水稻半矮稈基因　sd1功能標記的開發(fā)與利用

徐建軍，張云輝，顧 嘯，姚麒麟*（上海市松江區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，上?！?6；江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，南京　004）

水稻半矮稈基因sd1功能標記的開發(fā)與利用

徐建軍1，張云輝2，顧 嘯1，姚麒麟1*
（1上海市松江區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，上海201611；2江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，南京210014）

開發(fā)利用已克隆的水稻株高相關(guān)基因的分子標記用于分子育種，對水稻理想株型的育種具有十分重要的意義。通過開發(fā)水稻半矮稈基因sd1的功能標記，利用該標記對國內(nèi)外99份水稻品種的sd1基因位點進行了分子檢測，為分子標記輔助選擇育種提供了有利工具。

水稻；sd1；功能標記；分子標記輔助選擇

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，全球約有50%以上的人口以稻米為主食。20世紀60年代，在世界范圍內(nèi)，半矮稈基因sd1的利用使水稻育種發(fā)生了革命性變化，水稻產(chǎn)量得到了大幅度提高，被稱為第一次“綠色革命”。爾后，大量的矮稈基因被不斷挖掘利用，給水稻生產(chǎn)帶來了巨大的經(jīng)濟效益。

在當前的水稻理想株型育種中，株高仍然是備受關(guān)注的性狀之一。選育株高適中的水稻品種，一方面能夠優(yōu)化株型，提高收獲指數(shù)，降低秸稈還田的壓力；另一方面能夠提高耐肥性和抗倒能力。目前，在水稻理想株型育種中，應(yīng)用最廣泛的株高基因仍然是半矮稈基因sd1。sd1基因位于在水稻第1染色體長臂末端。石春海等［1］通過田間性狀調(diào)查，結(jié)果表明sd1在抑制節(jié)間伸長的同時，還可以促進有效穗數(shù)、結(jié)實率和收獲指數(shù)的提高，且不影響抽穗天數(shù)、每穗粒數(shù)和千粒重。SASAKI等［2］、MONNA等［3］、MADOKA等［4］、SPIELMEYER等［5］從分子水平揭示了sd1水稻株高降低而產(chǎn)量不受影響的原因。

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，分子標記輔助選擇育種為傳統(tǒng)育種注入了新的活力。與傳統(tǒng)育種的單一表型選擇相比，分子標記輔助選擇育種具有快速、準確、不受環(huán)境條件影響等優(yōu)點。開發(fā)與sd1基因緊密連鎖或基因內(nèi)的分子標記，將為水稻株高的改良提供有利工具。截至目前，EUN等［6］、CHO等［7］、OGI等［8］、王松文等［9］開發(fā)了一些與sd1基因連鎖的分子標記；但是，sd1基因內(nèi)標記的開發(fā)和應(yīng)用還未見報道。本研究將開發(fā)sd1基因內(nèi)分子標記，為分子標記輔助選擇育種提供工具。

1　材料與方法

1.1供試材料及水稻DNA的提取

供試材料為來源于國內(nèi)外的99份水稻品種。其中秈稻11份，粳稻88份；國外28份，國內(nèi)71份；國外品種主要來自朝鮮、韓國和日本，分別為3份、5份和20份；國內(nèi)品種主要來源于江蘇、黑龍江、河南、四川等省。在水稻分蘗盛期，剪取新鮮葉片，采用CTAB法提取DNA［10］。

1.2分子標記開發(fā)

分子標記開發(fā)基于日本晴序列，借助Primer Premier 5.0軟件，設(shè)計InDel分子標記。

1.3分子標記分析

PCR擴增反應(yīng)采用25μL PCR反應(yīng)體系：2.5μL模板DNA（1 ng/μL），正反引物各1.25μL （0.1μmol/L），2.5μLdNTPs（0.25 mmol/L），2.5μL 10×Buffer（不含Mg2+），2.5μL 25 mmol/L Mg2+，0.2μL Taq酶（5 U/μL），12.3μLddH2O。

PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min，接著94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，33個循環(huán)后72℃補充延伸10 min，最后4℃保溫。

