抗生素對(duì)雌二醇降解菌JX-2降解性能的影響

劉靜嫻，劉　娟，孫敏霞，高彥征，李舜堯，凌婉婷（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)土壤有機(jī)污染控制與修復(fù)研究所，南京 210095）

抗生素對(duì)雌二醇降解菌JX-2降解性能的影響

劉靜嫻，劉娟，孫敏霞，高彥征，李舜堯，凌婉婷*
（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)土壤有機(jī)污染控制與修復(fù)研究所，南京 210095）

為了解抗生素對(duì)雌二醇（E2）降解菌JX-2降解性能的影響，通過藥敏試驗(yàn)研究了12種常用抗生素對(duì)菌株JX-2的最小抑菌濃度（MIC）；采用雌二醇-抗生素聯(lián)合培養(yǎng)，研究了不同濃度抗生素作用下菌株生物量及降解性能，探討了混合抗生素分別對(duì)純培養(yǎng)條件下和污水中菌株JX-2降解E2的影響。結(jié)果表明，菌株JX-2對(duì)青霉素和紅霉素的最小抑菌濃度很低，對(duì)氯霉素、土霉素和磺胺嘧啶的耐藥性相對(duì)較高，對(duì)其他抗生素的耐藥性介于兩者之間。低濃度抗生素（＜MIC）對(duì)菌株的生長(zhǎng)和降解性能影響不大，而高濃度抗生素（＞MIC）則會(huì)明顯抑制菌株生長(zhǎng)并降低其降解性能。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，低濃度抗生素對(duì)JX-2降解E2的抑制作用減弱，而高濃度抗生素的抑制作用減弱不明顯。當(dāng)各抗生素濃度為10.0、100.0 μg·L-1和1.0 mg·L-1時(shí)，混合抗生素對(duì)純培養(yǎng)條件下菌株JX-2降解E2并無影響，而當(dāng)各抗生素濃度增大到10.0 mg·L-1時(shí)，混合抗生素顯著抑制了菌株對(duì)E2的降解，7 d時(shí)E2降解率為48.2%。當(dāng)各抗生素濃度為10.0、100.0 μg·L-1和1.0 mg·L-1時(shí)，菌株JX-2對(duì)污水中E2具有良好的降解效果，E2降解率達(dá)80%以上。

抗生素；雌二醇降解菌；降解；最小抑菌濃度；污水

劉靜嫻，劉娟，孫敏霞，等.抗生素對(duì)雌二醇降解菌JX-2降解性能的影響［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2016，35（8）：1488-1492.

LIU Jing-xian，LIU Juan，SUN Min-xia，et al.Effects of antibiotics on the estradiol degradation by strain JX-2［J］.Journal of Agro-Environment Science，2016，35（8）：1488-1492.

當(dāng)前，環(huán)境雌激素污染問題備受各國政府和學(xué)者關(guān)注，被喻為嚴(yán)重威脅人類生命安全的一個(gè)定時(shí)炸彈［1］。其中，生活污水和養(yǎng)殖業(yè)畜禽糞便是環(huán)境雌激素的重要來源。大量排放到環(huán)境中的雌激素已經(jīng)嚴(yán)重威脅人類和動(dòng)物的安全與健康。利用功能降解菌有望高效去除雌激素，國內(nèi)外學(xué)者已分離獲得了多株雌激素降解菌［2-5］，這些降解菌具有較好的雌激素降解效果，從而為去除環(huán)境中的雌激素提供了一個(gè)很好的思路。

環(huán)境中抗生素往往與雌激素共存。目前在土壤、地表水及地下水中均能檢測(cè)到抗生素［6］。抗生素的污染狀況、環(huán)境行為、生態(tài)效應(yīng)等是近年來環(huán)境領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。環(huán)境中抗生素能自然產(chǎn)生，這屬于微生物自然防御機(jī)制，其環(huán)境本底值非常低，而目前環(huán)境中大量抗生素主要來自于工業(yè)生產(chǎn)的醫(yī)用抗生素和獸用抗生素。大量未失活的抗生素通過醫(yī)院的污水、使用者糞便、畜禽與水產(chǎn)養(yǎng)殖所產(chǎn)生的廢棄物等排入環(huán)境，嚴(yán)重威脅人群健康和環(huán)境微生物的生態(tài)安全［7］。環(huán)境中的殘留抗生素已被證實(shí)可直接影響微生物的生物量［8-9］、群落結(jié)構(gòu)［10-11］、活性等［12］，并誘導(dǎo)產(chǎn)生抗性基因［13-14］。

