茶樹根系跨膜主動(dòng)吸收氟的表觀特征

王玉梅，柴如山，郜紅建（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，合肥 230036）

茶樹根系跨膜主動(dòng)吸收氟的表觀特征

王玉梅，柴如山，郜紅建*
（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，合肥 230036）

為研究茶樹根系跨膜主動(dòng)吸收氟的過程，采用溶液培養(yǎng)法分析了茶樹吸收氟的動(dòng)力學(xué)特性，探究了溫度、代謝抑制劑和氯離子等因素對(duì)茶樹根系主動(dòng)吸收氟的影響。結(jié)果表明，濃度吸收試驗(yàn)可用Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)模型擬合，獲得動(dòng)力學(xué)參數(shù)Vmax= 13.9 μg·h-1·g-1（根干重，DW），Km=0.59 mmol·L-1。與在25℃培養(yǎng)條件下相比，低溫處理（4℃）明顯抑制了茶樹對(duì)氟的吸收，抑制率達(dá)到49.75%。代謝抑制劑2，4-Dinitrophenol（2，4-DNP）、疊氮鈉（NaN3）和正釩酸鈉（Na3VO4）均抑制了茶樹根系對(duì)氟的吸收過程，而且隨著代謝抑制劑處理濃度的增加，茶樹根系氟含量和累積量也隨之不斷減少。在2，4-DNP、疊氮鈉和正釩酸鈉濃度分別為2、0.2 mmol·L-1和0.6 mmol·L-1條件下，茶樹根系氟含量分別比對(duì)照減少了16.1%、39.1%和20.6%。當(dāng)營養(yǎng)液中氟和氯濃度均為5 mmol· L-1時(shí)，氯離子顯著抑制了茶樹對(duì)氟的吸收，抑制率達(dá)到73.1%，存在拮抗作用。從表觀上分析，茶樹根系對(duì)氟的吸收是一個(gè)與跨質(zhì)膜電化學(xué)勢梯度、代謝能量和載體蛋白有關(guān)的主動(dòng)運(yùn)輸過程。

茶樹；氟；低溫；代謝抑制劑；主動(dòng)吸收

王玉梅，柴如山，郜紅建.茶樹根系跨膜主動(dòng)吸收氟的表觀特征［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2016，35（8）：1473-1479.

WANG Yu-mei，CHAI Ru-shan，GAO Hong-jian.Apparent characteristics of active transmembrane uptake of fluoride by tea plant roots［J］.Journal of Agro-Environment Science，2016，35（8）：1473-1479.

茶樹（Camellia sinensis（L.）O.Kuntze）是一種高富集氟植物，茶樹根系吸收的氟主要在葉片中累積［1-2］。茶葉中的氟約80%以上均可溶解在茶湯中，飲茶攝氟成為人體吸收氟的重要途徑［3］。適量的氟有助于人體骨骼發(fā)育，但是攝入過多的氟，可能會(huì)導(dǎo)致氟斑牙、氟骨病等氟中毒癥狀，茶樹吸收氟的過程及對(duì)茶葉質(zhì)量的影響引起了眾多學(xué)者的關(guān)注。茶樹吸收氟的過程受到外界氟濃度、pH值和離子通道抑制劑等因素的影響。在低氟濃度下，茶樹根系吸收溶液呈現(xiàn)一個(gè)主動(dòng)吸收的規(guī)律，而在高氟濃度下，呈現(xiàn)出一個(gè)被動(dòng)吸收的規(guī)律［4］。pH值影響茶樹根部對(duì)氟的吸收，當(dāng)培養(yǎng)液pH值在4.0～6.0之間時(shí)，茶樹根系氟含量隨著pH值的增加先增加后減少，在pH值為5.5時(shí)達(dá)到最大［5］。Zhang等［6］的研究發(fā)現(xiàn)，陰離子通道抑制劑（5-Nitro-2-（phenylpropylamino）-benzoate）、陽離子通道抑制劑（Tetramethylammonium chloride）和水通道抑制劑（HgCl2）均可減少茶樹根系對(duì)氟的吸收，其中以陰離子通道貢獻(xiàn)最大，這說明陰離子通道是外界氟進(jìn)入茶樹體內(nèi)的重要途徑。

有研究表明，茶樹根系可通過被動(dòng)和主動(dòng)吸收兩種途徑吸收介質(zhì)中的氟，在高氟（50～100mg·L-1）條件下以被動(dòng)吸收為主，而主動(dòng)吸收過程是茶樹富集氟的主要途徑［4］。但是，有關(guān)載體蛋白、代謝能量和電化學(xué)勢在茶樹根系主要吸收氟的過程中的作用還缺少可靠的試驗(yàn)證據(jù)。