PCR擴增產(chǎn)物通過3.5%瓊脂糖凝膠電泳進行分離，利用UVP凝膠成像系統(tǒng)進行成像拍照。

2　結(jié)果與分析

2.1sd1基因內(nèi)分子標記的開發(fā)

根據(jù)RGP（Ricegenome annotation project）基因注釋，sd1基因在‘日本晴’序列圖譜對應(yīng)的位置是38381423-38384165 bp（5’-3’）。利用sd1基因的序列，在NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）網(wǎng)站與‘9311’序列進行比對，發(fā)現(xiàn)該基因在這2個測序品種之間，存在383 bp的插入缺失。利用該插入缺失，基于‘日本晴’序列，借助Primer Premier 5.0軟件，設(shè)計了1對InDel分子標記。標記命名為：InDel-sd1。標記序列為，F(xiàn)：5’AGCTGGACATGCCCGTGGTC 3’，R：5’TTGAGCTGCTGTCCGCGAAG 3’?！毡厩纭疨CR產(chǎn)物為606 bp，‘9311’的PCR產(chǎn)物為223 bp。

2.2InDel-sd1的分析

以水稻品種‘日本晴’和‘9311’為模板，通過PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳和 UVP凝膠成像系統(tǒng)成像，對分子標記InDel-sd1進行分析，結(jié)果如圖1。從圖1可以看出，分子標記InDel-sd1條帶清晰，PCR產(chǎn)物大小準確，為共顯性標記，能夠準確區(qū)分‘日本晴’和‘9311’兩個品種sd1基因位點的基因型。前人研究表明‘9311’的sd1基因位點為突變型，隱性半矮稈基因型，‘日本晴’sd1位點為野生型，顯性高稈基因型［11］。所以，本標記能夠準確區(qū)分這兩種基因型，為該標記在分子標記輔助選擇育種提供了有力的工具。

2.3InDel-sd1的應(yīng)用

圖1　InDel-sd1的電泳分析Fig.1　Electrophoresis analysis of InDel-sd1

利用分子標記InDel-sd1，對上述99份水稻品種的sd1基因位點進行了基因型分析。結(jié)果表明：‘9311’‘南粳35’‘02428’‘關(guān)東98’‘明之星’‘九稻3號’‘水原264’‘密陽23’‘當育3號’‘皖稻77’‘川米2號’‘川新糯’‘內(nèi)中124’等13份水稻品種的sd1基因位點與‘9311’一致，為突變型。其中，粳稻5份，秈稻8份。部分水稻品種的基因型分析結(jié)果如圖2。其余86份水稻品種的sd1基因位點為與‘日本晴’一致，為野生型。

3　結(jié)論與討論

EUN等［6］、CHO等［7］開發(fā)了與sd1基因連鎖的分子標記，并利用它們進行分子標記輔助選擇。OGI等［8］開發(fā)了1個與sd1基因緊密連鎖的RFLP標記。王松文等［9］開發(fā)了2個基于PCR的sd1基因緊密連鎖的標記，分別于sd1基因的遺傳距離為4.4 cM和9.01 cM。但是，上述開發(fā)的標記均為連鎖標記，在實際應(yīng)用過程中，由于重組事件的發(fā)生，可能導(dǎo)致檢測結(jié)果的偏差。截至目前，sd1基因內(nèi)標記的開發(fā)和應(yīng)用還未見報道。本研究基于測序品種‘9311’和‘日本晴’，開發(fā)了半矮稈基因sd1的基因內(nèi)分子標記，為理想株型的分子育種提供了有用工具。本研究開發(fā)的基于PCR的基因內(nèi)分子標記，檢測方法方便快捷，檢測結(jié)果準確可靠，比前人開發(fā)的連鎖標記更具應(yīng)用價值。

本研究利用新開發(fā)的分子標記，檢測了99份來源于國內(nèi)外的水稻品種，一方面驗證了新標記的準確性和實用性，另一方面明確了‘9311’等13份水稻品種的sd1基因位點為突變型，為理想株型育種提供了材料基礎(chǔ)。

圖2　22個水稻品種　sd1基因位點的基因型分析Fig.2　Genotype analysis ofsd1gene loci of 22 rice varieties

［1］石春海，申宗坦.水稻半矮稈基因sd1對農(nóng)藝性狀的影響［J］.中國水稻科學(xué)，1996（1）：13-18.

