培養(yǎng)基配方對冬蟲夏草菌株產(chǎn)生粉紅異變的影響研究

張宗豪，李玉玲（青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，西寧810016）

培養(yǎng)基配方對冬蟲夏草菌株產(chǎn)生粉紅異變的影響研究

張宗豪，李玉玲*
（青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，西寧810016）

冬蟲夏草真菌篩選過程中，蝙蝠蛾擬青霉SH-1的菌絲會逐漸產(chǎn)生粉紅色變化，SH-1和粉紅菌株ZH-1在形態(tài)上存在很大差異，經(jīng)分子鑒定，兩株菌為同一種。為查明產(chǎn)生粉紅菌株的原因，最大化粉紅菌株的得率，在考察4個培養(yǎng)基配方因素對粉紅菌株產(chǎn)生的的單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法中的BBD設(shè)計(jì)優(yōu)化冬蟲夏草培養(yǎng)基配方，分析影響菌株SH-1產(chǎn)生粉色變化的因素。結(jié)果表明：產(chǎn)生ZH-1最適的培養(yǎng)基配方為氮源A（x1）43.51 mL，K2HPO4（x2）0.6g、氮源B（x3）2.56g、葡萄糖（x4）5.18g。在此培養(yǎng)基配方條件下，菌株ZH-1產(chǎn)生概率為37.24%。試驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)基配方中氮源A、K2HPO4的含量對產(chǎn)生粉紅現(xiàn)象有顯著影響，氮源A、葡萄糖含量對粉紅菌株ZH-1的得率有顯著影響。

響應(yīng)面法；冬蟲夏草菌株；培養(yǎng)基配方；粉紅變化；產(chǎn)生概率；得率

冬蟲夏草［Cordycepssinensis（BerK.）Sacc.］屬真菌界（Fungi）子囊菌綱（Asocmycotetes）肉座菌目（Clavicipitales）麥角菌科（Clvaieipiacteae）冬蟲夏草屬（Cordyceps）的冬蟲夏草菌（Cordycepssinenss）寄生在蝙蝠娥科昆蟲幼蟲上的子座及幼蟲尸體的復(fù)合體［1］，《中華人民共和國藥典》對其功用的描述是：“補(bǔ)肺益腎，止血化痰。用于久咳虛喘，陽痿遺精，腰膝酸痛”。冬蟲夏草主要分布在我國青海、西藏、四川、甘肅等海拔3 000—5 000 m的部分地區(qū)，冬蟲夏草是主產(chǎn)區(qū)群眾經(jīng)濟(jì)財(cái)源的重要組成部分［2］。近年來冬蟲夏草采挖嚴(yán)重過度，使冬蟲夏草野生資源瀕臨枯竭，野生冬蟲夏草生產(chǎn)面積正在逐年縮小，產(chǎn)量也隨之下降［3］。

冬蟲夏草人工培育的菌絲體成份、含量與天然冬蟲夏草非常相似，是天然冬蟲夏草最適替代品［4］。在本實(shí)驗(yàn)室靜止培育冬蟲夏草菌株SH-1的過程中，發(fā)現(xiàn)部分培養(yǎng)瓶內(nèi)菌絲體生長到一定時期，從中間開始轉(zhuǎn)化成粉紅色，逐步蔓延到瓶壁，原先的粗糙表面變成有張力、有韌性的光滑表面，富含水分，周圍又形成多層毛刺狀結(jié)構(gòu)。隨著生長瓶內(nèi)培養(yǎng)物逐漸形成一個整體，周圍與瓶壁緊密結(jié)合，培養(yǎng)物顏色鮮艷，整體呈果凍狀。將產(chǎn)生變化后的粉紅色菌株編號為ZH-1。

圖1　菌株SH-1和粉紅菌株　ZH-1Fig.1　Comparison ofstrainsH-1 and pinkstrain ZH-1

菌株SH-1與粉紅菌株ZH-1的ITS序列比對鑒定中發(fā)現(xiàn)，11株SH-1和2株ZH-1都能擴(kuò)增出條帶，條帶清晰且穩(wěn)定，13株菌株在Genbank中應(yīng)用Blast比對，與Paecilomycessp.Cs-4（EU328187）的相似性達(dá)到了100%，用三種方法（鄰位相連法、最大可能性法、最大簡約性法）對13株菌株ITS序列與分離自冬蟲夏草的32株真菌ITS序列（下載自Genbank）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，三種方法都顯示13株菌與蝙蝠蛾擬青霉分為一支，可以確定粉紅菌ZH-1與正常菌株SH-1為同一個種，即蝙蝠蛾擬青霉。