本文采用溶液培養(yǎng)法研究了不同氟濃度條件下茶樹根系吸收氟的動(dòng)力學(xué)特性，對(duì)比分析茶樹體內(nèi)與培養(yǎng)介質(zhì)中氟濃度的差異；通過低溫處理（4℃）和添加代謝抑制劑（2，4-DNP、疊氮鈉和正釩酸鈉）探究了茶樹對(duì)氟的吸收過程與能量代謝的關(guān)系；利用氯離子作為陪伴離子，分析茶樹根系氟與氯在跨膜吸收過程中的競爭關(guān)系。研究結(jié)果可為闡明氟在茶樹根系跨膜主動(dòng)吸收過程提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試劑與儀器

本實(shí)驗(yàn)所用氟化鈉、硝酸銨、磷酸二氫鉀、氯化鉀、氯化鈉、二水合檸檬酸三鈉、冰醋酸、2，4-DNP、疊氮鈉和正釩酸鈉等均為分析純，購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。奧立龍氟離子測量儀（配有9609BNWP氟電極）購自美國熱電公司；電熱恒溫水浴鍋購自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；PHS-3C精密pH計(jì)購自上海精密科學(xué)儀器有限公司雷磁儀器廠。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1茶苗培養(yǎng)方法

供試茶樹品種為龍井43，采自合肥高新技術(shù)農(nóng)業(yè)園內(nèi)。精選顆粒飽滿的茶籽在自來水中浸泡2 d后，選取健康茶籽定植于洗凈的石英砂中（直徑0.3 cm），待種子發(fā)芽后，轉(zhuǎn)移至人工氣候室內(nèi)培養(yǎng)。光照時(shí)間12 h·d-1，室溫（22±1）℃，光照強(qiáng)度約1500 lx，空氣濕度45%～50%。待茶苗長至4～5片葉時(shí)，選長勢一致的幼苗，用去離子水沖凈根部，濾紙吸干表面水分后，轉(zhuǎn)移到盛有1/4濃度營養(yǎng)液的塑料盆（50 cm×30 cm）中培養(yǎng)，改進(jìn)的茶樹水培標(biāo)準(zhǔn)營養(yǎng)液配方為：硝酸銨0.114 g·L-1，磷酸二氫鉀0.013 6 g·L-1，氯化鉀0.038 69 g·L-1，pH值調(diào)節(jié)至5.00～5.50之間［6-7］，定時(shí)供氣。待茶苗根系長出大量白色吸收根后，再繼續(xù)水培1周進(jìn)行試驗(yàn)處理。

1.2.2茶樹吸收氟的短時(shí)間動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)

錐形瓶內(nèi)加入250 mL氟濃度為50 mg·L-1氟（以NaF形態(tài)加入），用NaOH（0.1 mol·L-1）和H2SO4（0.1 mol·L-1）將營養(yǎng)液pH值調(diào)至5.0。錐形瓶瓶口用脫脂棉封口，瓶體用黑色膠帶包好遮光，以利于根系生長。茶苗在25℃恒溫培養(yǎng)箱條件下培養(yǎng)0、8、16、24、48、72 h和96 h，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.3茶樹吸收氟的濃度動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)

錐形瓶內(nèi)分別添加氟濃度為0、0.25、0.5、1.0、2.5 mmol·L-1和5.0 mmol·L-1氟（以NaF形態(tài)加入），茶苗在25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。其他培養(yǎng)條件同1.2.2。

1.2.4氯離子對(duì)茶樹吸收氟的影響

錐形瓶內(nèi)加入250 mL氟濃度為5 mmol·L-1的營養(yǎng)液，同時(shí)加入氯離子濃度為5 mmol·L-1NaCl，茶苗在25℃條件下培養(yǎng)72 h，以不含氯的處理為對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。其他培養(yǎng)條件同1.2.2。

1.2.5培養(yǎng)溫度對(duì)茶樹吸收氟的影響

錐形瓶內(nèi)加入250 mL氟濃度為5 mmol·L-1的營養(yǎng)液，培養(yǎng)溫度分別設(shè)置為4℃和25℃，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。低溫處理（4℃）時(shí)，先將營養(yǎng)液用冰浴預(yù)冷到4℃，并保持8 h，后移走冰浴，繼續(xù)培養(yǎng)72 h［8］。其他培養(yǎng)條件同1.2.2。

