施用沼液和接種叢枝菌根真菌對甘草生長及重金屬累積的影響

侯時季，李　濤，藺　閣，陳保冬（中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心城市與區(qū)域生態(tài)國家重點實驗室，北京 100085）

施用沼液和接種叢枝菌根真菌對甘草生長及重金屬累積的影響

侯時季，李濤，藺閣，陳保冬*
（中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心城市與區(qū)域生態(tài)國家重點實驗室，北京 100085）

甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch）是一種重要的補(bǔ)益中草藥。由于野生甘草面臨過度采擷和資源耗竭，人工種植甘草規(guī)模日益擴(kuò)大，發(fā)展低耗高效的甘草種植技術(shù)成為迫切需要。通過盆栽試驗考查了不同沼液添加水平（沼液/去離子水體積比：10/0、9/1、5/ 5、1/9及0/10）下，接種叢枝菌根（arbuscular mycorrhiza，AM）真菌Rhizophagus intraradices對甘草生長及重金屬累積的影響。試驗結(jié)果表明，AM真菌能夠?qū)Ω什莞敌纬闪己们秩?，菌根侵染率?5.0%～48.4%之間。AM真菌對甘草表現(xiàn)出顯著促生作用，接種處理使植株生物量、磷濃度及葉片葉綠素含量分別提高了171%～271%、64%～143%和98%～127%。施用沼液顯著提高了植株磷濃度和葉片葉綠素含量，在提高土壤有機(jī)質(zhì)含量和土壤全磷的同時，也增加了植物及土壤鉻、銅和鉛濃度。在沼液稀釋比為10/0和9/1水平下，植物鉻、銅和鉛濃度超標(biāo)，而接種AM真菌顯著降低了植株重金屬濃度至安全閾值以內(nèi)。施用沼液同時接種AM真菌可在促進(jìn)甘草生長的同時保障甘草品質(zhì)，因而在甘草人工種植中具有潛在應(yīng)用價值。

甘草；沼液；叢枝菌根真菌；土壤肥力

侯時季，李濤，藺閣，等.施用沼液和接種叢枝菌根真菌對甘草生長及重金屬累積的影響［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2016，35（8）：1465-1472.

HOU Shi-ji，LI Tao，LIN Ge，et al.Effects of biogas slurry and AM fungi on growth and heavy metal accumulation of licorice plants［J］.Journal of Agro-Environment Science，2016，35（8）：1465-1472.

甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch）為豆科（Leguminosae）甘草屬多年生草本植物，是一種重要的補(bǔ)益中草藥，同時也是制藥業(yè)以及食品保健業(yè)的重要原材料［1］。甘草適應(yīng)性強(qiáng)，具有耐旱、抗寒和耐鹽堿等優(yōu)良特性，因此是干旱和半干旱地區(qū)重要的植物資源，可作為地方經(jīng)濟(jì)作物或用于生態(tài)恢復(fù)［2］。近幾年來，隨著對甘草需求量的增多，野生甘草面臨著過度采擷和資源耗竭的威脅，甘草的人工種植日益受到重視并得到發(fā)展。然而，如何提高人工種植甘草的產(chǎn)量并保障產(chǎn)品品質(zhì)等諸多問題仍有待解決［3］。常規(guī)施肥能顯著提高甘草產(chǎn)量，但會增加人工種植成本，而且可能造成土壤板結(jié)［4］。沼液作為厭氧發(fā)酵的副產(chǎn)物，含有植物生長所需的多種養(yǎng)分，而且成本十分低廉。諸多試驗表明，沼液作為肥料施于土壤，可提高土壤中有機(jī)質(zhì)和礦質(zhì)養(yǎng)分含量，從而促進(jìn)農(nóng)作物增產(chǎn)［5-8］。不過，也有研究報道指出，因為厭氧發(fā)酵原料來源較為復(fù)雜，沼液中可能含有一定量的重金屬等有毒有害物質(zhì)，在施用過程中有二次污染風(fēng)險，進(jìn)而可能引起農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全問題［9-11］。