［2］SASAKI A，ASHIKARI M，UEGUCHI-TANAKA M，et al.A mutantgibberellin-synthesisgene in rice［J］.Nature，2002，416：701-702.

［3］MONNA L，KITAZAWA N，YOSHINO R，et al.Positional Cloning of Ricesemidwarfinggene，sd-1：Rice“Green Revolutiongene”Encodes a Mutant Enzyme Involved ingibberellinsynthesis［J］.DNA Research，2002，9（1）：11-17.

［4］MADOKA A，TAKAHIRO K，MIKIKO K，et al.Gibberellin biosynthesis andsignal transduction is essential for internode elongation indeepwater rice［J］.Plant，Cell&Environment，2014，37（10）：2313-2324.

［5］SPIELMEYER W，ELLIS M H，CHANDLER P M.Semidwarf（sd-1），“green revolution”rice，contains adefectivegibberellin 20-oxidasegene ［J］.Proceedings of the National Academy ofsciences，2002，99（13）：9043-9048.

［6］EUN M Y，CHO Yg，CHUNG TY.Molecular markers linked tightly withsemidwarf（sd-1）character andshattering habits in rice［J］.Koreansoc Mol Biol，1991，4：182-185.

［7］CHO Yg.Genetics of esterase isozymes and RFLP markers，and their linkage with asemidwarfgene（sd-1）in rice（Oryzasativa L.）［D］.seoul：Seoul National University，Republic of Korea，1992.

［8］OGI Y，KATO H，MARUYAMA K，et al.Identification of RFLP markers closely linked to thesemidwarfinggene at thesd-1 locus in rice［J］. Japan J Breed，1993，43：141-146.

［9］王松文，施利利，王妮妮，等.水稻sd-1基因分子標記的建立［J］.天津農(nóng)學(xué)院學(xué)報，2000，7（2）：52.

［10］PANAUD O，CHEN X，MCCOUCHs R.Development of microsatellite makers and characterization ofsimplesequence length polymorphism （SSLP）in rice（Oryzasativa L.）［J］.Molgengenet，1996，252：597-607.

［11］陳仁霄，張所兵，朱鎮(zhèn)，等.秈稻9311HR-T顯性高稈基因的初步定位［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2008，24（5）：553-558.

（責任編輯：張睿）

Development and application of co-segregated marker forsemi-dwarfgenesd1 in rice（Oryzasativa L.）

XU Jian-jun1，ZHANG Yun-hui2，GU Xiao1，YAO Qi-lin1*
（1Songjiang Agricultural Technology and Popularization Center ofshanghai，Shanghai 201611，China；2Institute of Food Crops of Jiangsu Academy of Agriculturalsciences，Nanjing 210014，China）

Development and application of molecular markers for cloned plant height relatedgenes is ofgreatsignificance in rice breeding for ideal plant type.A co-segregated functional marker ofsemi-dwarfgenesd1 in rice wasdeveloped，and thesd1 locus of 99 rice varieties at home and abroad wasdetected by the marker.The results provided favorable tools for marker assistedselection breeding in rice.

Rice；sd1；Functional marker；MAS

S511

A

1000-3924（2016）04-022-03

2015-06-08

上海市科技興農(nóng)“農(nóng)業(yè)種植資源創(chuàng)新與良種良法配套技術(shù)集成應(yīng)用”項目“地方特色品種資源開發(fā)應(yīng)用”課題［滬農(nóng)科種字（2014）第3-1號］

徐建軍（1983—），男，博士，高級農(nóng)藝師，研究方向：農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣。Tel：021-57866226；E-mail：rilitianlang991983@163.com

，Tel：021-67835172；E-mail：sj_yaoqilin@163.com