1.2.6代謝抑制劑對(duì)茶樹吸收氟的影響

錐形瓶內(nèi)加入250 mL氟濃度為5 mmol·L-1的營養(yǎng)液，同時(shí)分別進(jìn)行不同代謝抑制劑處理，其中2，4-DNP處理濃度設(shè)置為 0、0.5、1.0 mmol·L-1和 2.0 mmol·L-1；Na3VO4的濃度設(shè)置為0、0.2、0.4 mmol·L-1和0.6 mmol·L-1；NaN3的濃度設(shè)置為0、0.05、0.1 mmol· L-1和0.2 mmol·L-1。茶苗分別在不同代謝抑制劑和25℃條件下培養(yǎng)72 h，以不含代謝抑制劑的處理為對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。其他培養(yǎng)條件同1.2.2。

1.3氟的提取和測定方法

培養(yǎng)結(jié)束后，將茶苗根系先用自來水沖洗，然后再用蒸餾水洗凈，擦干，分為根、莖、葉置于烘箱中105℃殺青后，75℃烘干至恒重，分別測定茶苗根和葉中的氟含量。茶苗根和葉中氟的提取參照張顯晨等［9］的方法：將茶苗根和葉充分研磨粉碎后，稱取樣品置于50 mL離心管中，加入30 mL超純水，在100℃沸水浴中靜置提取30 min。提取液中氟含量按照郜紅建等［10］的方法測定：準(zhǔn)確量取15 mL提取液置于50 mL聚四氟乙烯燒杯中，再加入15 mL總離子強(qiáng)度緩沖液，將兩者充分?jǐn)嚢杌靹蚝?，用奧立龍氟離子測量儀測定提取液中氟離子濃度?？傠x子強(qiáng)度緩沖液由58 g氯化鈉、68 g二水合檸檬酸三鈉和57 mL冰醋酸溶于700 mL純水，用5 mol·L-1NaOH調(diào)節(jié)pH值至5.0，再用純水定容至1000mL配制而成。

1.4數(shù)據(jù)處理

茶苗根系氟含量和累積量采用DPS統(tǒng)計(jì)軟件中單因素方差分析（ANOVA），組間差異用Tukey法進(jìn)行多重性比較，顯著性檢驗(yàn)水平（P）分別為0.05和0.01，米氏方程采用Origin 9.0軟件進(jìn)行擬合。

2　結(jié)果與分析

2.1茶樹吸收氟的短時(shí)間動(dòng)態(tài)變化

茶樹根系氟含量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而不斷升高（圖1），在0～24 h的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)為快速吸收階段。在培養(yǎng)到0、8、16 h和24 h時(shí)，茶樹根系氟含量分別為64.5、137.3、149.4 mg·kg-1和153.4 mg·kg-1，而在隨后的24～96 h的培養(yǎng)時(shí)間范圍內(nèi)呈現(xiàn)慢速吸收階段。茶樹根系氟含量在72 h時(shí)達(dá)到最大值262.7 mg·kg-1，為不供氟對(duì)照處理的4倍之多。茶樹根系氟的累積量隨著培養(yǎng)時(shí)間延長逐漸增加，并且在72 h達(dá)到最大值，分別為30.1 μg。這與茶樹根系氟含量結(jié)果一致。本文選擇72 h為茶樹吸收氟的平衡時(shí)間，進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。

2.2茶樹吸收氟的動(dòng)力學(xué)特性

隨著營養(yǎng)液中氟濃度的增加，茶樹根系中氟的含量及累積量也隨之升高（圖2）。在0～5.0 mmol·L-1的氟濃度范圍內(nèi)，茶樹根系吸收氟的速率［單位時(shí)間全株總氟累積量/根部干重，μg·h-1·g-1（根DW）］以及根系氟的累積量均隨供氟濃度的升高而快速增加，在2.5～5.0 mmol·L-1氟濃度范圍內(nèi)緩慢增加。當(dāng)氟濃度為5.0 mmol·L-1時(shí)，茶樹根系氟吸收速率和氟累積量均達(dá)到最大值，分別為13.9 μg·h-1·g-1（根DW）、32.3 μg，但根系氟累積量與2.5 mmol·L-1供氟濃度下差異不顯著。茶樹對(duì)氟的吸收累積規(guī)律符合Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)模型，可以用米氏方程V=Vmax·c/（Km+ c）進(jìn)行描述，其中Vmax=13.9 μg·h-1·g-1（根DW），Km= 0.59 mmol·L-1。根據(jù)根系吸收原理及酶動(dòng)力學(xué)原理［11］，Vmax表示載體飽和時(shí)所能達(dá)到的最大吸收速率，其值愈大，表示根系吸收離子的潛力愈大；Km為載體對(duì)吸收離子親和力的倒數(shù)，其值愈小，說明茶樹根系對(duì)氟離子的親和力就越大，反之亦然。