粉紅色變化影響到了SH-1的正常生長，為了查明產(chǎn)生的原因，本試驗(yàn)針對培養(yǎng)過程中與菌株生長有直接關(guān)系的培養(yǎng)基配方進(jìn)行研究，利用響應(yīng)面法尋找配方組合對粉紅菌株產(chǎn)生的影響。Box-Behnken設(shè)計(jì)結(jié)合響應(yīng)面法是通過采用多元線性擬合或二項(xiàng)式回歸分析來表達(dá)因素與響應(yīng)值之間函數(shù)關(guān)系的一種統(tǒng)計(jì)方法［5］，且可以明確任意兩個因素的交互作用影響，結(jié)果直觀、可靠，且試驗(yàn)效果好。

本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選擇氮源A、K2HPO4、氮源B、葡萄糖4個主要因素（為了保密培養(yǎng)基配方，兩種氮源標(biāo)記為：氮源A與氮源B），考察了4個因素對粉紅菌株ZH-1產(chǎn)生概率和得率和SH-1得率的影響，對影響粉紅菌株產(chǎn)生概率和得率的配方因素進(jìn)行了優(yōu)化，以期找出適合粉紅菌株生長的最適配方條件，為下一步闡明兩個菌株之間的關(guān)系和初步探討產(chǎn)生的機(jī)理提供數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

供試菌種：冬蟲夏草菌由青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院純化培養(yǎng)，編號為SH-1，經(jīng)中科院微生物研究所鑒定為蝙蝠蛾擬青霉，保存于本研究室。

主要儀器：組培瓶、高壓滅菌鍋、超凈工作臺、多功能光照培養(yǎng)箱、FA1004電子分析天平。

分離用固體培養(yǎng)基（改良PDA培養(yǎng)基）：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15—20g，自來水1 000 mL，自然pH，添加3g牛肉膏。

培養(yǎng)用液體培養(yǎng)基：每200 mL溶液中，土豆20g、胡蘿卜10g、氮源A 40 mL、氮源B 5g、葡萄糖8g、MgSO40.1g、K2HPO40.4g。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1培養(yǎng)條件

冬蟲夏草菌液體培養(yǎng)條件設(shè)定為：500 mL的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)液200 mL、接種量為10 mL、pH 5.8，培養(yǎng)溫度為20℃，光照條件為自然光照，培養(yǎng)時間為60d。單因素試驗(yàn)每個處理134瓶，重復(fù)3次。響應(yīng)面試驗(yàn)每個處理20瓶，重復(fù)3次。

1.2.2菌絲體生物量的測定

每個處理菌絲體在生長到60d以后，收集已長成菌塊的菌絲體，用蒸餾水洗滌3次，60℃條件下干燥至恒重，測定即為菌絲體干重。

1.2.3產(chǎn)生概率和得率的計(jì)算

式中：M為收取的菌絲體干重（g），V為平均裝液量（mL）。

1.2.4單因素和響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)

由單因素試驗(yàn)考察氮源A、氮源B、K2HPO4、葡萄糖對粉紅菌株產(chǎn)生的影響，再通過4因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果，確定產(chǎn)生粉紅菌株的最適配方條件以及影響SH-1與ZH-1得率的最適配方條件。試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1　試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)表Table 1　Liner equations and factors of four formula components

1.2.5數(shù)據(jù)處理

利用EXCEL 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，Design-expert 8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面法分析。

2　結(jié)果與分析

2.1冬蟲夏草菌培養(yǎng)基配方單因素試驗(yàn)

2.1.1氮源A對產(chǎn)生粉紅菌株的影響

固定氮源B 5g、葡萄糖8g、K2HPO40.5g，選擇氮源A含量分別為20 mL、40 mL、60 mL、80 mL進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見圖2、圖3。

