霍山石斛多糖單克隆抗體的制備及多糖組織分布研究

王長順

(合肥工業(yè)大學，安徽合肥 230009)

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霍山石斛多糖單克隆抗體的制備及多糖組織分布研究

王長順

(合肥工業(yè)大學，安徽合肥 230009)

[目的]探討霍山石斛多糖口腔注射后多糖在小鼠體內的分布狀況。[方法]以霍山石斛原球莖中提取的一種多糖與牛血清白蛋白偶聯(lián)后作為抗原，免疫小鼠獲得單克隆抗體，以獲得的單克隆抗體為一級抗體對小鼠進行免疫組織化學試驗。[結果]證實了CDAP活化法可有效偶聯(lián)多糖與蛋白質，且以制備的偶聯(lián)物能引起小鼠免疫反應從而制備出所需的單克隆抗體，利用獲得的活性較高、特異性較好的單克隆抗體得到多糖在小鼠組織的分布圖。[結論]該方法可為霍山石斛多糖進入機體后分布情況提供科學依據(jù)。

霍山石斛；多糖；單克隆抗體；免疫組織化學

霍山石斛(Dendrobiumhuoshanense)俗稱米斛，是蘭科石斛屬的草本植物，主產于大別山區(qū)的安徽省霍山縣，具有滋養(yǎng)陰津、護肝利膽、補益脾胃、降低血糖、抑制腫瘤及增強免疫力等特點[1]。目前，口服霍山石斛多糖進入機體內，引起活性的物質為多糖大分子還是多糖被分解后小分子引起的活性還不明確。單克隆抗體自問世以來，被廣泛應用于生物學領域，多糖類單克隆抗體的制備技術亦十分成熟，王厚延等[2]、姚文兵[3]先后成功地制備出了六味地黃多糖及靈芝多糖的單克隆抗體，為植物多糖藥理研究打下了良好的基礎。免疫組織化學是單克隆抗體代表性應用之一，利用帶顯色劑標記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗原抗體反應和組織化學反應的呈色現(xiàn)象，可以對相應的抗原進行定性、定位、定量的研究。為此，筆者以霍山石斛一種鹽洗多糖為材料，制備出其單克隆抗體，對灌胃后的小鼠做免疫組織化學試驗，探討引起多糖活性的物質為大分子多糖還是多糖小分子片段。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試材?；羯绞嗵怯珊戏使I(yè)大學生物與食品工程學院中草藥與功能食品研究所提供。SPF級昆明小白鼠(25±3 g)購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心，合格證號：皖醫(yī)實動準9901。

1.1.2試劑。1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸酯(CDAP)、牛血清白蛋白(BSA)、弗氏佐劑等，購自Sigma公司；HRP標記的羊抗小鼠Ig，購自武漢博士德生物工程有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基，購自賽默飛世爾生物有限公司。

1.1.3儀器。紫外可見分光光度計，北京瑞利分析儀器公司；CO2培養(yǎng)箱，SANYO公司；BM-Ⅱ型病理組織包埋機，安徽電子科學研究所；LeicaRM2145組織切片機，上海五相儀器儀表有限公司。

1.2方法

1.2.1多糖與蛋白的偶聯(lián)及分離純化。將20 mg多糖溶于水，配成10 mg/mL溶液，邊漩渦震蕩邊加入150 μL用乙腈配成的濃度為100 mg/mL CDAP溶液(加入過快，多糖會沉淀出來)，30 s后加入150 μL 0.2 mol/L TEA， 2 min后加入2 mL 20 mg/mL的BSA溶液(用pH 7.5的0.15 mol/L HEPES緩沖液溶解)，4 ℃反應過夜，再加入1 mL 3%乙醇胺溶液(用pH 7.5的0.75 mol/L HEPES緩沖液稀釋)終止反應，以0.15 mol/L氯化鈉為流動相、葡聚糖凝膠柱S-500為介質分離偶聯(lián)物，在280和490 nm處分別測蛋白與多糖的吸光值[4]。