圖2　茶樹吸收氟的濃度動(dòng)力學(xué)特性Figure 2 Kinetic characteristics of fluoride concentrations on fluoride uptake by tea plant

2.3氯對(duì)茶樹吸收氟的影響

氟和氯在元素周期表中同屬鹵族元素，具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)。假設(shè)茶樹在跨膜主動(dòng)吸收氟和氯的過程中存在競爭關(guān)系。前期研究表明，在氯離子濃度不超過20 mmol·L-1的情況下，氯離子不會(huì)對(duì)茶樹造成毒害作用。當(dāng)營養(yǎng)液氯濃度為5mmol·L-1時(shí)，明顯抑制了茶樹對(duì)氟離子的吸收（圖3），茶樹根系氟含量（130.4mg·kg-1）比不加氯離子的對(duì)照下降了73.1%，茶樹根系氟累積量為11.7 μg，比對(duì)照下降了85.1%，達(dá)顯著差異水平（P＜0.05）。

2.4溫度對(duì)茶樹吸收氟的影響

低溫（4℃）明顯抑制了茶樹對(duì)氟離子的吸收（圖4）。在25℃和4℃培養(yǎng)條件下，茶樹根系氟含量分別為173.56 mg·kg-1和115.9 mg·kg-1，根系氟的累積量分別為31.1、24.4 μg。與25℃培養(yǎng)條件下相比，4℃低溫處理時(shí)茶樹根系氟含量和累積量分別降低了49.8%、1.4%，均達(dá)顯著性差異（P＜0.05）。

2.5代謝抑制劑對(duì)茶樹吸收氟的影響

2.5.12，4-DNP

圖3　氯對(duì)茶樹吸收富集氟的影響Figure 3 Effect of chloride on absorption and accumulation of fluoride in tea plant

在2，4-DNP處理濃度分別為0.5、1 mmol·L-1和2 mmol·L-1的條件下，茶樹根系氟含量分別比對(duì)照降低了12.1%、16.1%和10.7%，達(dá)顯著差異（P＜0.05），茶樹根系氟的累積量分別為31.1、29.3μg和26.2μg，分別比對(duì)照降低了5.8%、6.5%和15.8%，但差異不是很顯著（圖5）。2.5.2正釩酸鈉

在正釩酸鈉處理濃度為0.2 mmol·L-1的條件下，茶樹根系氟的含量為172.3 mg·kg-1，對(duì)茶樹根部氟吸收的抑制效應(yīng)不明顯（圖6）。當(dāng)正釩酸鈉濃度為0.6 mmol·L-1時(shí)，茶樹根系氟含量、根系氟累積量分別為137.9 mg·kg-1、17.0 μg，分別比對(duì)照降低了20.6%、30.5%，達(dá)顯著差異水平（P＜0.05）。

2.5.3疊氮鈉

隨著疊氮鈉濃度的增加，茶樹根系氟含量逐漸降低（圖7）。在疊氮鈉濃度為0.05、0.1 mmol·L-1和0.2 mmol·L-1的情況下，茶樹根系氟含量分別為126.3、125.8 mg·kg-1和105.8 mg·kg-1，分別比對(duì)照降低了27.3%、27.5%和39.1%，達(dá)顯著差異水平（P＜0.05）。茶樹根系氟累積量為22.1、17.3、14.2 μg，分別比對(duì)照降低了28.8%、44.4%、54.3%，達(dá)顯著差異水平（P＜0.05）。

3　討論

圖4　溫度對(duì)茶樹吸收富集氟的影響Figure 4 Effect of temperature on absorption and accumulation of fluoride in tea plant

氟離子進(jìn)入茶樹根部可能是主動(dòng)運(yùn)輸過程，也可能通過被動(dòng)吸收或者自由擴(kuò)散，這取決于外界供氟條件［4，12］。彭傳燚等［4］研究得出，在0.1～10 mg·L-1的供氟濃度范圍內(nèi)，茶樹根系對(duì)氟離子的吸收是主動(dòng)吸收，并符合Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)模型，而在高供氟條件（50～100 mg·L-1）下則表現(xiàn)出被動(dòng)吸收的過程。Zhang等［12］的研究表明，氟濃度較低時(shí)，茶樹對(duì)氟的吸收可能存在一個(gè)與能量代謝相關(guān)的主動(dòng)吸收過程，氟濃度較高時(shí)，茶樹對(duì)氟的吸收隨外界氟濃度提高呈線性增長。本研究結(jié)果表明，在0～2.5 mmol·L-1的供氟濃度范圍內(nèi)，茶樹對(duì)氟的吸收為快速吸收階段，在2.5～5.0 mmol·L-1供氟濃度范圍內(nèi)為緩慢吸收階段，這一吸收過程可用Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)方程進(jìn)行描述，其中Vmax為13.9μg·g-·1h-（1根DW），Km為0.59 mmol·L-1。被動(dòng)吸收是一個(gè)非代謝擴(kuò)散過程，而主動(dòng)吸收是一個(gè)消耗能量，需要電化學(xué)勢質(zhì)子梯度和ATP結(jié)合蛋白-載體，或是受H+-ATP泵驅(qū)動(dòng)的過程［7］。本文從代謝能量、載體和質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力探究茶樹根部主動(dòng)吸收氟的途徑及其特征。