叢枝菌根（Arbuscular mycorrhiza，AM）真菌是廣泛存在于陸地生態(tài)系統(tǒng)中的一類土壤真菌，能與絕大多數(shù)陸地高等植物形成互惠共生體系［12］。AM根外菌絲網(wǎng)絡(luò)加強(qiáng)了土壤植物系統(tǒng)中的物質(zhì)循環(huán)、能量流動和信息傳遞，對于維持土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定具有不可替代的重要作用［12］。大量研究表明，AM共生體系能有效促進(jìn)宿主植物對礦質(zhì)養(yǎng)分（尤其是磷）的吸收與利用，因而對宿主植物具有重要促生作用［13-15］。此外，AM真菌還能通過不同途徑影響植物對重金屬的吸收和累積，減輕重金屬對植物的毒害［16］。在重金屬污染土壤中，AM共生體系能夠?qū)λ拗髦参锂a(chǎn)生保護(hù)效應(yīng)，這對于降低重金屬污染風(fēng)險及修復(fù)污染土壤均具有重要意義［17］。

已有研究表明，接種AM真菌能夠促進(jìn)甘草生長［18］。然而，施用沼液結(jié)合接種AM真菌能否協(xié)同促進(jìn)甘草生長并有效控制重金屬污染風(fēng)險，尚未見報道?；诖耍狙芯客ㄟ^室內(nèi)盆栽試驗考察不同沼液添加水平及接種AM真菌對甘草生長以及土壤理化性質(zhì)的影響，以期為建立高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)高效的甘草人工種植體系提供技術(shù)支撐。

1　材料與方法

1.1試驗材料

供試植物：烏拉爾甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch）種子從新疆康隆農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司購得。

菌劑：AM真菌（Rhizophagus intraradices B?aszk.，Wubet，Renker，and Buscot BGC AH01）原始菌劑由北京市農(nóng)林科學(xué)院植物營養(yǎng)與資源研究所提供。試驗用菌劑通過盆栽苜蓿擴(kuò)繁獲得，接種劑為含有菌根真菌孢子、宿主植物根段以及培養(yǎng)基質(zhì)的混合物，每克菌劑大約含有80個孢子。

培養(yǎng)基質(zhì)：供試土壤取自內(nèi)蒙古多倫（42°02′N，116°17′E），其基本理化性質(zhì)如下：pH 7.02（土水比，1∶2.5），有機(jī)質(zhì)含量1.78%，最大田間持水量24.24%，速效磷6.73 mg·kg-1，總氮0.85 g·kg-1。測定方法參考鮑士旦（2000）。土壤過2 mm篩后，送至中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院原子能所輻照中心進(jìn)行輻照滅菌（60Co，γ射線25 kGy）。培養(yǎng)基質(zhì)為土壤和石英砂（過2 mm篩）按質(zhì)量比1∶1混合而成。除非特別注明，文中“土壤”即指此混合培養(yǎng)基質(zhì)。

沼液來源：沼液是由內(nèi)蒙古自治區(qū)鄂爾多斯市東勝區(qū)工業(yè)和生活垃圾分選出的有機(jī)物料經(jīng)過厭氧發(fā)酵過濾后得到的液體。沼液pH 7.6，有機(jī)質(zhì)含量0.46%，總磷25.9 mg·L-1，總氮1146 mg·L-1，鉻185.8 mg·L-1，銅276.8 mg·L-1，鉛313.0 mg·L-1，鋅62.1 mg· L-1，鎘0.036 mg·L-1，砷0.023 mg·L-1。沼液過濾后經(jīng)高壓蒸汽滅菌（121℃，30 min）待用。

1.2試驗設(shè)計

1.2.1接種處理和沼液處理

以容積700 mL的PVC管（口徑7 cm，高19 cm）為培養(yǎng)容器。接種處理每盆加入800 g土壤和20 g接種劑，而非接種處理每盆加入800 g土壤和20 g滅菌處理后的接種劑，并添加15 mL菌種濾液，以保證除AM真菌之外接種和不接種處理有基本一致的微生物群落。