1.2.2小鼠免疫。免疫前1 d剪鼠尾采集血液，收集血清作為對照。初次免疫取體重20～25 g BALB/c雌性KM小鼠5只，稱取600 μg多糖與蛋白偶聯(lián)物充分溶于0.75 mL生理鹽水中，吸入5 mL注射器中。將弗氏完全佐劑放入37 ℃水浴中預熱，振蕩2 min，使弗氏完全佐劑中的結核分枝桿菌均勻重懸后用5 mL注射器吸取0.75 mL弗氏完全佐劑，通過帶Luer-lock的雙乳化接頭將抗原與弗氏完全佐劑連接，平穩(wěn)推動活塞，使弗氏完全佐劑與抗原充分乳化，滴一滴乳化液于水中，小乳滴在水面形成穩(wěn)定的油珠。將乳化劑推入到一個注射器中，接上針頭，對小鼠進行多點皮下注射免疫，每只小鼠注射總量為200 μL。14 d后第1次加強免疫，將弗氏完全佐劑改為弗氏不完全佐劑與多糖蛋白偶聯(lián)物乳化，小鼠皮下多點注射。28 d后第2次加強免疫，操作同第1次。36 d 后收集小鼠血清測血清中抗體的效價，與免疫前血清一起比較對抗原的反應性。若檢測顯示血清效價<1∶1 000，42 d 后第3次加強免疫，方法同第1次;若檢測顯示血清效價>1∶1 000，不進行任何處理。52 d后將多糖蛋白偶聯(lián)物用無熱原的生理鹽水溶解,不加佐劑進行融合前的沖擊免疫，每只200 μL。有效途徑為靜脈注射，如不適合靜脈注射則腹腔注射。第55天眼球取血，收集血清留作陽性對照,收獲脾細胞與骨髓瘤細胞融合[5-8]。其中，對照組分別以多糖與牛血清白蛋白為免疫原注射小鼠皮下，方法同上。

1.2.3血清效價的檢測。稱取適量抗原，用抗原包被液溶解，制成160 μg/mL的溶液，加入到96孔酶標板中，每孔100 μL，2～8 ℃放置14～16 h后甩掉液體，用洗滌液洗3次，拍干。每孔加入100 μL封閉液，37 ℃孵育1 h。甩干液體，洗滌液洗3次，拍干，用稀釋液將小鼠血清按一定比例梯度稀釋，血清：PBS的體積比分別為1∶100、1∶1 000、1∶4 000、1∶16 000、1∶64 000，每孔各加100 μL，37 ℃孵育1 h后洗板3次，加入100 μL 1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗小鼠Ig，37 ℃溫育30 min，洗板3次，每孔再加入TMB底物終止液100 μL，溫室避光作用20 min，在酶標板上讀取450 nm處吸光值，P/N≥2.1為陽性，否則為陰性[9-13]。

1.2.4脾細胞與骨髓瘤細胞融合。

1.2.4.1骨髓瘤細胞制備。在雜交瘤細胞融合前10 d，將骨髓瘤細胞以8-雜氮鳥嘌呤(8-AG，15～20 mg/L培養(yǎng)基)處理，連續(xù)培養(yǎng)7 d，除去含次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT)的骨髓瘤細胞，然后用含15%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養(yǎng)液對骨髓瘤進行增殖培養(yǎng)，使細胞濃度在融合當天達到105個/mL,細胞用無血清培養(yǎng)基在4 ℃條件下1 500 r/min離心5 min，棄上清，洗3次，防止血清中蛋白質干擾膜融合,計數(shù)，重懸，調至細胞濃度為1×107個/mL。

1.2.4.2脾細胞的獲取。無菌取脾臟，加不含血清的培養(yǎng)基于培養(yǎng)皿中，300目紗布研磨，收集過濾后的細胞懸液，用無血清培養(yǎng)基洗3次，計數(shù)，離心，去上清，至室溫待用。

1.2.4.3細胞融合。將上述脾細胞與骨髓瘤細胞按5∶1于離心管中混合，1 500 r/min離心5 min，將上清倒干凈，置于37 ℃水浴中，1 min內邊震蕩邊加1 mL 1 g/mL的聚乙二醇(PEG-1500),靜置1 min后，2 min內緩慢加入2 mL預熱的無血清的培養(yǎng)基，4 min內邊混合邊加入8 mL完全培養(yǎng)基，4 ℃條件下1 500 r/min離心10 min，去上清。再加入含15%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，混勻后，將融合的細胞和滋養(yǎng)細胞移至培養(yǎng)瓶中,混合均勻，調至濃度為6.67×105個/mL,混勻后移至96孔板中，每孔150 μL,放到培養(yǎng)箱中，37 ℃，5% CO2(體積分數(shù))培養(yǎng)過夜，然后加入50 μL含20%FBS的RPMI1640完全培養(yǎng)基和4倍濃度的HAT培養(yǎng)4 d，4 d后半量換液，一周要換液3次，2周后用HT培養(yǎng)基代替HAT培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)3 d后，即可用含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)[14-16]。