圖5　2，4-DNP對(duì)茶樹吸收富集氟的影響Figure 5 Effect of 2，4-DNP on absorption and accumulation of fluoride in tea plant

圖6　正釩酸鈉對(duì)茶樹吸收富集氟的影響Figure 6 Effect of Na3VO4on absorption and accumulation of fluoride in tea plant

圖7　疊氮鈉對(duì)茶樹吸收富集氟的影響Figure 7 Effect of NaN3on absorption and accumulation of fluoride in tea plant

載體蛋白是存在于細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)中起運(yùn)輸作用的蛋白質(zhì)，是生物體主動(dòng)吸收營養(yǎng)物質(zhì)或主動(dòng)排出代謝廢物時(shí)所必需的［13］。載體蛋白在離子跨膜吸收/外排過程中存在競爭和飽和作用。競爭作用是指某一營養(yǎng)元素（或離子）的存在，能抑制另一營養(yǎng)元素（或離子）的吸收。主要表現(xiàn)在陽離子與陽離子之間或陰離子與陰離子之間。例如：Natasha等［14］研究顯示，NO-3可能會(huì)競爭質(zhì)膜上的同一結(jié)合位點(diǎn)而抑制植物葉片中Cl-的濃度。Hopper等［15］研究顯示，SO2-4與SeO2-4之間由于競爭同一結(jié)合位點(diǎn)而存在競爭效應(yīng)。本文的研究結(jié)果表明，氯離子顯著降低了茶樹體內(nèi)氟含量和累積量，這可能是因?yàn)榉x子與氯離子之間存在競爭作用有關(guān)。飽和效應(yīng)是指植物吸收一種離子（或者化合物）達(dá)到最大吸收程度時(shí)，即使再增加相應(yīng)離子（或者化合物）也不再吸收的現(xiàn)象。如：Zhang等［16］研究表明，水稻根部吸收Se時(shí)達(dá)到飽和效應(yīng)，符合Michaelis-Menten米氏方程，其中Vmax為4.5 μmol·kg-1·h-1DW，Km為3.8 μmol·kg-1DW。Peter等［17］的研究數(shù)據(jù)表示，玉米根部吸收NO-3時(shí)，達(dá)到飽和動(dòng)力學(xué)方程，其中Km為0.05 mmol·L-1。本文結(jié)果顯示，在0～5.0 mmol·L-1氟濃度范圍內(nèi)，茶樹根部的吸收曲線符合Michaelis-Menten米氏方程，其中最大吸收速率Vmax為13.9 μg·g-1·h-1（根DW），米氏常數(shù)Km為0.59 mmol·L-1，說明茶樹根部在吸收氟離子時(shí)呈現(xiàn)出載體動(dòng)力學(xué)飽和效應(yīng)。上述兩種現(xiàn)象說明茶樹根部在低氟濃度時(shí)是一個(gè)需要載體的主動(dòng)吸收過程。

主動(dòng)吸收過程中能量的作用就是為離子主動(dòng)吸收提供所需的能源，主要來自ATP水解。低溫通過降低合成ATP所需的線粒體ATPase和丙酮酸激酶的活性，而使腺苷酸，尤其是ATP水平明顯下降，從而導(dǎo)致代謝過程發(fā)生紊亂，使ATP的利用速度明顯超過合成速度［18］。Liang等［8］研究顯示，低溫通過降低主動(dòng)吸收所需的ATP而抑制了黃瓜對(duì)硅的主動(dòng)吸收。Zhan等［19］的研究結(jié)果表明，低溫通過抑制能量代謝和膜運(yùn)輸過程來限制小麥對(duì)菲的主動(dòng)吸收過程。本文研究結(jié)果表明，在低溫（4℃）培養(yǎng)條件下，茶樹根系吸收氟離子過程受到明顯抑制，這可能是因?yàn)榈蜏匾种屏司€粒體ATPase活性，阻礙了ATP的合成，從而導(dǎo)致茶樹主動(dòng)吸收氟離子減少。