抗菌性是抗生素的本質(zhì)屬性?？股乜蓪?duì)雌激素降解菌這類環(huán)境有益菌產(chǎn)生生態(tài)效應(yīng)，進(jìn)而影響降解菌對(duì)環(huán)境中雌激素的降解性能。然而，有關(guān)抗生素影響微生物降解與轉(zhuǎn)化雌激素的文獻(xiàn)報(bào)道還很少。Chun等［15］報(bào)道，粘土中的抗生素顯著降低了土壤微生物的脫氫酶活性，影響雌二醇（Estradiol，E2）向雌酮（Estrone，E1）的轉(zhuǎn)化。本課題組前期篩選到一株E2降解菌Rhodococcus sp.JX-2，有望實(shí)現(xiàn)環(huán)境中E2的高效去除；但共存抗生素的影響是制約功能菌降解效率的一個(gè)關(guān)鍵因素。

本文選用12種常見抗生素，研究了抗生素對(duì)菌株JX-2毒性和降解性能的影響，以期為利用功能菌去除實(shí)際污染環(huán)境中雌激素提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試菌：菌株為實(shí)驗(yàn)室篩選分離得到的降解菌Rhodococcus sp.JX-2。

菌懸液的制備：將菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，30℃、150 r·min-1搖床培養(yǎng)15 h，8000 r·min-1離心10 min，倒掉上清液，用無機(jī)鹽培養(yǎng)基（MSM）或無菌水洗滌菌體，再次離心5 min，倒去上清液。重復(fù)洗滌1次后，利用MSM或無菌水重新懸浮菌體，利用分光光度計(jì)調(diào)整菌體濃度到OD600=1。

抗生素：青霉素（Penicillin，P；G鈉鹽，純度98%），四環(huán)素（Tetracycline，TC；鹽酸四環(huán)素，純度98%），紅霉素（Erythromycin，EM；純度98%），慶大霉素（Gen tamycin，GM；硫酸慶大霉素，純度98%），鏈霉素（Strep tomycin，SM；硫酸鏈霉素，純度98%），氨芐青霉素（Ampicillin，AMP；氨芐青霉素鈉鹽，純度98%），氯霉素（Chloramphenicol，C；純度99%），卡那霉素（Kanamycin，KM；硫酸卡那霉素，純度98%），土霉素（Oxytetracycline，OTC；鹽酸土霉素，純度99%），羧芐青霉素（Carbenicillin，CAR；羧芐青霉素二鈉鹽，純度98%），金霉素（Chlortetracycline，CTC；鹽酸金霉素，純度98%），磺胺嘧啶（Sulfadiazine，SDZ；純度98%）。

抗生素母液配置：紅霉素、氯霉素配制成濃度為5120 μg·mL-1的乙醇溶液，其余抗生素為5120 μg· mL-1的水溶液，即為抗生素母液；實(shí)驗(yàn)前均用無菌水稀釋成濃度為1280 μg·mL-1的溶液備用。

雌二醇（純度≥98%）購自Sigma-Aldrich公司。其基本性質(zhì)如下：分子量272.38 g·mol-1，純水中溶解度5.4～13.3 mg·L-1，辛醇-水分配系數(shù)（lgKow）為3.8～4.0，蒸發(fā)壓3×10-8kPa［16］。

1.2培養(yǎng)基組成

MH肉湯（g·L-1）：牛肉粉 2.0，酸水解酪蛋白17.5，可溶性淀粉1.5，pH（7.3±0.1）。

無機(jī)鹽培養(yǎng)基（g·L-1）：（NH4）2SO41.50、K2HPO4· 3H2O 1.91、KH2PO40.50、NaCl 0.50、MgSO4·7H2O 0.20，微量元素溶液2 mL，自然pH值。其中微量元素溶液成分（g·L-1）：CoCl2·6H2O 0.1，MnCl2·4H2O 0.425，ZnCl20.05，NiCl2·6H2O 0.01，CuSO4·5H2O 0.015，Na2MoO4· 2H2O 0.01，Na2SeO4·2H2O 0.01。

E2降解培養(yǎng)基（MSM-E2培養(yǎng)基）：1000 mg·L-1的E2丙酮溶液過0.22 μm濾膜除菌，取一定量置于滅菌三角瓶中，待丙酮完全揮發(fā)完后，加入滅菌的MSM培養(yǎng)基，使E2的最終濃度達(dá)到實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)濃度。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1最小抑菌濃度