1.2.5雜交細胞的篩選。融合后的雜交瘤細胞經含HAT和HT的培養(yǎng)基篩選后，存在多個脾細胞與一個骨髓瘤細胞融合或一個脾細胞與多個骨髓瘤細胞融合等現(xiàn)象，且多數(shù)為不能分泌所需抗體的雜交瘤細胞，需初步篩選出含有能分泌所需抗體的雜交瘤細胞孔，因雜交瘤細胞分泌的抗體會溶入到培養(yǎng)基中，取適量培養(yǎng)雜交瘤細胞的培養(yǎng)基，以160 μg/mL的多糖蛋白偶聯(lián)物包被96孔酶標板，采用間接ELISA法檢測培養(yǎng)基中抗體的效價。

1.2.6雜交細胞亞克隆。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗篩選出能分泌與抗原結合的抗體的孔，采用有限稀釋法進行亞克隆，克隆前1 d，用同系從未接觸過目的抗原的小鼠腹腔巨噬細胞制備滋養(yǎng)細胞，調節(jié)濃度為2×105個/mL,加到96孔板，每孔100 μL。取5 000個活的雜交瘤細胞，加入5 mL含HT完全培養(yǎng)基的聚丙烯錐形管中，依次進行10倍稀釋，可得濃度分別為100和10個細胞/mL的細胞懸液，在已添加過滋養(yǎng)細胞的96孔細胞培養(yǎng)板中每個孔加100 μL，使每個培養(yǎng)孔中分別含100、10、1個細胞/孔。分離篩選出陽性克隆，再進行2輪亞克隆篩選。

1.2.7腹水抗體的制備。

1.2.7.1單克隆抗體制備方法的選擇。單克隆抗體的生產既可以采用動物體作為生物反應器進行生產，又可以采用人工生物反應器培養(yǎng)雜交瘤細胞進行生產，結合實驗室現(xiàn)有的實際條件以及考慮到人工培養(yǎng)中不可避免的污染問題，該試驗選擇雄性小鼠體內誘生法，通過誘發(fā)實體瘤或腹水瘤，從腹水中提取McAb，該方法簡單、經濟，且可以有效避免因污染而導致細胞株的丟失問題[17-19]。

1.2.7.2雜交瘤細胞的注入。計劃注射雜交瘤細胞前14 d小鼠腹腔注射0.5 mL液體石蠟，第12天用新鮮的培養(yǎng)基傳代雜交瘤細胞，使其處于對數(shù)生長期，注射前用血球計數(shù)法確定活細胞比例達90%～100%，并用50 mL尖底離心管200 g 離心5 min，棄上清，用PBS重懸，使活細胞含量為10×106個/mL，每只小鼠腹腔注射0.5 mL雜交瘤細胞懸液[20-23]。

1.2.7.3單克隆抗體的收獲。小鼠腹腔注射雜交瘤細胞7 d后觀察小鼠腹腔(或稱重)，若腹腔腫大則進行第1次收獲腹水(一般小鼠體重不超過20%)。用18號針頭刺入小鼠腹腔，針頭直接對準10 mL離心管，若腹水不宜流出，需輕柔挪動針頭繼續(xù)引流。收獲的腹水1 500 g離心10 min，除去腹水中的細胞，第2次取腹水應在第1次穿刺的48 h之后進行，離心之后的腹水應在-20 ℃下保存。所有腹水收集完后離心，分裝在5 mL無菌離心管中并保存在-70 ℃條件下，每次使用取1管。

1.2.8抗體的純化與鑒定。

1.2.8.1純化。采用硫酸銨沉淀法將腹水在2 500 r/min下離心20 min，然后倒在一個潔凈的燒杯中，置于磁力攪拌器上，緩慢加入等體積的飽和硫酸銨溶液，在4 ℃下混合12 h。3 000 g離心30 min，棄上清(保留上清做后續(xù)檢測)向沉淀中緩慢加入150 mmol/L PBS溶液攪拌均勻，PBS大概為原液的50%。將預處理的抗體用20倍的PBS溶液透析，每2 h更換一次，更換3次[24]。

