真菌Sr18代謝產(chǎn)物對根結(jié)線蟲脅迫下黃瓜葉片保護酶的影響

任　毅,　王修清,　孟慶恒,　孫建華,　馮　欣*,　黃文坤,　彭德良

(1. 天津市動植物抗性重點實驗室,天津師范大學生命科學學院, 天津　300387;2. 中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所, 植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 北京　100193)

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真菌Sr18代謝產(chǎn)物對根結(jié)線蟲脅迫下黃瓜葉片保護酶的影響

任毅1,王修清1,孟慶恒1,孫建華1,馮欣1*,黃文坤2,彭德良2

(1. 天津市動植物抗性重點實驗室,天津師范大學生命科學學院, 天津300387;2. 中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所, 植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 北京100193)

為探究根結(jié)線蟲脅迫下絲狀真菌Sr18代謝產(chǎn)物對黃瓜的作用機理,采用溫室盆栽及人工接種試驗,研究了不同濃度的Sr18代謝產(chǎn)物對南方根結(jié)線蟲脅迫下黃瓜葉片保護酶的影響。結(jié)果表明,線蟲侵染黃瓜根部以后,黃瓜葉片SOD、POD和CAT活性減弱,PPO和PAL濃度降低。施加不同濃度的Sr18代謝產(chǎn)物,能夠使線蟲脅迫下的黃瓜葉片SOD、POD和CAT活性增強,使PPO和PAL的含量增加,說明Sr18代謝產(chǎn)物能夠提高黃瓜的保護酶活性與含量,增強黃瓜對南方根結(jié)線蟲的抗性。

Sr18絲狀真菌;根結(jié)線蟲;保護酶;抗性機理

根結(jié)線蟲 (Meloidogynespp.,俗稱root knot nematode,RKN) 能侵染2 000多種植物,是嚴重危害農(nóng)作物生產(chǎn)的病原線蟲之一,對蔬菜等農(nóng)作物造成的危害尤為嚴重[1-2]。真菌的次生代謝產(chǎn)物屬于第二代線蟲生防因子,具有作用快、藥效好、環(huán)境相容性高等優(yōu)點[3]。絲狀真菌SyncephalastrumracemosumSr18是從土壤中自主分離篩選的一株線蟲生防菌[4],其代謝產(chǎn)物對松材線蟲、大豆孢囊線蟲和南方根結(jié)線蟲都具有很強的殺線蟲活性[5],并可顯著降低線蟲的蟲口密度,減少線蟲對植物的危害程度,還具有提高植物鮮重和果實產(chǎn)量的作用[6]。

前人研究結(jié)果顯示,植物受逆境脅迫時,體內(nèi)會積累O2·-、H2O2等活性氧(reactive oxygen species,ROS),能引發(fā)膜脂過氧化反應,進而改變植物細胞膜透性;攻擊核酸和蛋白質(zhì),導致核酸結(jié)構(gòu)受損,蛋白酶失活,植株受害[7-8];而植物體內(nèi)會啟動抗氧化酶系統(tǒng)來適應環(huán)境的變化[9],以抵御逆境造成的氧化脅迫[10],包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、過氧化物酶(peroxidase,POD)、多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)、苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonialyase, PAL)等。其中SOD酶活性的變化可以作為鑒定植物抗病性的生化標記[11]。此外,前人研究還發(fā)現(xiàn),抗病品種黃瓜體內(nèi)的POD、PAL活性顯著高于感病品種[12],這一現(xiàn)象在孢囊線蟲脅迫下的大豆中也同樣得到證實[13]。盡管Sr18代謝產(chǎn)物對根結(jié)線蟲有很好的防控效果[14-15],但是,在根結(jié)線蟲脅迫條件下使用Sr18代謝產(chǎn)物后,植物的保護酶活性及防御相關(guān)機制還不清楚。由此,本試驗以南方根結(jié)線蟲脅迫條件下黃瓜植株作為研究對象,測定了不同濃度Sr18代謝產(chǎn)物處理后植株葉片的SOD、CAT、POD、PPO和PAL的變化情況,以探究在根結(jié)線蟲脅迫條件下Sr18代謝產(chǎn)物對黃瓜植株的保護作用及提高植株抗性的機理。

1　材料與方法

1.1試驗材料

供試黃瓜(CucumissativusL.)品種：‘津春4號’,天津黃瓜研究所生產(chǎn)。

供試線蟲：南方根結(jié)線蟲(Meloidogyneincognita),中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所線蟲實驗室提供。

