正交試驗(yàn)法優(yōu)化稗屬植物　ISSR-PCR反應(yīng)體系

劉德好，陸永良，婁玉霞，郭水良*（上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上?！?034；中國(guó)水稻研究所，杭州　30006）

正交試驗(yàn)法優(yōu)化稗屬植物ISSR-PCR反應(yīng)體系

劉德好1，陸永良2，婁玉霞1，郭水良1*
（1上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海200234；2中國(guó)水稻研究所，杭州310006）

利用正交設(shè)計(jì)方法，對(duì)稗屬植物ISSR-PCR反應(yīng)體系的4個(gè)因素（TaqdNA聚合酶、引物、dNTPs和模板DNA）在4個(gè)水平上進(jìn)行優(yōu)化，建立了稗屬植物ISSR-PCR的最佳反應(yīng)體系（20μL）：TaqdNA聚合酶0.5 U、引物0.1μmol/L、dNTPs 200μmol/L、DNA模板150 ng。共篩選出9條適合稗屬植物ISSR-PCR的引物，并確定了每條引物的最適退火溫度，可為后續(xù)利用ISSR技術(shù)開展稗屬植物鑒定和多樣性研究提供技術(shù)支持。

稗屬植物；正交設(shè)計(jì)；ISSR-PCR；反應(yīng)體系

稗屬（Echinochloa Beauv.）雜草是一種在全球范圍均有分布的惡性雜草，對(duì)農(nóng)作物造成了嚴(yán)重的危害。受生態(tài)環(huán)境、耕作方式等多方面因素的影響，稗屬種內(nèi)在形態(tài)甚至基因上都出現(xiàn)了不同程度的變異，增加了稗屬雜草的分類以及防除的難度［1］。ISSR分子標(biāo)記技術(shù)有相對(duì)可靠的穩(wěn)定性和重復(fù)性，具有多態(tài)性水平高、DNA用量少和成本低等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性分析和種質(zhì)鑒別等研究［2-3］。

ISSR是一種基于PCR的分子標(biāo)記技術(shù)，不同的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序會(huì)導(dǎo)致不同的結(jié)果，為了得到穩(wěn)定可靠的試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化十分必要。本試驗(yàn)采用正交設(shè)計(jì)法對(duì)稗屬植物ISSRPCR反應(yīng)體系的4個(gè)因素（TaqdNA聚合酶、引物、dNTPs和模板DNA）在4個(gè)水平上進(jìn)行優(yōu)化，以期建立稗屬植物最優(yōu)反應(yīng)體系，為其遺傳多樣性分析和種質(zhì)鑒別提供技術(shù)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

本試驗(yàn)所用材料為長(zhǎng)芒稗（Echinochloa caudata Roshev.），采自福建省三明市尤溪縣新陽鎮(zhèn)大坋村。

1.2試劑

TAKARA LA Taq（Code No.RR02MA），附帶試劑10×LA PCR BufferⅡ（Mg2+Plus）、dNTPs Mixture （2.5 mmol/L each）。采用哥倫比亞大學(xué)設(shè)計(jì)公布的ISSR引物（http://www.michaelsmith.ubc.ca/services/ NAPS/Primer_Sets/Primers_Oct2006.pdf），由上海生工合成。

1.3方法

1.3.1DNA的提取和濃度檢測(cè)

使用天根植物基因組試劑盒提取長(zhǎng)芒稗葉片DNA，利用BeckmandU-640核酸蛋白分析儀測(cè)定DNA濃度和純度。DNA樣品保存于-20℃冰箱中備用，作為PCR擴(kuò)增的模板。

1.3.2PCR正交試驗(yàn)的設(shè)計(jì)

針對(duì)酶量、模板DNA、dNTPs及引物4個(gè)因素設(shè)計(jì)4個(gè)水平（表1），選用L16（4×4）正交表，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增體系優(yōu)化的因素-水平正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)表（表2）。

表　1 正交設(shè)計(jì)水平因素表Table 1　Factors and levels of orthogonaldesign

表　2 稗屬植物　ISSR-PCR正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表　L16（4×4）Table 2　ISSR-PCR reaction of L16（4×4）for Echinochloa