1.2.8.2紫外分光光度計鑒定法。含有芳香族氨基酸殘基(色氨酸、苯丙氨酸及酪氨酸)的蛋白質會在波長約280 nm處吸收光線能量。依據(jù)這3種氨基酸的已知數(shù)值，每種蛋白質都有不同的消光系數(shù)。對于免疫球蛋白，其成分的差異在很大程度上可以被忽略。吸光度越大，其蛋白質濃度越高,其中在濃度為1.0 mg/mL時，IgG、IgM、IgA、IgE的吸光度分別為1.36、1.18、1.32、1.53。

1.2.8.3SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定。聚丙烯酰胺凝膠為網(wǎng)狀結構，具有分子篩效應，SDS-PAGE凝膠電泳是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進SDS(十二烷基硫酸鈉)，SDS會與變性的多肽結合，并使蛋白帶負電荷，由于多肽結合SDS的量幾乎總是與多肽的分子量成正比而與其序列無關，因此SDS多肽復合物在丙稀酰胺凝膠電泳中的遷移率僅與多肽的大小有關。分離膠與濃縮膠的配比見表1。

表1　分離膠和濃縮膠的制備

1.2.8.4間接ELISA鑒定法。獲得的抗體不僅需要知道其濃度與純度，還需知道其是否為所需抗體及其活性，采用間接ELISA法解決以上問題，方法同“1.2.3”血清效價的檢測，將血清換成制備的抗體。

1.2.9免疫組化。免疫組化是應用免疫學基本原理——抗原抗體反應，即抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑顯色來確定組織細胞內抗原，對其進行定位、定性及定量的分析。小鼠灌胃0.2 mL霍山石斛多糖(濃度150 mg/kg)后，分別取出小腸、肝、脾、腎和肺，PBS溶液洗滌后置于4%的中性甲醛溶液中固定6 h，進行免疫組織化學分析。

2　結果與分析

2.1免疫抗原的純度由圖1可知，多糖與蛋白的出峰時間分別為65和63管左右，47～58管多糖與蛋白發(fā)生了偶聯(lián)，收集此部分的偶聯(lián)物經濃縮、透析，0.22 μm微孔濾膜過濾后上高效液相得到HPLC圖，從圖2可看出在19.087 min出現(xiàn)最高峰，且出峰較對稱，可知獲得的多糖蛋白偶聯(lián)物成分較單一。

圖1　多糖-蛋白偶聯(lián)物(a)、多糖(b)和BSA(c)層析洗脫曲線Fig.1　Polysaccharide-protein conjugate(a), polysaccharide(b) and BSA(c) chromatography elution curve

圖2　多糖-蛋白偶聯(lián)物的HPLC圖Fig.2　HPLC of polysaccharide-protein conjugate

2.2血清效價的檢測以多糖-蛋白偶聯(lián)物作為抗原免疫小鼠，從表2可以看出，經免疫后小鼠血清對多糖-蛋白偶聯(lián)物表現(xiàn)出明顯的抗原-抗體反應，說明小鼠血清中具有較高的抗多糖-蛋白偶聯(lián)物的抗體。

2.3抗體鑒定

2.3.1抗體濃度的測定。采用考馬斯亮藍法和紫外分光光度計法測定抗體的濃度：將制備的單抗稀釋10倍后，通過考馬斯亮藍法在595 nm處測得吸光值為0.735，根據(jù)蛋白質標準曲線y=0.006 4x+0.165算出蛋白質含量約為0.89 mg/mL。取適量的抗體等量稀釋后，通過紫外分光光度計測得在280 nm處的吸光度為0.62，根據(jù)免疫球蛋白吸光系數(shù)可算出單抗的濃度為0.91 mg/mL。

2.3.2SDS-PAGE。SDS為一種陰離子去污劑，其通過裹包多肽骨架可使蛋白質變性并使整條多肽鏈帶負電荷,且所帶的負電荷遠遠超過了蛋白原有的電荷量，消除了不同分子

表2　多糖-蛋白偶聯(lián)物為免疫原的血清效價檢測

間的電荷差異和結構差異，這樣，樣品的遷移率并不取決于蛋白質原有的電荷量而是由相對分子質量的大小決定。從圖3可以看出，完整的單克隆抗體與70 kDa蛋白質標準品的遷移位置基本一致，下面有較淺的條帶可能是抗體碎片或純化過程中未除去的雜蛋白，且濃度較低。