甘草種子經(jīng)催芽處理，每盆播種3顆種子，出苗后2周每盆間留一株幼苗。自出苗后第25 d開始，每10 d按不同沼液稀釋比添加一次沼液，每次添加10 mL，在植物收獲前總共添加5次，最后一次于收獲前10 d添加。試驗設(shè)置5個沼液濃度梯度，沼液稀釋比（沼液/去離子水體積比）分別為10/0、9/1、5/5、1/9、0/10。參照農(nóng)田灌溉水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)GB 5084—1992，沼液稀釋比（沼液/去離子水體積比）為10/0、9/1、5/5時，該沼液中鉻、銅和鉛含量超標(biāo)，因此本試驗考慮將這三種重金屬的含量作為評判土壤污染及植物重金屬毒害的分析指標(biāo)。在每個沼液濃度下設(shè)接種菌根真菌（Mycorrhiza）和不接種對照（Control）處理。總共10個處理，每個處理重復(fù)4次。試驗過程中所有盆缽?fù)耆S機(jī)排列且每周定期重排。

1.2.2試驗管理

試驗在人工氣候室中進(jìn)行。試驗期間室內(nèi)晝夜溫度為25℃/20℃，每天光照時間16 h，光強(qiáng)約700 μmol·m-·2s-1，相對濕度60%。每日稱重澆水保持土壤15%的含水量（大約田間持水量的60%）。

1.3測定指標(biāo)及方法

植物生長75 d后，分別收獲地上部和根系，并取土樣。植物樣品用去離子水清洗干凈，取新鮮根系（0.5 g）用作菌根侵染強(qiáng)度測定，另取新鮮葉片（0.5 g）用作葉片葉綠素含量測定，其余植物樣品于105℃殺青30 min，然后于70℃烘干48 h至恒重后稱取干重。葉片葉綠素含量采用比色法測定。植物磷和重金屬（Cr、Cu、Pb）濃度的測定采用微波消解進(jìn)行樣品前處理，ICP-MS（7500a Agilent Technologies，Palo Alto，CA，USA）進(jìn)行樣品分析，同時采用國家一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)灌木枝葉（GBW07603）進(jìn)行分析質(zhì)控。甘草根系菌根侵染狀況采用Trypan blue染色-鏡檢法［19］觀測，用方格交叉法計算菌根侵染率［20］。

土壤有機(jī)質(zhì)含量采用重鉻酸鉀氧化法測定。土壤全磷和重金屬（Cr、Cu、Pb）含量采用微波消解進(jìn)行樣品前處理，ICP-MS進(jìn)行樣品分析，同時采用中國地質(zhì)科學(xué)院地球物理化學(xué)勘探研究所的土壤標(biāo)準(zhǔn)樣品（GBW07406）進(jìn)行分析質(zhì)控。

1.4數(shù)據(jù)分析

采用SPSS（SPSS18.0forWindows，SPSSInc，Chicago，USA）和Microsoft Excel對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析和作圖。采用雙因素方差分析檢驗接種處理、沼液處理及二者交互作用的顯著性。當(dāng)交互作用顯著時，采用最小顯著性差異法（LSD）將全部處理統(tǒng)一進(jìn)行多重比較。當(dāng)接種處理與沼液處理交互作用不顯著時，則將試驗數(shù)據(jù)按試驗因素分組進(jìn)行多重比較。

2　結(jié)果與分析

2.1菌根侵染情況

試驗條件下，AM真菌對甘草根系形成良好侵染，接種處理菌根侵染率在25.0%～48.4%之間，而對照處理未觀測到菌根侵染跡象（表1）。添加沼液處理顯著降低了菌根侵染率，菌根侵染率總體上隨沼液濃度的升高而降低。未添加沼液處理（0/10）菌根侵染率最高，約為沼液原液處理（10/0）的2倍。

表1　不同處理下甘草菌根侵染率Table 1 Mycorrhizal colonization rates of licorice plants under different experimental treatments