菌株對(duì)抗生素的最小抑菌濃度（Minimuminhibitory concentration，MIC）：指在體外培養(yǎng)細(xì)菌18～24 h后能抑制培養(yǎng)基內(nèi)細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度［17］。根據(jù)美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（NCCLS）關(guān)于抗菌藥物敏感性試驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)，采用MH肉湯稀釋法測(cè)定菌株JX-2的最小抑菌濃度。取無菌小試管12支排于試管架上，于第1管加入MH肉湯1.6 mL，第2～12管各加1.0 mL。于第1管中加入稀釋好的1280 μg·mL-1的抗生素0.4 mL，混勻后取1.0 mL至第2管，第2管混勻后取1.0 mL至第3管，如此連續(xù)倍比稀釋至第11管，并從第11管中吸取1.0 mL棄去，第12管為不含藥物的生長(zhǎng)對(duì)照。此時(shí)各管抗生素濃度依次為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 μg·mL-1。然后將菌懸液濃度校正至0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)，并在每管內(nèi)加入校正好濃度的菌液各1.0 mL。第1管至第11管抗生素終濃度分別為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 μg·mL-1。

1.3.2抗生素對(duì)菌株生物量及降解性能的影響

根據(jù)試驗(yàn)測(cè)得菌株JX-2的最小抑菌濃度，設(shè)置抗生素的濃度。分為兩個(gè)濃度梯度：低濃度抗生素（濃度低于MIC），菌株生長(zhǎng)不受抑制；高濃度抗生素（濃度高于MIC），菌株生長(zhǎng)受到抑制。在E2含量為30 mg·L-1的MSM-E2培養(yǎng)基中，分別加入相應(yīng)濃度的低濃度抗生素和高濃度抗生素。再按5%（體積比）的接種量向20 mL培養(yǎng)基中加入菌懸液，30℃、150 r·min-1搖床培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)置時(shí)間梯度，分別在第1、3、5、7 d取樣，測(cè)定培養(yǎng)基中殘留E2濃度，并對(duì)細(xì)菌進(jìn)行平板計(jì)數(shù)測(cè)定其生長(zhǎng)。試驗(yàn)設(shè)置不加任何抗生素的對(duì)照（CK）。

1.3.3混合抗生素對(duì)純培養(yǎng)條件下菌株JX-2降解E2的影響

在E2含量為30 mg·L-1的MSM-E2培養(yǎng)基中，加入混合抗生素，使混合抗生素中每一種抗生素的濃度均達(dá)到試驗(yàn)要求濃度，每種抗生素濃度設(shè)置4個(gè)梯度，分別為10.0、100.0 μg·L-1和1.0、10.0 mg·L-1。再按5%（體積比）的接種量向20 mL培養(yǎng)基中加入菌懸液，30℃、150 r·min-1搖床培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)置時(shí)間梯度，分別在第1、3、5、7 d取樣，測(cè)定培養(yǎng)基中殘留E2濃度，計(jì)算E2降解率。試驗(yàn)設(shè)置不添加抗生素的對(duì)照（CK）。

1.3.4混合抗生素對(duì)污水中菌株JX-2降解E2的影響

污水樣品采自南京某污染湖泊生活污水排污口，實(shí)驗(yàn)前測(cè)定污水中E2含量。1 L污水中按照5%（體積比）接種JX-2菌懸液50 mL，另一組污水樣品中添加等體積無菌水取代菌懸液。同時(shí)在污水中添加混合抗生素，使每一種抗生素的濃度分別為10.0、100.0 μg·L-1和1.0、10.0 mg·L-1。30℃、150 r·min-1搖床培養(yǎng)7 d后測(cè)定污水中E2濃度。試驗(yàn)設(shè)置不添加抗生素的對(duì)照（CK）。

1.4培養(yǎng)液和污水中E2的分析方法

1.4.1培養(yǎng)液中E2含量的測(cè)定

E2濃度測(cè)定采用定時(shí)整瓶提取培養(yǎng)基的方法［18］。向培養(yǎng)液中加入等體積色譜純甲醇，超聲振蕩30 min后過0.22 μm濾膜，用高效液相色譜儀（High performance liquid chromatography，HPLC）測(cè)定E2濃度。HPLC（島津LC-20AT）設(shè)定參數(shù)為：Inertsil ODS-SPC18反相色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈∶水=70∶30（V/V），流速1.00 mL·min-1，柱溫40℃，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，進(jìn)樣量20 μL。通過加標(biāo)回收試驗(yàn)測(cè)得此方法E2的加標(biāo)回收率為95.84%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.91%（n=5）。