圖2　不同氮源A含量對SH-1產(chǎn)生　ZH-1變化概率的影響Fig.2　Effects ofdifferent nitrogensource A content on fungi change probability ofsH-1 to ZH-1

圖3　不同氮源A含量對SH-1和ZH-1得率的影響Fig.3　Effects ofdifferent nitrogensource A content on fungi yield ofsH-1 and ZH-1

由圖2可知，在氮源A含量為40 mL時SH-1產(chǎn)生ZH-1的變化概率最大，圖3顯示，隨著氮源A含量的增加，ZH-1的得率也在增加，在60 mL時的得率與20 mL、40 mL時有顯著差異，與80 mL沒有顯著差異。SH-1的得率也隨著氮源A含量的增加而增加，并且每個梯度都有顯著差異，因此，綜合考慮到粉紅色變化概率和ZH-1的得率，選擇氮源A含量為40 mL為宜。

2.1.2K2HPO4對粉紅菌株產(chǎn)生的影響

固定氮源A 40 mL、氮源B 5g、葡萄糖8g、，選擇K2HPO4含量分別為0.2g、0.4g、0.6g、0.8g、1.0g進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見圖4和圖5。

圖4　不同　K2HPO4含量對SH-1產(chǎn)生　ZH-1變化概率的影響Fig.3　Effects ofdifferent K2HPO4content on fungi change probability ofsH-1 to ZH-1

圖　5 不同　K2HPO4含量對SH-1和ZH-1得率的影響Fig.4　Effects ofdifferent K2HPO4content on fungi yield ofsH-1 and ZH-1

由圖4可知，在K2HPO4含量為0.4g時SH-1產(chǎn)生ZH-1的變化概率最大，圖5顯示，隨著K2HPO4含量的增加，ZH-1的得率先增加后減小，得率差異不顯著。SH-1的得率隨著K2HPO4含量的增加有所增加，得率差異也不顯著，因此，選擇K2HPO4含量為0.4g為宜。

2.1.3氮源B對粉紅菌株產(chǎn)生的影響

固定氮源A 40 mL、K2HPO40.4g、葡萄糖8g、，選擇氮源B含量分別為1g、2g、3g、4g、5g進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見圖6、圖7。

圖6　不同氮源B含量對SH-1產(chǎn)生ZH-1變化概率的影響Fig.6　Effects ofdifferent nitrogensource B content on fungi change probability ofsH-1 to ZH-1

圖7　不同氮源B含量對SH-1和ZH-1得率的影響Fig.7　Effects ofdifferent nitrogen source B content on fungi yield of SH-1 and ZH-1

由圖6可知，在氮源B含量為2g時SH-1產(chǎn)生ZH-1的變化概率最大，圖7顯示，隨著氮源B含量的增加，ZH-1和SH-1的得率也隨之增加，并且每個梯度都有顯著差異，因此，選擇氮源B含量為2g為宜。

2.1.4葡萄糖對粉紅菌株產(chǎn)生的影響

固定氮源A 40 mL、K2HPO4含量0.4g、氮源B 5g，選擇葡萄糖含量分別為2g、4g、6g、8g、10g進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見圖8、圖9。

由圖8可知，在葡萄糖含量為4g時SH-1產(chǎn)生ZH-1的變化概率最大，圖9顯示，隨著葡萄糖含量的增加，ZH-1和SH-1的得率也先增后減，ZH-1在葡萄糖含量為6g時出現(xiàn)最大值，與其他梯度相比，差異顯著，而SH-1在葡萄糖含量為8g時出現(xiàn)最大值。因此，選擇葡萄糖含量為6g為宜。

2.2響應(yīng)面法試驗(yàn)結(jié)果

通過上述的單因素分析，我們篩選出了氮源A（x1）、K2HPO4（x2）、氮源B（x）、葡萄糖（x4）4個主要因素，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)結(jié)合響應(yīng)面法，以菌株SH-1變化為菌株ZH-1概率和ZH-1的得率為響應(yīng)值，考察影響產(chǎn)生粉紅菌株的培養(yǎng)基配方因素，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