2.2植物生長及磷營養(yǎng)狀況

總體上，接種處理顯著提高了甘草生物量、磷濃度及葉片葉綠素含量（圖1）。相同沼液處理下，接種處理植物地上部干重、根系干重、地上部磷濃度、根系磷濃度及葉片葉綠素含量與對照相比分別提高264%～330%、39%～256%、22%～128%、127%～156%和98%～127%。沼液處理顯著提高了根系磷濃度和葉片葉綠素含量，沼液稀釋比10/0和9/1處理下根系磷濃度和葉片葉綠素含量顯著高于其他沼液添加水平。接種處理和添加沼液對根系生物量、地上部磷濃度和葉片葉綠素含量存在顯著交互作用（表2）。沼液稀釋比10/0 和9/1處理下，接種處理根系生物量及地上部磷濃度顯著高于其他處理，而沼液稀釋比10/0處理下接種處理的葉綠素含量顯著高于其他處理?？傮w上在高濃度沼液處理下，接種處理和對照處理之間的差異相比低濃度沼液處理下的差異更為顯著。

2.3植株重金屬濃度

總體上甘草植株中3種重金屬濃度隨沼液濃度升高而升高，添加沼液處理使地上部Cr、Cu和Pb濃度分別提高了10%～107%、55%～209%和23%～480%，使根系Cr、Cu和Pb濃度分別提高了19%～110%、17%～172%和50%～343%（表3）。與此相對照，接種處理顯著降低了植株中3種重金屬的濃度，地上部Cr、Cu和Pb濃度分別降低了27%～40%、22%～70%和22%～38%，根系Cr、Cu和Pb濃度分別降低了21%～31%、8%～20%和18%～22%（表3）。

圖1　不同處理下甘草植株生物量（A）、磷濃度（B）及葉片葉綠素含量（C）Figure 1 Plant dry weights（A），P concentrations（B）and leaf chlorophyll content（C）of licorice plants under different experimental treatments

表2　甘草植株生物量、磷濃度及葉片葉綠素含量方差分析結(jié)果Table 2 Two-way ANOVA outputs of dry weights，P concentrations and leaf chlorophyll contents of licorice plants

2.4土壤化學(xué)性質(zhì)

添加沼液處理顯著提高了土壤有機(jī)質(zhì)和全磷含量，增加幅度分別為5%～21%和5%～28%（表4）。接種處理只在沼液稀釋比9/1、5/5和1/9水平下顯著提高了土壤有機(jī)質(zhì)含量。

添加沼液顯著提高了土壤中重金屬濃度，使土壤Cr、Cu和Pb濃度分別提高了1%～11%、1%～14%和2%～15%（表5）。接種處理對土壤重金屬含量無明顯影響。

3　討論

表3　不同處理下甘草重金屬濃度Table 3 Heavy metal concentrations in licorice under different experimental treatments

表4　不同處理下土壤有機(jī)質(zhì)及全磷含量Table 4 Soil organic matter and total P content under different experimental treatments

試驗結(jié)果顯示，施用沼液顯著抑制了AM真菌對甘草的侵染（表1）。這可能是由于沼液中富含養(yǎng)分物質(zhì)抑制了菌根共生體的發(fā)育，也可能是沼液中所含的重金屬等毒性物質(zhì)對菌根共生體系的建成和發(fā)育產(chǎn)生了直接抑制作用。很多研究表明，土壤養(yǎng)分（尤其是磷）含量對AM真菌生長和菌根共生體發(fā)育具有顯著影響［21-22］。另一方面，重金屬的植物毒性和對AM真菌的直接生理毒害，也會抑制菌根侵染［23-24］。盡管如此，本試驗中添加沼液并未完全抑制AM真菌侵染，甚至在施用最高濃度沼液情況下，菌根侵染率仍維持在25%左右，表明AM真菌具有較強(qiáng)的耐逆能力。

表5　不同處理下土壤重金屬濃度Table 5 Soil heavy metal content under different experimental treatments