1.4.2污水中E2的分析方法

利用HPLC檢測(cè)污水中E2含量參考付銀杰等［19］和李欣等［20］文獻(xiàn)。污水樣品以約5mL·min-1流速通過已分別用5 mL甲醇和5 mL超純水活化的C18固相萃取柱（200mg/6mL）。5mL超純水淋洗柱體并抽吸3min后，用15 mL甲醇洗脫，洗脫液收集至試管中。氮?dú)獯蹈珊?，加入甲? mL溶解，過0.22 μm濾膜，HPLC-熒光檢測(cè)器（Fluorescence detection，F(xiàn)LD）分析。設(shè)定參數(shù)為：Inertsil ODS-SP-C18反相色譜柱（150 mm× 4.6 mm，5 μm），激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為280 nm 和310nm，流動(dòng)相為甲醇∶乙腈∶水=20∶30∶50（V/V），流速0.8mL·min-1，柱溫40℃，進(jìn)樣量20μL。通過加標(biāo)回收試驗(yàn)測(cè)得此方法E2的加標(biāo)回收率為88.34%～93.85%，RSD為1.97%～2.28%（n=5），檢出限為0.186μg·L-1。

1.5數(shù)據(jù)分析

所有圖表中的數(shù)據(jù)均采用3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差來表示。采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件在95%的置信區(qū)間下進(jìn)行差異顯著性分析。

式中：E2剩余濃度指用HPLC測(cè)得培養(yǎng)基中經(jīng)過菌株JX-2降解后的E2實(shí)際剩余濃度；E2初始濃度指用HPLC測(cè)得空白對(duì)照組的實(shí)際E2濃度。

式中：C0指CK的E2降解率；Ci指添加抗生素后E2降解率。

2　結(jié)果與分析

2.1最小抑菌濃度（MIC）

菌株JX-2對(duì)青霉素和紅霉素的MIC很低，其中青霉素在試驗(yàn)的最低濃度0.125 μg·mL-1時(shí)菌株也不可生長(zhǎng)，紅霉素濃度在0.25 μg·mL-1（含）以上時(shí)菌株不可生長(zhǎng)；JX-2對(duì)氯霉素、土霉素和磺胺嘧啶的耐藥性相對(duì)較高；對(duì)于其他抗生素的耐藥性介于兩者之間。菌株JX-2對(duì)12種抗生素的MIC見表1。

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果設(shè)置低濃度抗生素（＜MIC）：青霉素0.05 μg·mL-1，四環(huán)素0.5 μg·mL-1，紅霉素0.05 μg·mL-1，慶大霉素0.125 μg·mL-1，鏈霉素0.25 μg· mL-1，氨芐青霉素0.125 μg·mL-1，氯霉素2.0 μg·mL-1，卡那霉素0.5 μg·mL-1，土霉素4.0 μg·mL-1，羧芐青霉素0.5 μg·mL-1，金霉素0.5 μg·mL-1，磺胺嘧啶2.0 μg·mL-1。

高濃度抗生素（＞MIC）：青霉素0.25 μg·mL-1，四環(huán)素4.0 μg·mL-1，紅霉素0.5 μg·mL-1，慶大霉素1.0 μg·mL-1，鏈霉素2.0 μg·mL-1，氨芐青霉素1.0 μg·mL-1，氯霉素16.0 μg·mL-1，卡那霉素4.0 μg·mL-1，土霉素32.0 μg·mL-1，羧芐青霉素4.0 μg·mL-1，金霉素4.0 μg·mL-1，磺胺嘧啶16.0 μg·mL-1。

2.2抗生素對(duì)菌株JX-2生物量的影響

低濃度抗生素（＜MIC）對(duì)菌株JX-2降解E2時(shí)生物量的影響如圖1所示。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，CK和添加低濃度抗生素的菌株生物量均增加。在低濃度抗生素的作用下，除GM、TC、KM和CTC外，7 d時(shí)菌株JX-2的生長(zhǎng)情況與CK差異不顯著。這說明，大部分低濃度抗生素對(duì)菌株的生長(zhǎng)沒有顯著影響，只有少部分低濃度抗生素（如GM、TC、KM和CTC）對(duì)JX-2的生長(zhǎng)有一定抑制作用，但抑制作用不強(qiáng)烈。

