhongshan,Guangdong528403,China)

ObjectiveTo investigate the relationships between glucokinase(GCK) gene 3 tag single-nucleotide polymorphisms(tagSNPs)sites rs2971672,rs2268573 and rs2300587 polymorphisms with type 2 diabetes (T2DM)．MethodsA total of 499 southern Han inpatients with T2DM(T2DM group) in our hospital and contemporaneous 499 Han individuals undergoing the physical examination(control group) in the Health and Fitness Protection Center of our hospital from August 2013 to December 2014 were chosen.The GCK gene 3 tagSNPs sites in all subjects were genotyped by adopting the improved multiple ligase detection reaction (iMLDR),and the genotype and allele frequency between the T2DM group and healthy controls were compared by the chi-square test,logistic regression analysis,moreover the tagSNPs sites were performed the correlation analysis under three genetic modes(dominant,recessive and additive).The Haploview software was used to construct the haplotype of GCK gene 3 tagSNPs and the linkage disequilibrium(LD) and relationship between various GCK haplotype and T2DM susceptibility was analyzed.ResultsThe differences of rs2268573 and rs2300587 genotypes(χ2=3.361,2.076,P>0.05) and allele frequency(χ2=0.222,1.980,P>0.05) between the T2DM group and the control group were not statistically significant.The difference of rs2971672 genotype(χ2=6.896,P<0.01) and allele distribution(χ2=4.708，P<0.05) between the T2DM group and the control group was statistically significant.Under the dominant genetic model and additive genetic model,the genotype distribution of rs2971672 between the T2DM group and the control group was statistically significant(OR=1.74，95%CI:1.17-2.57，P<0.01;OR=1.51，95%CI:1.06-2.14，P<0.05).Among 3 GCK gene sites,rs2971672 and rs2300587 had the LD domain including 3 main haplotypes of TC,TA and CA3,the TA and CA haplotypes all decreased the risk suffering from T2DM(OR=0.81,95%CI:0.66-1.00,P<0.05;OR=0.78,95%CI:0.62-0.98,P<0.05).ConclusionIn Han population,GCK gene rs2971672 site is closely related with T2DM genetic susceptibility,while rs2268573 and rs2300587 sites have no obvious correlation with T2DM susceptibility.Haplotype TA and CA in rs2971672 and rs2300587 LD domain all reduce the individual risk suffering from T2DM.

type 2 diabetes；gene；glucokinase；polymorphism,single nucleotide

廣東省科技計(jì)劃基金資助項(xiàng)目(2013B02180012)。

張秀明，男，主任技師，主要從事臨床化學(xué)檢驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)室管理工作。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.16.003

A

1673-4130(2016)16-2211-04

2016-03-13

2016-06-21)