供試菌株Sr18為天津師范大學分離自土壤的一株線蟲生防菌[4]。

1.2Sr18代謝產(chǎn)物的制備

將保藏的Sr18菌株接入PSM(potato-sucrose-malt extract)斜面培養(yǎng)基,放置在26℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)活化。取活化后的Sr18菌株斜面,加入無菌水洗脫孢子,以6.985×108個孢子的接種量接入裝有300 L液體的PSM培養(yǎng)基的500 L種子罐中,27℃通氣攪拌培養(yǎng)24 h。再經(jīng)過裝有3 000 L液體發(fā)酵培養(yǎng)基的5 t通氣攪拌型發(fā)酵罐發(fā)酵40 h,得到下罐液(菌體濃度5g/L)。將下罐液經(jīng)過板框過濾以及真空濃縮,制得濃縮7倍的Sr18代謝產(chǎn)物,發(fā)酵過程在天津市新星獸藥廠進行。將濃縮液用無菌水稀釋7倍成原液(干物質(zhì)濃度8 g/L),再依次用無菌水等比例稀釋成2倍、4倍,即為所需的Sr18代謝產(chǎn)物部分。

1.3黃瓜植株的栽培

黃瓜種子于50℃溫水中浸種15 min,水溫降至25℃左右,繼續(xù)浸泡6 h, 28℃催芽40 h,選取胚根一致的種子播種至穴盤中培養(yǎng),條件為白天28℃、16 h,夜晚22℃、8 h。兩周后,選取生長一致的黃瓜幼苗移栽至花盆。

1.4南方根結(jié)線蟲孵化與收集

采用機械搗碎過篩法[16],略有改動。將發(fā)病重、根結(jié)多的根系,剪成1～2 cm,放入組織攪拌機中,加入適量2%的NaClO溶液搗碎成混合物。倒入組合篩上沖洗,組合篩自上而下依次為60目、230目、500目。直至泡沫和氯氣味去除,噴淋后期使用無菌水,逆流將卵沖入燒杯中。用40%的蔗糖和蟲卵液等體積離心,收集絮狀蟲卵。在25℃下,采用改進的貝爾曼漏斗法收集孵化的2齡幼蟲。

1.5試驗設計

將移栽后的黃瓜幼苗隨機分為A、B兩組。A組為不接種線蟲組,B組為接種線蟲組。黃瓜幼苗移栽24 h后,A、B兩組均分別用Sr18代謝產(chǎn)物原液(Sr18)、原液的2倍稀釋液(1/2Sr18)、原液的4倍稀釋液(1/4 Sr18)3 mL噴灑處理土壤,以等體積清水做空白對照。隨后，向B組每株黃瓜靠近根部的土壤接種1 mL南方根結(jié)線蟲的2齡幼蟲稀釋液(1 000條/mL)。

1.6Sr18代謝產(chǎn)物對南方根結(jié)線蟲的防治效果

定植60 d后,調(diào)查根結(jié)線蟲對黃瓜的危害情況,計算不同濃度Sr18代謝產(chǎn)物處理后的根結(jié)指數(shù)與對根結(jié)線蟲的防治效果[14]。

1.7不同處理下黃瓜植株酶活性和酶濃度測定

定植60 d后[17]測量黃瓜植株葉片的酶活性指標。準確稱量黃瓜葉片組織,按重量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例,量取 9倍體積的0.1 mol/L的磷酸緩沖液(pH=6.5);將植物葉片組織剪碎后放入勻漿器中,在冰浴上充分研磨,將研磨均勻的植物組織勻漿液倒入離心管,經(jīng)離心后取得的上清液即為酶提取液,每個處理3個重復。SOD、CAT、POD的活性和PPO、PAL的濃度測定采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的超氧化物歧化酶測定試劑盒(A001-3 WST-1法),過氧化氫酶測定試劑盒(A007-1可見光法),過氧化物酶測定試劑盒(A084-3),植物苯丙氨酸解氨酶酶聯(lián)免疫檢測試劑盒和植物多酚氧化酶酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。

