基于SSR標記的鮮食玉米自交系遺傳多樣性分析

張微微，張紅偉，王 慧，陳 岳，周 鵬，李 炯，俞平高*（上海農(nóng)林職業(yè)技術學院園藝園林系，上海0699；上海粒粒豐農(nóng)業(yè)科技有限公司，上海0600；上海市農(nóng)業(yè)科學院作物育種栽培研究所，上海00；東北農(nóng)業(yè)大學園藝學院，哈爾濱　5000）

基于SSR標記的鮮食玉米自交系遺傳多樣性分析

張微微1，張紅偉2，王 慧3，陳 岳4，周 鵬1，李 炯2，俞平高1*
（1上海農(nóng)林職業(yè)技術學院園藝園林系，上海201699；2上海粒粒豐農(nóng)業(yè)科技有限公司，上海201600；3上海市農(nóng)業(yè)科學院作物育種栽培研究所，上海201403；4東北農(nóng)業(yè)大學園藝學院，哈爾濱150030）

從103對SSR引物中篩選出42對穩(wěn)定擴增的多態(tài)性SSR引物，多態(tài)性比率為40.8%，并對117份玉米自交系的親緣關系進行評價。結果表明：42對SSR標記共擴增出171個等位基因，每個標記位點等位基因數(shù)從2到8個，平均等位基因數(shù)為4.1，多態(tài)性信息量（PIC）值范圍從0.73到0.90，平均每對引物0.82。用UPGMA方法將117份玉米自交系劃分為3個類群，劃分結果與其系譜來源基本相符。

玉米；鮮食玉米；自交系；遺傳多樣性；SSR標記

玉米自交系是玉米人工進化的重要產(chǎn)物，在遺傳學研究和育種工作中具有重要的價值。目前大多選育的玉米自交系品種沒有系統(tǒng)的系譜記載，降低其在雜種優(yōu)勢群體構建的利用率及育種效率。因此，研究玉米自交系的遺傳變異及其之間的親緣關系，從而進行類群劃分是構建玉米雜種優(yōu)勢群的重要依據(jù)，是提高選育優(yōu)良雜交種效率的基礎性工作。

傳統(tǒng)育種多是通過表現(xiàn)型間接對基因型進行選擇，存在很大的盲目性和隨機性，然而分子標記技術的發(fā)展為評價玉米種質基礎及雜種優(yōu)勢利用提供了新手段。SSR（Simplesequence repeat）標記是建立在PCR（Polymerase chain reaction）反應基礎之上的一種遺傳標記，已有效地應用于玉米種質的遺傳學研究。李新海等［1］利用SSR標記研究了21個玉米自交系的遺傳變異。劉杰等［2］采用SSR和雜種優(yōu)勢聚類方法分析我國15個玉米自交系的遺傳變異，并初步進行了雜種優(yōu)勢類群劃分。劉世建等［3］對四川地方玉米種質進行了SSR聚類分析，研究了28個玉米自交系的遺傳變異。李麗華等［4］對59份新選玉米自交系利用SSR標記技術研究其遺傳多樣性。喬志軍等［5］對180份玉米自交系親緣關系進行了分子評價。吉瓊等［6］利用SSR標記研究了96個玉米自交系的遺傳多樣性。雖然利用SSR標記進行遺傳多態(tài)性分析和雜種優(yōu)勢群劃分方面已有一些研究報道，但目前對玉米自交系（尤其上海地區(qū)）遺傳多樣性分析的研究還較少。因此，本研究利用文獻及玉米基因組數(shù)據(jù)庫（MaizeGBD）查找開發(fā)SSR標記，對117份上海粒粒豐農(nóng)業(yè)科技有限公司的主要玉米自交系遺傳多樣性進行了系統(tǒng)分析，以期為玉米種質擴增改良與創(chuàng)新研究等育種工作提供技術支撐，同時為充分挖掘種質資源的遺傳潛力提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1植物材料