圖8　不同葡萄糖含量對SH-1產(chǎn)生　ZH-1變化概率的影響Fig.8　Effects ofdifferentglucose content on fungi change probability ofsH-1 to ZH-1

圖9　不同葡萄糖含量對SH-1和ZH-1得率的影響Fig.9　Effects ofdifferentglucose content on fungi yield ofsH-1 and ZH-1

表2　試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果（n=4）Table 2　Optimization of extraction condition and Results of experiment（n=4）

表3　配方條件對粉紅菌株ZH-1產(chǎn)生概率與得率模型方差分析結(jié)果Table 3　The model variance analysis results of change probability and fungi yield ofstrain ZH-1

根據(jù)表3中回歸模型的方差分析可知，模型1的F=66.99，P＜0.0001，模型2的F=222.52，P＜0.0001，說明本試驗(yàn)所選用的二次多項(xiàng)式模型具有高度的顯著性。模型1的F失擬=0.291667，失擬項(xiàng)P= 0.9481＞0.05，模型2的F失擬=0.36095，失擬項(xiàng)P=0.9129＞0.05，失擬項(xiàng)均不顯著，兩個模型的決定系數(shù)R2值分別為0.9857和0.9955，說明兩個模型能夠解釋98.57%和99.55%的響應(yīng)值變化。因此，該模型擬合程度較好，可以用此模型來分析和預(yù)測菌株ZH-1的產(chǎn)生概率和得率。在總的作用因素中，回歸方程一次項(xiàng)x1、x2、二次項(xiàng)和交互項(xiàng)對菌株ZH-1的產(chǎn)生概率均有較高的顯著性，由F值的大小可以推斷2個因素影響y1的排序?yàn)椋簒1＞x2；回歸方程一次性x1、x4、二次項(xiàng)和交互項(xiàng)x1x3對菌株ZH-1的得率均有較高的顯著性，由F值的大小可以推斷2個因素影響菌株y2的排序?yàn)椋簒1＞x4。

試驗(yàn)所選用的四個因素，不僅影響到菌株SH-1產(chǎn)生菌株ZH-1的概率，而且對粉紅菌株ZH-1得率有影響。分別以y1、y2為響應(yīng)值，以x1、x2、x、x4為因變量，通過擬合可求出影響因素的一次效應(yīng)、二次效應(yīng)及其交互效應(yīng)的關(guān)聯(lián)方程，多元回歸擬合分析如下。

產(chǎn)生粉紅菌株ZH-1概率的二次方程模型為：

產(chǎn)生粉紅菌株ZH-1得率的二次方程模型為：

2.3因素間的交互影響

根據(jù)擬合模型繪制菌株ZH-1產(chǎn)生概率及得率響應(yīng)面的三維圖與等高線，可直觀地看出響應(yīng)面的最高點(diǎn)，即參數(shù)范圍內(nèi)的極值以及因素間的相互作用對響應(yīng)值的影響，依次可以確定最適培養(yǎng)基配方條件范圍，Design-expert 8.0軟件處理后三維響應(yīng)面和等高線圖（圖10、圖11）。

圖10　菌株　ZH-1的產(chǎn)生概率模型的等高線及響應(yīng)面圖Fig.10　The model’s contour and responsesurface plot of change probability ofstrain ZH-1

圖11　菌株　ZH-1的得率模型的等高線及響應(yīng)面圖Fig.11　The model’s contour and responsesurface plot of fungi yield ofstrain ZH-1

分析圖10可知，氮源A（x1）、K2HPO4（x2）對菌株ZH-1產(chǎn)生概率的影響顯著，表現(xiàn)為曲線較陡，即隨著氮源A和K2HPO4的增加或減少，響應(yīng)值變化較大，其他項(xiàng)影響較小，表現(xiàn)為曲線較為平滑，即隨其他項(xiàng)的增加或減少，響應(yīng)值變化較小。交互項(xiàng)中氮源A（x1）與氮源B（x3）、氮源A（x1）與葡萄糖（x4）、K2HPO4（x2）與氮源B（x3）、氮K2HPO4（x2）與葡萄糖（x4）的等高線圖呈橢圓形，表明這些因素的交互作用對菌株ZH-1產(chǎn)生概率有顯著影響。分析圖11可知，氮源A（x1）、葡萄糖（x4）對菌株ZH-1的得率有顯著的影響，其他項(xiàng)影響較小。交互項(xiàng)中氮源A（x1）與氮源B（x3）的交互作用對菌株ZH-1的得率有顯著的影響，其他項(xiàng)有一定的交互作用，但作用不顯著。