試驗(yàn)共設(shè)16個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3次，反應(yīng)體系20μL，引物選用UBC807。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30s，52℃退火30s，72℃復(fù)性1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃下延伸10 min后，4℃保存。PCR產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳電壓100 V，電泳50 min。以2 000 bpdNA標(biāo)準(zhǔn)分子量作為分子量標(biāo)記。使用Tanon 2500凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行拍照和分析。

1.3.3引物的篩選和退火溫度的確定

由于每個(gè)引物的堿基序列不一樣，同一序列在不同物種基因組中出現(xiàn)的頻率也不一致，在合成的100個(gè)引物中不是所有的引物都可以擴(kuò)增出穩(wěn)定的條帶，擴(kuò)增出的條帶也不一定具有多樣性，所以在正式試驗(yàn)前需要對(duì)90個(gè)引物進(jìn)行初步的篩選。本試驗(yàn)選取長(zhǎng)芒稗D(zhuǎn)NA作為模板，用正交試驗(yàn)所得最佳反應(yīng)條件對(duì)90個(gè)引物進(jìn)行擴(kuò)增，選取擴(kuò)增條帶豐富、背景清晰和穩(wěn)定性好的引物。

退火溫度不僅和引物的序列有關(guān)，而且和物種基因組序列有關(guān)［4］。同一引物在對(duì)不同物種基因組進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，所需要的最佳退火溫度也是不一致的。因此，適宜的退火溫度對(duì)于稗屬植物ISSR擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果十分重要。本試驗(yàn)退火溫度的跨度設(shè)置為12℃，由PCR儀自動(dòng)生成12個(gè)溫度梯度。對(duì)所篩選出的所有引物逐一進(jìn)行溫度梯度PCR，以確定每個(gè)引物的最佳退火溫度。使用正交試驗(yàn)得到的最佳反應(yīng)體系對(duì)哥倫比亞大學(xué)設(shè)計(jì)并公布的100條ISSR常用引物進(jìn)行篩選，并采用溫度梯度PCR模式，設(shè)定溫度48—60℃，自動(dòng)生成12個(gè)溫度梯度：48.0℃、48.3℃、49.0℃、50.2℃、51.7℃、53.3℃、54.7℃、56.3℃、57.8℃、59.0℃、59.7℃、60.0℃，逐一確定特異性引物的最適退火溫度。

1.3.4正交試驗(yàn)結(jié)果的極差和方差分析

參照何正文等［5］的方法，依據(jù)電泳條帶豐富度、清晰度和背景色深度對(duì)16個(gè)泳道分別進(jìn)行賦值：條帶最豐富、主帶清晰以及背景亮度低為最佳，定為16分；與此相反的則評(píng)為1分。3次重復(fù)試驗(yàn)獨(dú)立評(píng)分，合并統(tǒng)計(jì)分析。統(tǒng)計(jì)同一水平下各因素的分?jǐn)?shù)之和（K1、K2、K3和K4），計(jì)算出各因素的極差R。極差一定程度上反應(yīng)了該因素對(duì)整個(gè)反應(yīng)體系的影響程度，極差越大，表明該因素對(duì)反應(yīng)的影響越強(qiáng)烈。

以各因素對(duì)4個(gè)水平下的3次重復(fù)處理的電泳結(jié)果（賦值）為基礎(chǔ)，對(duì)各因素在4個(gè)不同處理水平之間的差異作單因素方差分析。

2　結(jié)果與分析

2.1稗屬植物ISSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

2.1.1正交試驗(yàn)結(jié)果的對(duì)比分析

擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果（圖1）表明，處理T4、T6、T7、T12和T13條帶數(shù)較多，處理T12和T13主帶明亮、背景清晰。因此，用直接對(duì)比法可以推斷出處理T12和T13對(duì)于稗屬植物ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果最好。

圖1　正交試驗(yàn)　PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1　PCR electrophoresis map of orthogonal tests