2，4-DNP作為一種主要的氧化磷酸化解偶聯(lián)劑，瓦解跨膜的質(zhì)子梯度，減少ATP合成所需的質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力，阻礙了ATP的合成。Liang等［8］報(bào)道，2，4-DNP通過氧化解偶聯(lián)作用，抑制了Si的吸收。Zhan等［19-20］也發(fā)現(xiàn)，2，4-DNP通過減少ATP的合成，抑制了污染物的吸收。本文研究結(jié)果顯示，2，4-DNP的加入，降低了茶樹根系對(duì)氟的吸收和累積，這可能與2，4-DNP使根系代謝過程氧化磷酸化作用解偶聯(lián)，ATP合成降低，減少能量供應(yīng)有關(guān)。

作為一種代謝抑制劑，疊氮鈉可抑制ATP水解，導(dǎo)致三磷酸腺苷形成的能量減少。Hiroshi等［21］研究表明，小于1.0 mmol·L-1的疊氮鈉可以抑制ATP的水解。焦新之等［22］發(fā)現(xiàn)，疊氮鈉降低根細(xì)胞的ATP水解，抑制了K+的吸收。本文研究結(jié)果表明，疊氮鈉抑制了茶樹對(duì)氟的吸收，可能是因?yàn)榀B氮鈉抑制了茶樹體內(nèi)ATP的水解，減少了茶樹根部吸收氟離子所需要的能量供應(yīng)。

離子跨膜吸收和主動(dòng)運(yùn)輸時(shí)主要依賴于H+-ATPase水解ATP在細(xì)胞膜內(nèi)外兩側(cè)建立起來的H+濃度梯度和電化學(xué)勢［20，23-24］。植物細(xì)胞膜H+-ATPase在激活養(yǎng)分離子、代謝產(chǎn)物跨膜運(yùn)輸方面起著重要的作用。質(zhì)膜H+-ATPase的主要作用是形成質(zhì)子電化學(xué)勢梯度，為跨膜吸收的離子提供質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力［25-26］。植物細(xì)胞內(nèi)具有較高的負(fù)電荷，而在細(xì)胞膜外具有較高的正電荷。植物吸收陰陽離子電化學(xué)勢的高低主要取決于化學(xué)勢梯度與電勢梯度的絕對(duì)值大小。正釩酸鈉主要是通過抑制H+-ATPase活性來阻礙質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力的形成，從而降低了細(xì)胞膜內(nèi)外H+濃度梯度和電化學(xué)勢［22］。Yin等［27］的研究發(fā)現(xiàn)，正釩酸鈉通過抑制H+-ATPase來減弱電化學(xué)勢，降低作物對(duì)污染物的吸收。Shen等［24］研究數(shù)據(jù)顯示，在大豆缺P狀態(tài)下，正釩酸鈉通過抑制質(zhì)膜H+-ATPase的活性，導(dǎo)致電化學(xué)勢降低，從而嚴(yán)重降低了大豆根系對(duì)P的吸收。我們的研究結(jié)果表明，隨著正釩酸鈉濃度的增加，茶樹根部氟含量和氟累積量也隨之不斷減少，這可能歸因于正釩酸鈉抑制了H+-ATPase的水解，減少了H+的產(chǎn)生，使茶樹根系主動(dòng)吸收所需的質(zhì)子（H+）梯度合成受阻，降低了茶樹根系質(zhì)膜內(nèi)外的質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力。

4　結(jié)論

在0～5.0 mmol·L-1的氟濃度范圍內(nèi)，茶樹對(duì)氟的吸收先后出現(xiàn)快速吸收和緩慢吸收兩個(gè)階段，吸收過程符合Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)模型。低溫條件（4℃）明顯抑制了茶樹對(duì)氟的吸收。代謝抑制劑2，4-DNP（解偶聯(lián)化，抑制ATP合成）、疊氮鈉（抑制ATP水解）和正釩酸鈉（抑制質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力形成）均抑制了茶樹根系對(duì)氟吸收。氯離子顯著降低了茶樹對(duì)氟的吸收，這可能與氯離子和氟離子競爭同一載體的吸附位點(diǎn)有關(guān)。由此可得，茶樹根系對(duì)氟的吸收是一個(gè)與跨質(zhì)膜電化學(xué)勢梯度、代謝能量和載體蛋白密切相關(guān)的主動(dòng)運(yùn)輸過程。

［1］Shu W S，Zhang Z Q，Lan C Y，et al.Fluoride and aluminium concentrations of tea plants and tea products from Sichuan Province，PR China［J］. Chemosphere，2003，52（9）：1475-1482.