2.4菌株ZH-1產(chǎn)生概率及得率最適的配方條件

根據(jù)軟件Design-expert 8.0對試驗(yàn)對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行最優(yōu)化分析，得出了菌株ZH-1產(chǎn)生概率的最適配方條件為：氮源A（x1）43.51 mL，K2HPO4（x2）0.6g、氮源B（x3）2.56g、葡萄糖（x4）5.18g。在此培養(yǎng)基配方條件下，菌株ZH-1產(chǎn)生概率為37.24%；通過方程，得出了ZH-1的最大得率配方條件為氮源A（x1）60 mL，K2HPO4（x2）0.4g、氮源B（x3）2.11g、葡萄糖（x4）6.22g。菌株ZH-1得率可達(dá)到7.14%。

3　結(jié)論

本研究以SH-1轉(zhuǎn)變?yōu)閆H-1的概率和ZH-1的得率為量化指標(biāo)，從氮源A、K2HPO4、氮源B、葡萄糖4個因素的進(jìn)行了單因素試驗(yàn)，在此基礎(chǔ)上通過響應(yīng)面法試驗(yàn)分析，建立了4個因素與產(chǎn)生菌株ZH-1概率、得率的數(shù)學(xué)模型，用響應(yīng)面法確定培養(yǎng)基配方影響菌株SH-1產(chǎn)生菌株ZH-1的因素。試驗(yàn)表明，模型的回歸效果顯著，氮源A、K2HPO4可以作為預(yù)測菌株SH-1轉(zhuǎn)變?yōu)榫闦H-1的培養(yǎng)基配方因素。試驗(yàn)確定了產(chǎn)生粉紅菌株ZH-1最適的培養(yǎng)基配方，為進(jìn)一步確定菌株SH-1與粉紅菌株ZH-1之間的關(guān)系提供數(shù)據(jù)參考，對粉紅菌株的培養(yǎng)有一定的實(shí)際應(yīng)用前景。

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（責(zé)任編輯：張睿）

Effects of medium formula on Cordycepssinensis fungistrain emerging pink variation

ZHANG Zong-hao，LI Yu-ling*
（Animal and Veterinarysciences Academy of Qinghai University，Xining 810016，China）

A portion of fungistrainsH-1 wouldgradually change to pink colorduring thescreening process of Cordycepssinensis fungi.Although there was big morphologicaldifference betweenstrainsH-1 and pinkstrain ZH-1，molecular identificationshowed that the twostrains were thesamespecies.Forseeking the reason of emerging pink variation and obtaining the maximum yield of the pink fungi，four main factors including nitrogen A，K2HPO4，nitrogen B andglucose wereselected on the basis of experimental results ofsingle factors through responsesurface methodology.The optimum culture conditions were as follow：43.51 mL nitrogen A，0.6g K2HPO4，2.56g nitrogen B，5.18gglucose.Under the conditions，the optimum change probability of ZH-1 was 37.24%.The resultsshowed that the medium formula nitrogen A and K2HPO4had very important effects on ZH-1 appearing probability，nitrogen A andglucose had very important effect on ZH-1 yield.

Responsesurface method；Cordycepssinensis fungistrain；Medium formula；Change probability；Yield

S567.35

A

1000-3924（2016）04-035-07

2015-06-01

青海省科技廳國際合作項(xiàng)目“利用分子生物學(xué)開支青海冬蟲夏草原產(chǎn)地保護(hù)質(zhì)量評定研究”（2014-HZ-809）

張宗豪（1982—），男，碩士，助理研究員，主要從事草地微生物研究。E-mail：13897454181@163.com，Tel：13897454181

李玉玲（1969—），女，研究員，主要從事冬蟲夏草研究。E-mail：Yulingli2000@163.com，Tel：0971-8562517