高濃度抗生素（＞MIC）對(duì)菌株JX-2降解E2時(shí)生物量的影響見圖2。與CK相比，高濃度的抗生素明顯抑制菌株JX-2的生長(zhǎng)。但從圖2中可看出，即使是添加了濃度高于MIC值的抗生素，菌株JX-2的生長(zhǎng)也并不是完全被抑制。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，菌株JX-2的生物量從3.6～4.0 lgCFU·mL-1增長(zhǎng)至5.0～5.6 lgCFU·mL-1，增長(zhǎng)較為明顯。

2.3抗生素對(duì)菌株JX-2降解E2的影響

低濃度抗生素（＜MIC）對(duì)菌株JX-2降解E2的影響如圖3所示。培養(yǎng)7 d時(shí)，CK處理的E2降解率高達(dá)91.5%，表明在沒有抗生素存在的條件下菌株JX-2的降解活性良好；當(dāng)降解體系中加入低濃度抗生素后，培養(yǎng)1 d和3 d時(shí)低濃度抗生素導(dǎo)致菌株降解E2的降解率顯著下降。這可能是因?yàn)榫陝偙唤臃N到培養(yǎng)基中，對(duì)抗生素環(huán)境尚沒有產(chǎn)生適應(yīng)性。但7 d時(shí)，菌株已基本適應(yīng)低濃度抗生素脅迫，其E2降解率相比于1 d和3 d時(shí)明顯上升，達(dá)到76%～89%。其中，低濃度GM、CAR、AMP和OTC作用下JX-2對(duì)E2的降解率與CK無顯著性差異。

高濃度抗生素（＞MIC）對(duì)菌株JX-2降解E2的影響見圖4。在1、3、5、7 d內(nèi)，高濃度抗生素均導(dǎo)致菌株對(duì)E2的降解率顯著低于CK，7 d時(shí)E2的降解率僅為20%～35%。隨著降解時(shí)間延長(zhǎng)，JX-2對(duì)E2降解率從1d時(shí)的不到10%提高至7d時(shí)的20%～35%，說明菌株JX-2在高濃度抗生素環(huán)境中仍具有一定生長(zhǎng)和降解能力，但其活性已受到了一定抑制。

表1　菌株JX-2對(duì)12種抗生素的最小抑菌濃度Table 1 The minimum inhibitory concentration for strain JX-2 tested with 12 kinds of antibiotics

圖1　低濃度抗生素（＜MIC）對(duì)菌株JX-2生物量的影響Figure 1 Effects antibiotics at low concentrations on the cell growth of strain JX-2

圖2　高濃度抗生素（＞MIC）對(duì)菌株JX-2生物量的影響Figure 2 Effects antibiotics at high concentrations on the cell growth of strain JX-2

圖3　低濃度抗生素（＜MIC）對(duì)菌株JX-2降解E2的影響Figure 3 Effects of antibiotics at low concentrations on E2 degradation by strain JX-2

圖4　高濃度抗生素（＞MIC）對(duì)菌株JX-2降解E2的影響Figure 4 Effects of antibiotics at high concentrations on E2 degradation by strain JX-2

根據(jù)圖3和圖4的結(jié)果計(jì)算了不同濃度抗生素對(duì)菌株JX-2降解E2的抑制率（表2）。隨著降解時(shí)間延長(zhǎng)，低濃度抗生素對(duì)JX-2降解E2的抑制作用減弱，其抑制率由1 d時(shí)的31.10%～60.13%下降至7 d時(shí)的3.37%～16.96%。當(dāng)環(huán)境抗生素濃度低于MIC值時(shí)，菌株JX-2對(duì)E2的降解作用基本不受影響，其7 d降解率可達(dá)76%以上，抑制率17%以下。而高濃度抗生素對(duì)JX-2降解E2的抑制作用減弱不明顯，其抑制率由1 d時(shí)的82.25%～93.88%下降至7 d時(shí)的63.55%～76.37%。當(dāng)環(huán)境抗生素濃度高于MIC值時(shí)，菌株JX-2對(duì)E2的降解能力受到一定程度的抑制。但是在高濃度抗生素作用下，菌株JX-2對(duì)E2仍具有20%～35%的降解率，再結(jié)合圖2高濃度抗生素對(duì)菌株JX-2降解E2生物量的影響，可說明此時(shí)菌株JX-2并沒有被完全殺死。這是因?yàn)楫?dāng)抗生素濃度高于MIC值后，在短時(shí)間內(nèi)對(duì)受試菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生了抑制，但并不是完全殺死受試菌；只有當(dāng)抗生素濃度大于等于最小殺菌濃度（Minimum bactericidal concentration，MBC）時(shí)，才能殺死99.9%以上的受試菌。