總體上，AM共生體系對甘草表現(xiàn)出顯著促生作用，接種處理大幅度地提高了植物生物量（圖1A），與之前很多有關(guān)AM真菌促進(jìn)宿主植物生長的研究結(jié)果一致［25-26］。多數(shù)研究表明，AM真菌對植物的促生作用與其改善植物磷營養(yǎng)狀況密不可分［27］。AM根外菌絲可直接從土壤中吸收無機(jī)磷，同時菌根分泌物（如磷酸酶和有機(jī)酸等）也能礦化有機(jī)磷，因而能夠幫助宿主植物獲取生長所需的磷素［27-28］。接種處理顯著提高了甘草地上部和根系磷濃度（圖1B），也很好地解釋了菌根對植物的促生作用。另一方面，光合作用是植物成長過程中的基礎(chǔ)代謝過程，植物光合作用強(qiáng)弱與葉片葉綠素含量直接相關(guān)。眾多研究發(fā)現(xiàn)，菌根共生體系能通過提高葉片葉綠素含量來增強(qiáng)植物光合作用［29-32］。本試驗中接種處理顯著提高了葉片葉綠素含量（圖1C），顯然對植物生長也起到促進(jìn)作用。

盡管在沼液稀釋比10/0和9/1處理下甘草根系磷濃度顯著升高（圖1B），但單獨施用沼液并未顯著促進(jìn)甘草生長（圖1A）。這可能是由于沼液中所含重金屬對甘草生長產(chǎn)生抑制作用，一定程度上抵消了改善磷營養(yǎng)的積極作用。此外，沼液中養(yǎng)分形態(tài)多為有機(jī)組分不易為植物利用（植物主要吸收無機(jī)養(yǎng)分），而只有在菌根真菌的幫助下才能有效活化利用這部分養(yǎng)分。不過，適量施用沼液促進(jìn)植物生長的潛力仍是不容忽視的，特別是本試驗中添加沼液和接種AM真菌對根系生物量、根系磷濃度以及葉片葉綠素含量表現(xiàn)出顯著交互作用，在高濃度沼液處理下，AM真菌的促生作用更為顯著（圖1），表明沼液和AM真菌能夠協(xié)同促進(jìn)甘草生長。大量研究表明，由于AM真菌對植物的促生作用主要與促進(jìn)植物磷吸收有關(guān)，當(dāng)培養(yǎng)基質(zhì)中磷含量增加但植物利用效率較低的情況下，AM真菌可通過對磷的特殊活化吸收及轉(zhuǎn)運機(jī)制［27］，有效改善植物磷營養(yǎng)，最終促進(jìn)宿主植物生長。

作為一種藥用植物，甘草主要用于醫(yī)藥及食品行業(yè)，因此甘草植株重金屬含量和甘草相關(guān)產(chǎn)品的安全性密切相關(guān)。本試驗表明，盡管沼液能提升土壤肥力并促進(jìn)甘草生長，但因其含有一定量的重金屬而為甘草生產(chǎn)埋下安全隱患［9，11，33］，尤為重要的則是防患于未然。盡管本試驗所用沼液具有污染土壤的風(fēng)險，但按一定配比稀釋后施用，土壤重金屬濃度均在國家土壤質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)GB 15618—2008安全范圍內(nèi)。然而，需要注意的是由于土壤重金屬污染具有累積效應(yīng)，而本試驗僅向土壤中添加了5次沼液，若增加添加次數(shù)則有可能超出土壤安全閾值。后續(xù)工作還需要明確在保障土壤安全前提下允許的沼液添加量。