1.8數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法

統(tǒng)計分析采用SPSS17.0軟件,比較采用Duncan’ s 新復極差法(P<0.05)進行顯著性檢驗,作圖采用Origin Pro 8 軟件。

2　結(jié)果與分析

2.1Sr18代謝產(chǎn)物對根結(jié)線蟲的防治效果

在黃瓜接種線蟲60 d后,挖取全部根系,調(diào)查根結(jié)線蟲的危害情況。Sr18代謝產(chǎn)物原液及2種不同濃度的稀釋液均可顯著降低根結(jié)線蟲的危害程度,其中Sr18代謝產(chǎn)物原液處理的黃瓜根結(jié)指數(shù)最低,防治效果最好(67.4%);其次是Sr18代謝產(chǎn)物2倍稀釋液,防治效果達58.8%;Sr18代謝產(chǎn)物4倍稀釋液的根結(jié)指數(shù)較高,但防治效果達50.8% (圖1)。說明Sr18代謝產(chǎn)物稀釋4倍后仍然可以有效地控制根結(jié)線蟲的危害。

圖1　不同濃度的Sr18代謝產(chǎn)物對南方根結(jié)線蟲的防治效果Fig.1　Control effects of different dilutions of Sr18 metabolites on Meloidogyne incognita in cucumber

2.2Sr18代謝產(chǎn)物對黃瓜植株超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響

Sr18代謝產(chǎn)物處理根結(jié)線蟲脅迫下的黃瓜植株SOD酶活力的測定見圖2。未接種線蟲時,施加Sr18代謝產(chǎn)物后,SOD活性明顯增加。施加原液的2倍稀釋液時,SOD活力達到最大值。當線蟲侵染黃瓜植株以后,SOD酶活力顯著降低。線蟲脅迫下,施加不同濃度的Sr18代謝產(chǎn)物,葉片SOD 活性均明顯升高,且隨著Sr18代謝產(chǎn)物濃度的增加SOD酶活力增加。SOD是植物體中清除自由基最重要的防御酶,是植物防御活性氧毒害的第一道防線,能有效清除線蟲侵染植株體內(nèi)產(chǎn)生的自由基[11]。說明Sr18代謝產(chǎn)物可以促使植物體內(nèi)SOD酶活力上升,增強植株清除活性氧的能力。

圖2　不同濃度的Sr18代謝產(chǎn)物處理后南方根結(jié)線蟲脅迫下黃瓜植株SOD酶活力的測定Fig.2　Tests on SOD activity in cucumber treated with different dilutions of Sr18 metabolites under Meloidogyne incognita stress

2.3Sr18代謝產(chǎn)物對黃瓜植株過氧化氫酶(CAT)活性的影響

Sr18代謝產(chǎn)物處理根結(jié)線蟲脅迫下的黃瓜植株CAT酶活力的測定結(jié)果見圖3。未接種線蟲時,隨著Sr18代謝產(chǎn)物濃度的增加CAT活性也增加,當施加原液時,植株體內(nèi)的CAT活性比清水對照高21.6%。當接種線蟲后,黃瓜植株體內(nèi)的CAT活性明顯減小。而施加Sr18代謝產(chǎn)物后,線蟲侵染的黃瓜植株葉片CAT活性呈現(xiàn)上升的趨勢,其中施加原液的CAT活性比清水對照增加了63%。CAT對植物防御活性氧毒害有重要的作用,能夠及時清除線蟲脅迫產(chǎn)生的過氧化氫等物質(zhì)[18]。因此,Sr18代謝產(chǎn)物可以通過提高植株的CAT活性,減輕過氧化氫對植株的毒害。

圖3　不同濃度的Sr18代謝產(chǎn)物處理后南方根結(jié)線蟲脅迫下黃瓜植株CAT酶活力的測定Fig.3　Tests on CAT activity in cucumber treated with different dilutions of Sr18 metabolites under Meloidogyne incognita stress

2.4Sr18代謝產(chǎn)物對黃瓜植株過氧化物酶(POD)活性影響

Sr18代謝產(chǎn)物處理根結(jié)線蟲脅迫下的黃瓜植株P(guān)OD活性測定見圖4。未接種線蟲時,施加2倍稀釋液能顯著提高植株的POD活性。施加原液時,植株體內(nèi)的POD活性比清水對照高出50.6%。當受到線蟲脅迫后,POD活性明顯減小。而施加不同濃度的Sr18代謝產(chǎn)物,又能夠顯著提高黃瓜植株葉片內(nèi)POD活性,且隨施加濃度的增加呈現(xiàn)上升的趨勢。因此,線蟲的脅迫能使黃瓜植株葉片的POD酶活性降低,不同濃度的Sr18代謝產(chǎn)物卻能有效增加植株葉片體內(nèi)POD的活性。POD同SOD、CAT相似,是細胞內(nèi)重要的活性氧清除劑[19],能夠及時清除線蟲侵染的植物體內(nèi)的過氧化氫。除此之外,POD在植物細胞壁成熟過程的木質(zhì)素合成中還有重要的作用[20]。