2.4混合抗生素對(duì)純培養(yǎng)條件下菌株JX-2降解E2的影響

進(jìn)一步研究了12種抗生素的混合體系對(duì)菌株JX-2降解E2的影響（圖5）。當(dāng)各抗生素濃度為10.0、100.0 μg·L-1和1.0 mg·L-1時(shí)，混合抗生素對(duì)菌株JX-2的降解并無影響，7 d時(shí)E2降解率均可達(dá)到90%以上，與CK處理的降解率無顯著差異；但當(dāng)抗生素濃度增大到10.0 mg·L-1時(shí)，混合抗生素明顯抑制了JX-2 對(duì)E2的降解，7 d時(shí)E2降解率僅48.2%。從時(shí)間梯度看，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，4個(gè)抗生素濃度下菌株對(duì)E2的降解率均增大。這說明該濃度的混合抗生素沒有完全抑制菌株JX-2的活性。

2.5混合抗生素對(duì)污水中菌株JX-2降解E2的影響

表2　不同濃度抗生素對(duì)菌株JX-2降解E2的抑制率Table 2 Inhibition rate of antibiotics at different concentrations on E2 degradation by strain JX-2

圖5　混合抗生素對(duì)純培養(yǎng)條件下菌株JX-2降解E2的影響Figure 5 Effect of mixed antibiotics on E2 degradation in aqueous solution by strain JX-2

圖6　混合抗生素對(duì)污水中菌株JX-2降解E2的影響Figure 6 Effect of mixed antibiotics on E2 degradation in sewage by strain JX-2

污水樣品中的抗生素環(huán)境本底值與人為添加量相比非常低［21］，且試驗(yàn)設(shè)置了CK作為對(duì)照，因此可忽略污水中原有的抗生素含量。圖6為7 d時(shí)不同濃度混合抗生素對(duì)污水中菌株JX-2降解E2的影響。用HPLC-FLD測(cè)得污水樣品中E2的平均含量為78.26 ng·L-1。在不同濃度抗生素作用下，即使不接種菌株JX-2，其E2含量仍有所下降，但降解率只有6.2%～19.1%。接種菌株JX-2后，當(dāng)抗生素濃度為10.0、100.0 μg·L-1和1.0 mg·L-1時(shí)，菌株JX-2對(duì)污水中E2具有良好的降解效果，降解率均達(dá)80%以上，與CK降解率無顯著性差異，遠(yuǎn)高于不接種JX-2處理的降解率。而當(dāng)抗生素濃度為10.0 mg·L-1時(shí)，菌株JX-2對(duì)E2的降解率略有下降，為68.9%，但仍明顯高于不接種JX-2處理的降解率。

3　討論

利用降解菌高效降解雌激素已在實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)條件下取得初步成功，但環(huán)境中抗生素往往與雌激素共存，抗生素的影響是制約降解菌降解效率的一個(gè)關(guān)鍵因素，而目前關(guān)于抗生素對(duì)降解菌降解雌激素影響的研究報(bào)道還很少。水體中抗生素實(shí)際濃度一般為痕量殘留［7］。本文結(jié)果表明，環(huán)境中實(shí)際濃度水平下抗生素對(duì)降解菌JX-2的降解率沒有顯著影響，菌株JX-2在抗生素作用下仍能發(fā)揮高效降解性能。這為應(yīng)用菌株JX-2時(shí)如何規(guī)避抗生素風(fēng)險(xiǎn)、并高效去除環(huán)境中E2的實(shí)際應(yīng)用提供了基礎(chǔ)依據(jù)。