本試驗中甘草植株Cr、Cu、Pb濃度均隨沼液濃度的升高而升高，且在沼液稀釋比9/1處理下，未接種甘草地上部Cr、根系Cu和Pb分別超出《中國藥典》甘草重金屬含量安全標(biāo)準(zhǔn)（2015年版）8%、3%和5%；在沼液稀釋比10/0處理下，未接種甘草地上部Cr、Cu、Pb和根系Cu、Pb分別超出安全標(biāo)準(zhǔn)13%、33%、13%、21%和11%。與此相對照，接種AM真菌使甘草地上部和根系Cr、Cu、Pb大幅度下降（表3），并且接種處理下植株Cr、Cu和Pb濃度均在安全范圍以內(nèi)。眾多研究發(fā)現(xiàn)，AM能影響土壤中重金屬的生物有效性，并通過不同途徑影響植物對重金屬的吸收和累積［17］。菌根能夠通過菌絲體的吸附固持作用，強(qiáng)化根系對重金屬的屏障效應(yīng)，降低植物體內(nèi)重金屬濃度［34-35］。盡管也有一些研究表明，在特定條件下菌根共生體系可能促進(jìn)植物對重金屬的吸收并提高植物體內(nèi)重金屬濃度［36-37］，但本試驗證實AM能有效降低甘草重金屬濃度，從而消除或降低施用沼液可能帶來的重金屬污染風(fēng)險。因此，施用沼液和接種AM真菌相結(jié)合在很大程度上有利于建立經(jīng)濟(jì)安全高效的甘草人工種植體系。

4　結(jié)論

沼液和AM真菌聯(lián)合應(yīng)用能夠協(xié)同促進(jìn)甘草生長，同時保障甘草重金屬含量在安全范圍內(nèi)。本研究為構(gòu)建高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)高效的甘草種植體系提供了一種可能的技術(shù)途徑?？紤]到本試驗周期較短（76 d），而甘草是多年生植物，仍有必要開展長期試驗及更接近自然情形的田間試驗，系統(tǒng)研究沼液和AM真菌應(yīng)用于甘草種植和生產(chǎn)體系的綜合效益。

致謝：感謝國家科技支撐計劃（2012BAC25B03-3）對本研究的支持。

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Effects of biogas slurry and AM fungi on growth and heavy metal accumulation of licorice plants

HOU Shi-ji，LI Tao，LIN Ge，CHEN Bao-dong*
（State Key Laboratory of Urban and Regional Ecology，Research Center for Eco-Environmental Sciences，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100085，China）

Licorice（Glycyrrhiza uralensis Fisch）is a widely used Chinese medicinal herb.Due to irrational exploration of wild plants，intensive cultivation of licorice plants becomes a popular practice，and technological development for promoting plant growth and ensuring product safety becomes an urgent need.In the present study，a pot experiment was conducted to investigate the growth promoting effects of biogas slurry and arbuscular mycorrhizal（AM）fungi on licorice plants.Biogas slurry was applied at different dilution rates（biogas slurry/deionized water，v/ v=10/0，9/1，5/5，1/9，0/10），while licorice plants were inoculated with/without AM fungus Rhizophagus intraradices at each biogas slurry application rate.The experimental results indicated that licorice roots could be well colonized by R.intraradices with mycorrhizal colonization percentages ranging from 25.0%to 48.4%which decreased with increasing biogas slurry concentrations.Mycorrhizal inoculation significantly increased plant biomass（by 171%～271%），P concentration（by 64%～143%）and leaf chlorophyll content（by 98%～127%）.On the other hand，application of biogas slurry also noticeably increased root P concentration，leaf chlorophyll content，soil organic matter and P contents；but increased plant and soil heavy metal concentrations.Under biogas slurry dilution rate of 10/0 and 9/1，Cr，Cu and Pb concentrations in plants exceeded safety limit，while mycorrhizal inoculation significantly decreased plant Cr，Cu and Pb concentrations to meet the quality standard of herbal medicine.The study provided solid evidence for the growth promoting effect of biogas slurry in combination with AM fungi on licorice plants，and supported their potential use in intensive cultivation of this medicinal plants.

licorice；biogas slurry；arbuscular mycorrhizal（AM）fungi；soil fertility

S567.7

A

1672-2043（2016）08-1465-08

10.11654/jaes.2016-0117

2016-01-24

國家科技支撐計劃（2012BAC25B03-3）

侯時季（1990—），女，山東煙臺人，碩士研究生，從事叢枝菌根真菌應(yīng)用方面的研究。E-mail：houshiji61@sina.cn

陳保冬E-mail：bdchen@rcees.ac.cn