試驗種質是上海粒粒豐農(nóng)業(yè)科技有限公司收集及自選系包括甜玉米和糯玉米，共計117份玉米自交系形成的供試群體（表1）。于2015年4月在上海粒粒豐農(nóng)業(yè)科技有限公司實驗基地種植，常規(guī)播種，于5月份對每個自交系進行取樣，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1　117份玉米自交系信息Table 1　Data of 117 maize inbred lines

（續(xù)表1）

1.2玉米基因組DNA的提取

取玉米鮮樣（幼嫩葉）0.1g，用液氮磨成粉狀，然后用DNA提取試劑盒（DP320，北京天根）提取基因組DNA。DNA提取后于1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，電泳緩沖液為1×TAE，電壓100V；DNA純度和濃度測量利用NanoDrop2000c紫外可見光譜儀（Thermo公司）進行測定，稀釋至50ng/μL的工作液備用，4℃冰箱儲藏。

1.3SSR標記

PCR擴增反應總體積為10μL，其中反應混合液中包括：5μL的2×ESTaqmix（康為公司），DNA（50 ng/μL）模板1μL，引物0.5μL（10μmol/L），3.5μL的ddH2O。PCR擴增反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸40s，共30個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物中加入6μL變性劑，94℃變性5 min，迅速放于冰上冷卻，于6%聚丙烯酰胺凝膠檢測，銀染法顯色。白熾燈下觀察電泳結果，進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和照相。試驗所用SSR引物均由生工生物工程股份（上海）有限公司合成。

1.4數(shù)據(jù)分析

擴增產(chǎn)物以0、1、-統(tǒng)計建立數(shù)據(jù)庫。在相同遷移率位置上，有帶記為1，無帶記為0，缺失數(shù)據(jù)記為-。數(shù)據(jù)分析采用NTSYS-pcv 2.11軟件進行，以Jaccard計算遺傳相似系數(shù)，利用非加權組平均法（UPGMA）對117份玉米自交系進行聚類分析，構建分子系統(tǒng)樹，F(xiàn)REETREE用于計算。多態(tài)性信息量（Polymorphism information content，PIC）計算方法參照Botstein等［7］。

2　結果與分析

2.1SSR標記多態(tài)性分析

圖1　SSR引物對玉米自交系擴增的電泳結果Fig.1　Electrophoretic result of amplification of inbred lines bysSR primers

本研究于103對SSR引物中篩選出42對擴增穩(wěn)定、具有多態(tài)性的SSR引物（圖1），多態(tài)性比率為40.8%。42對多態(tài)性SSR引物對117份玉米自交系進行PCR擴增，結果表明共擴增出171條多態(tài)性條帶，每個標記位點等位基因數(shù)從2到8個，平均等位基因數(shù)為4.1；多態(tài)性信息量（PIC）是用來評估每對引物標記的多態(tài)性信息量水平，本試驗篩選出的42對SSR引物中，PIC值范圍從0.73到0.90，平均每對引物0.82，表明所篩選引物具有較豐富的遺傳多樣性（表2）。

表2　42對多態(tài)性　SSR引物信息Table 2　Information of 42-pair polymorphicsSR primers

2.2遺傳多樣性分析

根據(jù)42對SSR引物的擴增結果，共171個多態(tài)性位點用于計算117份玉米自交系間的遺傳相似系數(shù)，遺傳相似系數(shù)范圍為0.69—0.98，其中以M1363與M1364的相似系數(shù)最大（0.98），聚類結果表明所選玉米自交系間具有較豐富的遺傳變異。在遺傳相似系數(shù)為0.70時，可以將117份供試自交系分為3大類群（I，II和III）（圖2）。第I類群基本包含甜玉米，II和III兩個類群都是糯玉米。