圖4　不同濃度的Sr18代謝產(chǎn)物處理后南方根結(jié)線蟲脅迫下黃瓜植株P(guān)OD酶活力的測定Fig.4　Tests on POD activity in cucumber treated with different dilutions of Sr18 metabolites under Meloidogyne incognita stress

2.5Sr18代謝產(chǎn)物對黃瓜植株苯丙氨酸解氨酶(PAL)濃度的影響

Sr18代謝產(chǎn)物處理根結(jié)線蟲脅迫下的黃瓜植株葉片PAL酶濃度的測定見圖5。未接種線蟲時,施加不同濃度的Sr18后,黃瓜葉片的PAL酶濃度明顯升高。在4倍稀釋液下為最大值,相比清水對照高86.8%。當黃瓜植株受到線蟲脅迫后,PAL酶濃度測定值比清水對照下降了21.3%。而線蟲脅迫下用不同濃度Sr18代謝產(chǎn)物處理,相比線蟲對照PAL酶濃度明顯升高,當用原液的4倍稀釋液時,PAL酶濃度達到最高值。因此,線蟲的脅迫能降低植株葉片PAL酶濃度,但施加不同濃度Sr18代謝產(chǎn)物能緩解線蟲對植株的PAL的影響,提高葉片PAL濃度。PAL與細胞壁成熟過程的木質(zhì)素合成相關(guān)[21],PAL的增加有利于促進木質(zhì)素的合成,形成細胞屏障物質(zhì)抵御線蟲的侵害。

圖5　不同濃度的Sr18代謝產(chǎn)物處理后南方根結(jié)線蟲脅迫下黃瓜植株P(guān)AL酶濃度的測定Fig.5　Tests on PAL concentration in cucumber treated with different dilutions of Sr18 metabolites under Meloidogyne incognita stress

2.6Sr18代謝產(chǎn)物對黃瓜植株多酚氧化酶(PPO)濃度的影響

Sr18代謝產(chǎn)物處理根結(jié)線蟲脅迫下的黃瓜植株葉片PPO的測定見圖6。未接種線蟲時,施加Sr18代謝產(chǎn)物,黃瓜葉片PPO酶濃度明顯升高,且隨著Sr18代謝產(chǎn)物濃度的增加,PPO濃度逐步增加。當用Sr18代謝產(chǎn)物處理后,黃瓜葉片PPO酶濃度測定值與清水對照相比增加了48.7%。當黃瓜植株受到線蟲脅迫后,PPO酶濃度明顯下降。而線蟲脅迫條件下,用不同濃度Sr18代謝產(chǎn)物處理黃瓜植株,PPO酶濃度與線蟲對照相比顯著增加。因此,線蟲的脅迫,使黃瓜植株體內(nèi)的PPO酶濃度降低,而施加不同濃度的Sr18代謝產(chǎn)物,能有效提高植株葉片內(nèi)PPO的濃度,PPO是酚類物質(zhì)氧化的關(guān)鍵酶[22],能保護植物免受酚類物質(zhì)的毒害,抑制線蟲對植物的侵害作用。

3　討論

植物遭受侵害時,病原體及其致病物不僅可導致植物組織和細胞的損傷,還可破壞或降低植物體內(nèi)的一系列保護反應;而植物體內(nèi)也通常會通過發(fā)生一系列生理生化反應來增加自身的抵御能力,其中誘導相關(guān)保護酶活性發(fā)揮了重要作用[10,23]。

圖6　不同濃度的Sr18代謝產(chǎn)物處理后黃瓜植株P(guān)PO酶濃度的測定Fig.6　Tests on PPO concentration in cucumber treated with different dilutions of Sr18 metabolites under Meloidogyne incognita stress