2.1.2正交試驗(yàn)結(jié)果的極差分析

正交試驗(yàn)各因素處理水平和對(duì)應(yīng)處理所得結(jié)果的賦值累積分見表3，各因素在4個(gè)處理水平下的試驗(yàn)結(jié)果賦值累積總值的極差見表4。16個(gè)處理中，累積分值以T12、T13較大，分別為46和47（表3），各因素的極差由大到小分別是dNTPs（85）、引物（57）、Taq酶（43）和DNA模板（36）（表4），即dNTPs對(duì)稗屬植物ISSR-PCR反應(yīng)影響最顯著，引物次之，隨后是Taq酶，模板對(duì)反應(yīng)結(jié)果的影響最弱。

表3　正交試驗(yàn)各因素處理水平和對(duì)應(yīng)處理所得結(jié)果的賦值累積分Table 3　Levels of each factor of orthogonal tests and their assignment cumulativescores

表4　dNTPs、引物、Taq酶和模板在4個(gè)處理水平下的分別累積分總和及極差Table 4　Total assigned values and range ofdNTPs，primer，TaqdNA polymerase and template of 4 treatment levels

2.1.3各因素對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增影響的方差分析

方差分析同樣表明，dNTPs不同濃度水平對(duì)稗屬植物ISSR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果的影響最為顯著，引物濃度次之，模板濃度對(duì)反應(yīng)的影響最?。ū?）。

圖2直觀地表達(dá)了dNTPs、引物、Taq酶和模板DNA濃度對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)的影響，結(jié)果表明：dTNPs濃度在200—300μmol/L、引物濃度在0.1μmol/L、Taq酶在1.5 U、模板DNA在150 ng時(shí)有最好的擴(kuò)增結(jié)果，對(duì)應(yīng)的處理分別是12和13。

表5　ISSR-PCR正交試驗(yàn)各因素間的方差分析Table 5　Variance analysis for factors of orthogonal tests of ISSR-PCR

圖2　各因素的不同水平對(duì)稗屬植物　ISSR-PCR反應(yīng)的影響Fig.2　Influence ofdifferent levels of each factor on ISSR-PCR reaction of Echinochloa

2.2稗屬植物ISSR-PCR擴(kuò)增引物的篩選和退火溫度的確定

本試驗(yàn)選取長(zhǎng)芒稗作為模板，用正交試驗(yàn)所得最佳反應(yīng)條件對(duì)90個(gè)引物進(jìn)行擴(kuò)增，選取擴(kuò)增條帶豐富、背景清晰和穩(wěn)定性好的引物。經(jīng)過PCR擴(kuò)增對(duì)90條引物進(jìn)行篩選后，對(duì)篩選出的引物逐一進(jìn)行溫度梯度PCR，結(jié)果發(fā)現(xiàn)808、826、827、856、857、888、889、890、891這9條引物有較好的擴(kuò)增結(jié)果（圖3）。對(duì)篩選出的9條引物逐一進(jìn)行溫度梯度PCR，確定每個(gè)引物的最佳退火溫度（圖4、表6）。

圖3　篩選引物的PCR產(chǎn)物部分電泳圖Fig.3　Partial electrophoresis map of PCR forscreening primers

圖4　部分引物的溫度梯度　PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.4　Electrophoresis map oftemperaturegradient PCR ofsome primers

表6　篩選得到的9個(gè)引物及其退火溫度Table 6　Screening of the 9 primers and their annealing temperature for ISSR

3　討論

PCR擴(kuò)增過程中，當(dāng)dNTPs濃度過小時(shí)，dNTPs在擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束前消耗殆盡，導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物量降低；而dNTPs濃度過高又會(huì)產(chǎn)生不必要的浪費(fèi)，而且過多的dNTPs還會(huì)和Mg2+結(jié)合，降低Mg2+相對(duì)濃度，導(dǎo)致LA Taq酶活性降低。根據(jù)方差分析結(jié)果，在本試驗(yàn)中，dNTPs對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的影響最大，這與周凌瑜等［6］的研究結(jié)果相似。從圖2A可看出，dNTPs濃度在100—300μmol/L范圍內(nèi)結(jié)果均值隨濃度的增加而增加，在300μmol/L時(shí)反應(yīng)效果最佳，但是方差分析發(fā)現(xiàn)，200—300μmol/L范圍內(nèi)差異不顯著，為了節(jié)約成本，把dNTPs的最佳反應(yīng)濃度定在200μmol/L。