第I類群包括19個自交系，包含大部分甜玉米品系，主要是華珍母本、臺灣雜交種來源的選系。這些材料多是熱帶血緣，較抗南方銹病，生育期相對溫帶材料較長。第II類群包括86份自交系，根據(jù)其來源、田間表現(xiàn)及育種過程中配合力歷年數(shù)據(jù)，又可分為兩個亞群：第1亞群主要是以‘京科糯2000’父本為基礎材料進行的改良系，其中有兩種主要遺傳改良方向，一是‘京科糯2000’父本與美國來源的遺傳資源進行小群體輪回選擇群體改良的后代選系，二是‘京科糯2000’父本與市售優(yōu)良雜交種進行遺傳改良的材料，該群遺傳改良的目的是提高京科糯2000株系的抗倒性及進行雙隱性自交系親本的培育；第2亞群包括17份自交系（M1238—M1369），主要是來源于地方品種LJZ改良系，該群材料配合力優(yōu)秀，果穗結實性好，單穗產(chǎn)量較高，植株半緊湊，抗倒性好，缺點是穗軸較粗，目前是我們進行重點選育改良的材料；第III類群包括12份自交系，主要是來自于先正達雜交種的群體改良選系材料。

圖2　117份玉米自交系聚類分析樹狀圖（UPGMA法）Fig.2　Dendrogram of 117 inbred lines based on cluster analysis by UPGMA method

3　討論

SSR標記是指由2—6個堿基對組成簡單重復序列串聯(lián)組成的短片段，是基于PCR反應的共顯性的遺傳標記［8］。該技術簡便快速、重復性好、穩(wěn)定性高和等位基因多態(tài)性豐富等優(yōu)點，已廣泛用于玉米的遺傳圖譜構建、基因定位、分子標記輔助育種及遺傳多樣性分析等方面研究［9-11］。本研究利用42對多態(tài)性SSR引物在117份玉米自交系中檢測到171條多態(tài)性條帶，平均等位基因數(shù)為4.1和平均PIC為0.82，這與XIE等［12］所報道的70對sSR標記在187自交系中檢測到的平均等位基因數(shù)（4.14）相同，但平均PIC （0.615）低于本試驗；并均高于肖木輯等［13］采用70對SSR引物對37份遼寧省主要玉米自交系檢測的平均等位基因數(shù)（3.7）和平均PIC（0.564），這可能與試驗材料和所選引物有關。本試驗所用引物平均PIC均高于文獻報道，表明所篩選引物具有較豐富的遺傳多樣性。

傳統(tǒng)玉米自交系類群的劃分主要依賴于系譜和雜交組合的產(chǎn)量來劃分雜種優(yōu)勢群體，因此，通過分子標記技術研究自交系的遺傳背景和關系，對改良玉米自交系和組配雜交組合均有很高的參考價值，以往的研究表明SSR能較真實地揭示自交系間的遺傳多樣性。本研究選用42對SSR引物將117份玉米自交系基本分開，結合分析供試自交系的系譜來源，發(fā)現(xiàn)劃分類群與其種質來源基本一致，但也有一些自交系與系譜記載并不符合，少部分來自同一基礎材料的自交系被歸入不同類群，原因可能在于這些基礎材料存在較大的遺傳變異、原始種質混雜或實驗誤差等。事實上，利用分子標記劃分玉米自交系，不能簡單地以與系譜分析吻合為標準，關鍵還是看能否指導預測玉米雜種優(yōu)勢。目前對玉米自交系（尤其上海地區(qū)）遺傳多樣性分析的研究還較少，因此，本研究使用分子標記輔助育種劃分雜種優(yōu)勢群，進行優(yōu)勢組合的選配，可以選育出適合在上海生長的優(yōu)良品種，以期為玉米種質擴增改良與創(chuàng)新研究等育種工作提供技術支撐，同時為充分挖掘種質資源的遺傳潛力提供依據(jù)。

［1］李新海，傅駿驊，張世煌，等.利用SSR標記研究玉米自交系的遺傳變異［J］.中國農(nóng)業(yè)科學，2000，33（2）：1-9.

［2］劉杰，陳剛.SSR標記用于玉米自交系遺傳變異與優(yōu)勢類群劃分的研究［J］.西北植物學報，2002，22（4）：741-750.