添加了高濃度抗生素后，菌株的生長(zhǎng)和降解受到一定抑制。但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株生物量和降解率都有所增加，這說明培養(yǎng)基中的抗生素對(duì)菌株的抑制作用在減弱，可能是因?yàn)榭股卦诟黝惌h(huán)境介質(zhì)中會(huì)自然降解，但其降解機(jī)理與降解速率隨抗生素的種類及環(huán)境條件的不同而有所差異。大環(huán)內(nèi)酯類、內(nèi)酰胺類和磺胺類抗生素易溶于水并水解［22］，四環(huán)素類抗生素易光解［23］，部分抗生素如喹乙醇、甲硝唑、泰樂菌素和土霉素在水體中也會(huì)被生物降解［24］。在搖床培養(yǎng)過程中，隨著抗生素濃度的自然衰減，其藥性將會(huì)有一定程度的減弱。培養(yǎng)7 d時(shí)，不同濃度的抗生素對(duì)菌株JX-2的抑制強(qiáng)度相對(duì)于1、3、5 d同比降低，這與抗生素自身的緩慢降解以及菌株JX-2對(duì)抗生素脅迫產(chǎn)生一定的適應(yīng)性有關(guān)。

抗生素能否影響菌株JX-2在環(huán)境介質(zhì)中的高效降解性能，取決于抗生素在環(huán)境中的實(shí)際濃度與對(duì)應(yīng)MIC值的大小關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的抗生素濃度系列包含了環(huán)境中抗生素的實(shí)際濃度，同時(shí)設(shè)置了高濃度組作為對(duì)照。葉計(jì)朋等［25］分析了珠江流域水體中典型抗生素的環(huán)境含量，指出珠江廣州河段（枯季）和深圳河抗生素污染嚴(yán)重，最高含量可達(dá)1.34 μg·L-1；Zhang等［21］研究發(fā)現(xiàn)，在抗生素污染嚴(yán)重的珠江流域中，濃度最高的抗生素是阿莫西林，達(dá)到3384 ng·L-1。大量文獻(xiàn)數(shù)據(jù)顯示［21，26-29］，不同抗生素在不同環(huán)境介質(zhì)中的濃度不同：水體殘留濃度為ng·L-1級(jí)到μg·L-1級(jí)；土壤殘留濃度一般為μg·kg-1級(jí)；糞便農(nóng)用的土壤可達(dá)到mg·kg-1級(jí)?？股胤N類、用量和環(huán)境條件等都會(huì)影響環(huán)境介質(zhì)中抗生素的殘留量。一般來說，環(huán)境介質(zhì)中的殘留抗生素濃度小于菌株JX-2對(duì)各抗生素的MIC值。理論上，環(huán)境中的抗生素不會(huì)完全抑制菌株JX-2對(duì)E2的降解活性。

將含有E2的生活污水作為培養(yǎng)基，并添加一定濃度的混合抗生素，模擬自然條件下的降解環(huán)境，揭示不同濃度抗生素對(duì)E2降解菌降解性能的影響，這在已有文獻(xiàn)中還鮮見報(bào)道。Xuan等［30］證明了在粉砂壤土中微生物直接參與降解E2，并研究了抗生素在粉砂壤土中對(duì)E2降解動(dòng)力學(xué)的影響，發(fā)現(xiàn)在濃度為40 μmol·kg-1的磺胺二甲氧嘧啶共存下，E2降解速率常數(shù)從0.750 d-1下降到0.492 d-1。本研究結(jié)果表明，抗生素對(duì)環(huán)境中E2降解菌的降解活性產(chǎn)生了明顯的抑制作用，而菌株JX-2在混合抗生素濃度高達(dá)10.0 mg·L-1的污水中對(duì)E2的降解率仍有68.9%，具有較強(qiáng)的抗抗生素脅迫能力。在混合抗生素對(duì)污水中菌株降解E2的影響結(jié)果中，不接種菌株JX-2時(shí)E2降解率為6.2%～19.1%，這是因?yàn)榄h(huán)境中E2可自然降解或被生物降解，但降解效率不高。研究表明，環(huán)境中的E2可在生物或非生物作用下轉(zhuǎn)化為E1，其在淡水沉積物中的半衰期為5～10 d［31］，在20℃河水中半衰期可達(dá)9 d［32］。在添加了不同濃度的抗生素后，隨著抗生素濃度的提高，不接種菌株JX-2的污水中E2降解率逐漸下降。這可能是因?yàn)榭股匾种屏宋鬯型林⑸锏慕到饣钚裕档土薊2降解率。而接種了降解菌JX-2，即使添加高于環(huán)境濃度100～1000倍的混合抗生素，菌株JX-2仍具有良好的降解性能，降解率均能達(dá)到80%以上。這說明菌株JX-2在環(huán)境中的正常生理功能不易受到各類抗生素的抑制，其有望直接應(yīng)用于我國各類環(huán)境介質(zhì)中E2的去除，具有應(yīng)用前景。