圖3　單克隆抗體的SDS-PAGEFig.3　Monoclonal antibodies SDS-PAGE

2.3.3間接ELISA法鑒定抗體。以多糖-蛋白偶聯(lián)物包被酶標板，試驗組用制備的單抗作為一抗，空白組用等量PBS，通過間接ELISA法在450 nm處測吸光值。通過5次平行試驗得到，試驗組在450 nm處有明顯吸光值，較空白組高很多，說明制備的抗體中有能特異性結合多糖的抗體，且抗體的活性較好。

2.4多糖的組織分布由圖4可知，小腸中有明顯的顯色反應(紅色熒光)，其他組織均沒有，說明霍山石斛多糖可以原型分布于腸腔中。許多研究已經表明，霍山石斛多糖具有顯著的免疫調節(jié)效應，除腸腔外在其他組織均未檢測到霍山石斛多糖，可能表明霍山石斛多糖不被機體吸收，而是通過調節(jié)腸道黏膜免疫活性以達到調節(jié)機體系統(tǒng)免疫的功能；或霍山石斛多糖以原型被吸收后降解成片段發(fā)揮作用，也有可能在腸腔中被降解后進入體內發(fā)揮作用，無論是哪種降解方式，可能由于多糖抗原表位被破壞，導致該試驗未能檢測到多糖在腸腔以外其他組織中的分布。

注：a1、b1為腸組織；a2、b2為脾組織；a3、b3為肺組織；a4、b4為肝組織；a5、b5為腎組織。Note: a1, b1. Intestinal tissue; a2, b2. Spleen tissue; a3, b3. Lung tissue; a4, b4. Hepatic tissue; a5, b5. Renal tissue.圖4　空白對照組(a)和試驗組(b)多糖在不同組織中的分布(×200)Fig.4　Distribution of blank control group(a) and test group(b) polysaccharides in different tissues

3　結論

(1)經HPLC分析證明試驗所用的霍山石斛多糖為均一多糖，CDAP法可有效將多糖與牛血清白蛋白偶聯(lián)在一起，且經葡聚糖凝膠S-500分離得到的多糖-蛋白偶聯(lián)物的成分均一。

(2)以制備的多糖-蛋白偶聯(lián)物為免疫原免疫小鼠，將獲得的脾細胞與骨髓瘤細胞融合后制備雜交瘤細胞，經過多輪篩選，能篩選出穩(wěn)定分泌抗霍山石斛多糖單克隆抗體的雜交瘤細胞。

(3)將能穩(wěn)定分泌抗霍山石斛多糖單克隆抗體的雜交瘤細胞注入小鼠腹腔后，通過小鼠腹水可以大量制備單克隆抗體。經硫酸銨沉淀法純化后獲得的抗霍山石斛多糖單克隆抗體，鑒定后證明對霍山石斛多糖具有較高的特異性結合能力。

(4)通過免疫組織化學試驗發(fā)現(xiàn)，除腸腔外在其他組織均未檢測到霍山石斛多糖，出現(xiàn)這種情況有2種可能：一種是霍山石斛多糖通過調節(jié)腸道黏膜免疫活性來達到調節(jié)機體免疫功能；第2種可能是多糖進入腸腔后被分解成片段，這些片段進入各組織中發(fā)揮作用，而由于這些片段上的抗原表位被破壞了，因此，制備的單克隆抗體未能特異性地識別到它們。

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Preparation ofDendrobiumhuoshanensePolysaccharide Monoclonal Antibodies and Distribution in Tissues

WANG Chang-shun

(Hefei University of Technology, Hefei, Anhui 230009)

[Objective]To discuss the distribution of polysaccharides in mice after oral injection withDendrobiumhuoshanensepolysaccharide.[Method]Conjugating the polysaccharides to bovine serum albumin as an antigen, monoclonal antibodies were obtained and used as primary antibody to conduct immuno histochemistry experiments.[Result] It was confirmed that CDAP activation method can effectively couple polysaccharides and proteins, the obtained conjugates can induce the immune response of mice to produce the required monoclonal antibody. Distribution of polysaccharides in mouse tissues was obtained by using monoclonal antibody with high activity and specificity. [Conclusion] The method can provide scientific basis for distribution ofDendrobiumhuoshanensepolysaccharide in mice.

Dendrobiumhuoshanense; Polysaccharide; Monoclonal antibodies;Immuno histochemistry

國家自然科學基金(21006019)。

王長順(1987-)，男，吉林通化人，碩士研究生，研究方向：分子生物學。

2016-06-12

S 567.2

A

0517-6611(2016)21-100-04