［3］劉世建，榮廷昭，楊俊品，等.四川玉米地方種質的SSR聚類分析［J］.作物學報，2004，30（3）：221-226.

［4］李麗華，魏昕，潘光堂，等.新選優(yōu)良玉米自交系SSR遺傳多樣性分析［J］.玉米科學，2009，17（4）：24-28.

［5］喬志軍，劉龍龍，南曉潔，等.180份玉米自交系親緣關系的分子評價［J］.植物遺傳資源學報，2011，12（2）：211-215.

［6］吉瓊，張新玲，童婷，等.利用SSR標記研究96個玉米自交系的遺傳多樣性及其群體遺傳結構［J］.新疆農(nóng)業(yè)大學學報，2012，35（2）：99-106.

［7］BOTSTEINd，WHITE R L，SKOLNICK M，et al.Construction of agenetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms ［J］.American Journal of Humangenetics，1980，32（3）：314-331.

［8］POWELL W，MACHRAYg C，PROVAN J.Polymorphism revealed bysimplesequence repeats［J］.Trends in Plantscience，1996，1（7）：215-222.

［9］向道權，曹海河，曹永國，等.玉米SSR遺傳圖譜構建及產(chǎn)量性狀基因定位［J］.遺傳學報，2001，28（8）：778-784.

［10］INGHELANDTd V，MELCHINGER A E，LEBRETON C，et al.Populationstructure andgeneticdiversity in a commercial maize breeding program assessed withsSR andsNP markers［J］.Theor Applgenet，2010，120：1289-1299.

［11］劉章雄，王守才，戴景瑞，等.玉米自交系抗銹病基因的遺傳分析及SSR分子標記定位［J］.遺傳學報，2003，30（8）：706-710.

［12］XIE C，ZHANGs，LI M，et al.Inferringgenome ancestry and estimating molecular relatedness among 187 Chinese maize inbred lines［J］.Genetgenom，2007，34（8）：738-748.

［13］肖木輯，李明順，孫有位，等.遼寧省主要玉米自交系的SSR遺傳多樣性分析［J］.玉米科學，2006，14（1）：33-36.

（責任編輯：程智強）

SSR marker-basedgeneticdiversity analysis of table corn inbred lines

ZHANG Wei-wei1，ZHANG Hong-wei2，WANG Hui3，CHEN Yue3，ZHOU Peng1，LI Jiong2，YU Ping-gao1*
（1Department of Horticulture and Landscaping，Shanghai Vocational Technical College of Agriculture and Forestry，Shanghai 201699，China；2Shanghai Lilifeng Agricultural Technology Limited Company，Shanghai 201600，China；3Crop Breeding and Cultivation Research Institute，Shanghai Academy of Agriculturalsciences，Shanghai 201403，China；4School of Horticulture，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

Of 103-pairsSR primers，42 pairs of polymorphicsSR primers ofstable amplification were identified，being 40.8%of polymorphism ratio，and then used to evaluate thegenetic relationships of 117 maize inbred lines.The resultshowed that a total of 171 alleles were amplified by the 42-pairsSRs，the number of alleles per markersite ranged from 2 to 8，averaging 4.1，and the polymorphic information content（PIC）values were 0.73—0.90，averaging 0.82 each pair of primers.The 117 maize inbred lines were classified into threegroups by the UPGMA method，and the classified result basically conformed to their pedigree analysis.

Maize；Table corn；Inbred line；Geneticdiversity；SSR marker

S513

A

1000-3924（2016）04-011-06

2016-05-18

上海高校青年教師培養(yǎng)項目（ZZNL15001）；上海農(nóng)林職業(yè)技術學院院內項目（KY1-0000-15-01）

張微微（1981—），女，博士，高級工程師，研究方向：玉米遺傳育種。Tel：021-67722810，E-mail：zhangww@shafc.edu.cn

，Tel：021-67722800，E-mail：yupg@shafc.edu.cn