本試驗結(jié)果表明：線蟲侵染黃瓜植株以后,黃瓜葉片內(nèi)的抗氧化酶SOD、POD和CAT活性減弱,而Sr18代謝產(chǎn)物能夠使線蟲脅迫下黃瓜葉片SOD、POD和CAT活性增強。PPO和PAL濃度的測定也證實了抗氧化酶測定的結(jié)果。許多研究表明,植物在逆境如病害條件下,活性氧代謝失衡,產(chǎn)生的過氧化物能破壞細胞膜結(jié)構(gòu),而通過提高黃瓜葉片中的SOD、POD和CAT活性,可降低活性氧對植物的傷害。因為SOD、POD以及CAT是細胞內(nèi)重要的活性氧清除劑,能及時清除由于線蟲侵染植物體產(chǎn)生的自由基,維持植物體內(nèi)活性氧正常水平,從而達到保護植物的目的[11, 18-19]。PAL是植物木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶,其濃度增加,能夠促進植物合成木質(zhì)素,加強植物細胞屏障物質(zhì)合成,強化植物細胞壁,阻礙或者延遲線蟲的入侵[21]。PPO是酚類物質(zhì)氧化的關(guān)鍵酶,較高的濃度能保護植物免受酚類物質(zhì)的毒害,抑制線蟲對植物的侵害[22]。這一結(jié)果與他人對黃瓜抗性方面的研究結(jié)果具有一致性。鄒芳斌等人的研究發(fā)現(xiàn),黃瓜感染尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinumOwen)患枯萎病后,抗性品系的黃瓜葉片保護酶(SOD、POD、PPO、PAL)活性明顯高于感病品系,這幾種酶活性的提高與黃瓜抗性呈顯著相關(guān)性[24];王安樂等人也發(fā)現(xiàn)黃瓜感染霜霉病菌[Pseudoperonosporacubensis(Berk.etCurt) Rostov]后,抗病材料的SOD、POD、PAL酶活性也明顯高于感病材料[25];姜玉萍等人研究白粉虱(Trialeurodesvaporariorum)對黃瓜的影響時發(fā)現(xiàn),白粉虱的脅迫能顯著提高黃瓜葉片中抗氧化酶SOD、POD活性[26]。根結(jié)線蟲是植物病原物之一,當黃瓜根結(jié)線蟲侵染不同砧木后,黃瓜葉片內(nèi)的SOD和CAT活性顯著下降,但嫁接苗葉片的保護酶SOD和CAT活性降低的幅度顯著小于自根苗[27]。此外,類似的結(jié)果在真菌代謝物和拮抗菌的研究中也有發(fā)現(xiàn),如：香菇多糖浸種后,可以提高黃瓜植株體內(nèi)POD、PPO和PAL活性[28];同樣,在接種拮抗菌(DS-1、SG-126、Q-2)的患枯萎病的黃瓜葉片內(nèi)也觀察到保護酶(SOD、CAT、PPO和PAL)活性上升的現(xiàn)象[17]。

綜上所述,Sr18代謝產(chǎn)物可以提高抗氧化酶SOD、POD和CAT的活性,提升保護酶PPO和PAL的含量以抵抗根結(jié)線蟲對黃瓜植株的傷害,從而增強黃瓜植株對線蟲的抗性,提高黃瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)。

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(責任編輯：田喆)

The effects of Syncephalastrum racemosum Sr18 metabolites on cucumber protective enzymes under root-knot nematode stress

Ren Yi1,Wang Xiuqing1,Meng Qingheng1,Sun Jianhua1,Feng Xin1,Huang Wenkun2,Peng Deliang2

(1. Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance, College of Life Sciences, Tianjin Normal University, Tianjin300387, China;2.State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing100193, China)

To understand the action mechanism ofSyncephalastrumracemosumSr18 metabolites to cucumber under the root-knot nematodeMeloidogyneincognitastress,the effects of Sr18 metabolites on five protective enzymes (SOD, POD, CAT, PAL, PPO) of cucumbers with/without seedling inoculation by nematodes were investigated in greenhouses. The results showed that higher levels of SOD, POD, CAT activities and PPO, PAL contents were observed in the plants pretreated with Sr18 and inoculated with nematodes than that in non-treated control, while lower activities of SOD, POD and CAT and lower contents of PPO and PAL in leaves of cucumber were observed in the plants inoculated with nematodes than that in non-inoculated control. Sr18 metabolites induced the upregulated activity of antioxidative enzymes in cucumber leaves and enhanced the resistance level of cucumber against the root-knot nematodeM.incognita.

Syncephalastrumracemosum;root-knot nematode;protective enzymes;defence mechanism

2016-01-29

2016-04-22

國家自然科學基金(31272019, 31272022)；國家科技支撐計劃(2012BAD19B06)

E-mail：fengxin216@163.com

Q819

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.04.015