4　結(jié)論

（1）菌株JX-2對(duì)青霉素和紅霉素的MIC很低，對(duì)氯霉素、土霉素和磺胺嘧啶的耐藥性相對(duì)較高，對(duì)其他抗生素的耐藥性介于兩者之間。

（2）低濃度抗生素（＜MIC）對(duì)菌株JX-2的生長(zhǎng)和降解性能影響不大；而高濃度抗生素（＞MIC）則會(huì)明顯抑制菌株生長(zhǎng)并降低其對(duì)E2的降解性能。隨著降解時(shí)間延長(zhǎng)，低濃度抗生素對(duì)菌株JX-2降解E2的抑制作用減弱。

（3）當(dāng)各抗生素濃度為10.0、100.0 μg·L-1和1.0 mg·L-1時(shí)，混合抗生素對(duì)菌株JX-2的降解并無影響，而當(dāng)各抗生素濃度增大到10.0 mg·L-1時(shí)，混合抗生素抑制了菌株JX-2對(duì)E2的降解，7 d時(shí)E2降解率僅為48.2%。

（4）當(dāng)各抗生素濃度為10.0、100.0 μg·L-1和1.0 mg·L-1時(shí)，菌株JX-2對(duì)污水中E2具有良好的降解效果（降解率＞80%）。而當(dāng)各抗生素濃度為10.0mg·L-1時(shí)，菌株JX-2對(duì)E2的降解率下降（為68.9%）。

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Effects of antibiotics on the estradiol degradation by strain JX-2

LIU Jing-xian，LIU Juan，SUN Min-xia，GAO Yan-zheng，LI Shun-yao，LING Wan-ting*
（Institute of Organic Contaminant Control and Soil Remediation，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China）

The aim of this work was to investigate the effects of antibiotics on the estradiol（E2）degradation by an estradiol-degrading bacterium Rhodococcus sp.JX-2.The minimum inhibitory concentration（MIC）of 12 kinds of antibiotics to strain JX-2 was measured by the drug sensitive test.The influence of antibiotics at different concentrations on cell growth and E2-degradation performance by JX-2 was studied using an E2-antibiotics co-cultivation method.The impacts of mixed antibiotics at different concentrations and processing time on E2 degradation in both aqueous solution and sewage were elucidated.Strain JX-2 was observed to be extremely sensitive to penicillin and erythromycin.The drug resistance of strain JX-2 tochloramphenicol，oxytetracycline and sulfadiazine versus other antibiotics was relatively stronger.No significant influence was observed on the growth and E2-degradation performance of strain JX-2 under the stress of antibiotics at low concentrations，but high antibiotic concentrations obviously inhibited the strain JX-2 growth and reduced its E2-degradation performance.Extending the incubation time weakened the inhibitory effects of antibiotics at low concentrations on E2 degradation，while no such effects were observed for antibiotics at the high concentrations.The mixed antibiotics did not significantly influence the E2 degradation by strain JX-2 in aqueous solution when the antibiotics concentrations were 10.0 μg·L-1，100.0 μg·L-1and 1.0 mg·L-1，respectively.However，the mixed antibiotics significantly inhibited the E2 degradation when the antibiotics concentration increased to 10.0 mg·L-1，and the E2 degradation rate was only 48.2%in 7 days.Strain JX-2 performed well on E2 degradation in sewage when the antibiotics concentrations were 10.0 μg·L-1，100.0 μg·L-1and 1.0 mg·L-1，and the degradation rates were higher than 80%.

antibiotics；estradiol-degrading bacterium；degradation；minimum inhibitory concentration；sewage

X171.5

A

1672-2043（2016）08-1488-10

10.11654/jaes.2016-0620

2016-05-05

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（51278252）；江蘇省環(huán)保科研課題（2015023）；江蘇省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（社會(huì)發(fā)展）項(xiàng)目（BE2015682）

劉靜嫻（1990—），女，浙江臨安人，碩士研究生，從事環(huán)境污染控制與生物修復(fù)研究。E-mail：2014103034@njau.edu.cn

凌婉婷E-mail：lingwanting@njau.edu.cn