一般PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，引物濃度通常在0.5μmol/L左右［7］。擴(kuò)增反應(yīng)中，引物過少會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)量不足；而引物過多又會(huì)增加非特異的擴(kuò)增，導(dǎo)致條帶模糊，背景色加深。在本試驗(yàn)設(shè)計(jì)濃度范圍內(nèi)，擴(kuò)增得到的條帶數(shù)隨著引物濃度的增加而降低（圖2B），但是這種差異不顯著，因此將引物濃度定在0.1μmol/L。

本試驗(yàn)中，Taq酶濃度對(duì)稗屬植物ISSR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果影響顯著。高濃度的酶會(huì)顯著減少擴(kuò)增的條帶數(shù)。當(dāng)Taq酶濃度為1.5U/（20μL）時(shí)，結(jié)果均值達(dá)到最大9.538（圖2C）。但是Taq酶濃度在0.5—1.5U/（20μL）范圍內(nèi)對(duì)稗屬植物ISSR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果無明顯影響，所以Taq酶選擇0.5U/（20μL）。

前人研究表明，模板濃度對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果的影響較小，最適擴(kuò)增反應(yīng)濃度通常情況下會(huì)有一個(gè)很大的跨度［8］。本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)模板濃度在4個(gè)水平下的擴(kuò)增效果沒有明顯差異，只是在150 ng/（20μL）時(shí)稍佳（圖2D）。

不同引物有著各自的最佳退火溫度，適宜的退火溫度有利于提高擴(kuò)增條帶的清晰度、豐富度以及擴(kuò)增結(jié)果的穩(wěn)定性。

綜上所述，利用正交試驗(yàn)方法優(yōu)化稗屬植物ISSR-PCR反應(yīng)條件，最終確定稗屬植物20μL最佳反應(yīng)體系：10×buffer 2μL、dNTPs 200μmol/L、Taq酶0.5U、模板150ng、引物0.1μmol/L。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s、52℃（實(shí)際溫度依各引物最佳退火溫度為準(zhǔn)）退火30s、72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，最后4℃保存。

［1］National Field Researchgroup.China’s field weeds regionization［J］.J Weedsci，1989，3（2）：1-5.

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［4］ZENG J，ZOU Y P，BAI J Y，et al.Preparation of TotaldNA from“Recalcitrant Plant Taxa”［J］.Acta Botsin，2002，44（6）：694-697.

［5］何正文，劉運(yùn)生，陳立華，等.正交設(shè)計(jì)直觀分析法優(yōu)化PCR條件［J］.湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，23（4）：403-404.

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（責(zé)任編輯：閆其濤）

Optimization of ISSR-PCR reactionsystem of Echinochloa by orthogonaldesign

LIUde-hao1，LU Yong-liang2，LOU Yu-xia1，GUOshui-liang1*
（1College of Life and Environmentsciences，Shanghai Normal University，Shanghai 200234，China；2China National Rice Research Institute，Hangzhou 310006，China）

By orthogonaldesign，four factors includingdNTPs，TaqdNA polymerase，primers and templatedNA werestudied to establish an optimum ISSR-PCR reactionsystem.The optimum reactionsystem in 20μL contained 0.5 U TaqdNA polymerase，0.1μmol/L primers，200μmol/LdNTPs and 150 ng templatedNA.Nine primers wereselected for Echinochloa ISSR-PCR.Through thegradient PCR test，the optimal annealing temperatures for ISSR-PCR reaction of 9 primers were alsodetermined，respectively.Thissystem provides a technicalsupport for the identification，diversitystudy of Echinochloa.

Echinochloa；Orthogonaldesign；ISSR；PCR reactionsystem

Q78

A

1000-3924（2016）04-017-05

2015-05-19

國(guó)家水稻產(chǎn)業(yè)體系項(xiàng)目（nycytx-01）“稻田雜草防控技術(shù)研究與示范”作者簡(jiǎn)介：劉德好（1986—），男，碩士，研究方向?yàn)殡s草科學(xué)

，E-mail：gsg@shnu.edu.cn