［2］Yoshida T，F(xiàn)ujiwara T，Saito M，et al.Concentration and distribution measurements of fluorine in tea leaves by micro-PIGE［J］.International Journal of PIXE，2013，23：119-125.

［3］Gao H J，Zhang Z Z，Wan X C.Influences of charcoal and bamboo charcoal amendment on soil-fluoride fractions and bioaccumulation of fluoride in tea plants［J］.Environmental Geochemistry and Health，2012，34（5）：551-562.

［4］彭傳燚，陳靜，蔡薈梅，等.茶樹對(duì)氟的吸收動(dòng)力學(xué)特性研究［J］.熱帶作物學(xué)報(bào)，2013，34（3）：495-500. PENG Chuan-yi，CHEN Jing，CAI Hui-mei，et al.The kinetic characteristics of solution fluoride uptake by tea plant［J］.Chinese Journal of Tropical Crops，2013，34（3）：495-500.

［5］Ruan J Y，Ma L F，Shi Y Z，et al.The impact of pH and calcium on the uptake of fluoride by tea plants（Camellia sinensis L.）［J］.Annals of Botany，2004，93（1）：97-105.

［6］Zhang X C，Gao H J，Zhang Z Z，et al.Influences of different ion channel inhibitors on the absorption of fluoride in tea plants（Camellia sinesis L.）［J］.Plant Growth Regulation，2013，69（1）：99-106.

［7］童啟慶.茶樹栽培學(xué)［M］.中國農(nóng)業(yè)出版社，2000，344. TONG Qi-qing.Tea culture［M］.China Agriculture Press，2000，344.

［8］Liang Y C，Si J，R?mheld V.Silicon uptake and transport is an active process in Cucumis sativus［J］.New Phytologist，2005，167（3）：797-804.

［9］張顯晨，郜紅建，張正竹，等.茶葉氟化物提取方法對(duì)比與電位法測定條件優(yōu)化［J］.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，38（1）：27-30. ZHANG Xian-chen，GAO Hong-jian，ZHANG Zheng-zhu，et al.Comparison of extraction methods and potentiometric determination of fluoride in tea［J］.Journal of Anhui Agricultural University，2011，38（1）：27-30.

［10］郜紅建，張顯晨，蔡薈梅，等.水中氟化物測定過程中總離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)緩沖液的對(duì)比與優(yōu)化［J］.環(huán)境化學(xué)，2010，29（4）：754-758. GAO Hong-jian，ZHANG Xian-chen，CAI Hui-mei，et al.Comparison and optimization of total ionic strength adjustment buffer for the determination of fluoride in water［J］.Environmental Chemistry，2010，29 （4）：754-758.

［11］陸景陵，張福鎖，曹一平，等.植物營養(yǎng)學(xué)［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2003：79-92. LU Jing-ling，ZHANG Fu-suo，CAO Yi-ping，et al.Science of plant nutrition［M］.Beijing：China Agriculture University Press，2003：79-92.

［12］Zhang L，Li Q，Ma L F，et al.Characterization of fluoride uptake by roots of tea plants（Camellia sinensis（L.）O.Kuntze）［J］.Plant and Soil，2013，366（1）：659-669.

［13］Marschner H.Mineral nutrition of higher plants［J］.Advance in Horticultural Science，1995，9：153-154.

［14］Natasha L，Teakle&Stephen D，Tyerman.Mechanisms of Cl-transport contributing to salt tolerance［J］.Plant，Cell and Environment，2010，33（4）：566-589.

［15］Hopper J L，Parker D R.Plant availability of selenite and selenate as influenced by the competing ions phosphate and sulfate［J］.Plant and Soil，1999，210（2）：199-207.

［16］Zhang L H，Hu B，Li W，et al.OsPT2，a phosphate transporter，is involved in the active uptake of selenite in rice［J］.New Phytologist，2014，201（4）：1183-1191.

［17］Peter R，Mcclure Leon V，Kochian，et al.Evidence for cotransport of nitrate and protons in maize roots［J］.Plant Physiologist，1990，93：281-289.

［18］楊孝育，劉存德.水稻幼苗的低溫傷害及其與腺苷酸代謝的關(guān)系［J］.植物生理學(xué)報(bào)，1988，14（4）：344-349. YANG Xiao-yu，LIU Cun-de.Relationship between chilling injury and adenylate metabolism in rice seedlings［J］.Acta Phytophysiologica Sinica，1988，14（4）：344-349.

［19］Zhan X H，Ma H L，Zhou L X，et al.Accumulation of phenanthrene by roots of intact wheat（Triticum acstivnm L.）seedings：Passive or active uptake？［J］.BMC Plant Biology，2010，DOI：10.1186/1471-2229-10-52.

［20］Zhan X H，Zhang X B，Yin X M，et al.H+/phenanthrene symporter and aquaglyceroporin are implicated in phenanthrene uptake by wheat （Triticum aestivum L.）roots［J］.Journal of Environmental Quality，2012，41（1）：188-196.

［21］Hiroshi K，Masatomo M，Yasuhiro A.Membrane-bound adenosine triphosphatase of escherichia coli III.Effects of sodium azide on the enzyme functions［J］.Department of Botany，F(xiàn)aculty of Science，University of Tokyo，Bunkyo-ku，Tokyo，1977，113：1071-1077.

［22］焦新之，倪進(jìn)山.釩酸鈉、疊氮鈉對(duì)小麥根細(xì)胞K+吸收和質(zhì)膜K+-Mg2+-ATPase的作用［J］.實(shí)驗(yàn)生物學(xué)報(bào)，1982，15（4）：411-419. JIAO Xin-zhi，NI Jin-shan.Effect of vanadate and azide on K+uptake，H+extrusion and plasma membrane ATPase in wheat roots［J］.Acta Biologiae Experimentalis Sinica，1982，15（4）：411-419.

［23］Zhu Y Y，Zeng H Q，Shen Q R.Interplay among NH+4uptake，rhizosphere pH and plasma membrane H+-ATPase determine the release of BNIs in sorghum roots-possible mechanisms and underlying hypothesis ［J］.Plant and Soil，2012，358（1）：131-141.

［24］Shen H，Chen J H，Wang Z Y，et al.Root plasma membrane H+-ATPase is involved in the adaptation of soybean to phosphorous starvation ［J］.Journal of Experimental Bontany，2006，57（6）：1353-1362.

［25］Sze H，Li X，Palmgren M.Energization of plant cell membranes by H+-pumping ATPases：Regulation and biosynthesis［J］.Plant Cell，1999，11（4）：677-689.

［26］Chang C R，Hu Y B，Sun S B，et al.Proton pump OsA8 is linked to phosphorus uptake and translocation in rice［J］.Journal of Experimental Botany，2009，60（2）：557-565.

［27］Yin X M，Liang X，Xu G H，et al.Effect of phenanthrene uptake on membrane potential in roots of soybean，wheat and carrot［J］.Environmental and Experimental Botany，2014，99：53-58.

Apparent characteristics of active transmembrane uptake of fluoride by tea plant roots

WANG Yu-mei，CHAI Ru-shan，GAO Hong-jian*
（School of Resources and Environment，Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China）

Active fluoride（F）uptake by tea plant roots determines the accumulation of fluoride in tea leaves.Here a solution culture experiment was conducted to examine the characteristics of active transmembrane uptake kinetics of fluoride by tea plant roots through plasma membrane and to investigate the influences of low temperature，metabolic inhibitors and chloride on fluoride absorption.Results indicated that concentration-dependent F uptake in tea plant roots was characterized by a saturation curve that was fitted by the Michaelis-Menten model.The Vmaxand Kmvalues were 13.9 μg·h-1·g-1root dry weight and 0.59 mmol·L-1，respectively.Compared with 25℃，F(xiàn) accumulation in tea plant roots was decreased by 49.8%at 4℃.Metabolic inhibitors，such as 2，4-DNP，NaN3，and Na3VO4，significantly decreased the concentrations and content of F in tea plant roots in a concentration-effect manner.The amount of F in tea plant roots reduced by 16.1%，39.1%and 20.6%by 2 mmol·L-12，4-DNP，0.2 mmol·L-1NaN3and 0.6 mmol·L-1Na3VO4，respectively.At 5 mmol·L-1，chloride also significantly inhibited F absorption in tea plant roots，with 73.1%of inhibition.In summary，the uptake of F by tea plant roots is an active process that is related to the electrochemical potential gradient across the plasma membrane，metabolizable energy and carrier proteins.

tea plant；fluoride；low temperature；metabolic inhibitor；active uptake

S571.1

A

1672-2043（2016）08-1473-07

10.11654/jaes.2016-0094

2016-01-20

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（41071158，31272254）；安徽省杰出青年科學(xué)基金（1408085J01）

王玉梅（1989—），女，河南商丘人，碩士研究生，主要從事植物營養(yǎng)生理學(xué)研究。E-mail：ymwang1008@163.com

郜紅建E-mail：hjgao@ahau.edu.cn