楊樹修復阿特拉津污染土壤的根際微生物碳源利用研究

姚　斌　張靜茹，　韋秀文　劉　方　陳燦燦

(1.中國林業(yè)科學研究院荒漠化研究所，北京 100091；2.貴州大學環(huán)境與資源工程學院,貴州 貴陽 550002；3.海南省環(huán)境科學研究院，海南 海口 570206；4.河南理工大學萬方科技學院，河南 鄭州 451400)

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楊樹修復阿特拉津污染土壤的根際微生物碳源利用研究

姚斌1張靜茹1，2韋秀文3劉方2陳燦燦4

(1.中國林業(yè)科學研究院荒漠化研究所，北京 100091；2.貴州大學環(huán)境與資源工程學院,貴州 貴陽 550002；3.海南省環(huán)境科學研究院，海南 ?？?570206；4.河南理工大學萬方科技學院，河南 鄭州 451400)

以雜交楊樹作為修復研究對象，利用根箱和Biolog系統(tǒng)開展阿特拉津污染土壤不同酸堿調節(jié)劑處理樹木修復過程中不同根際微生物多樣性研究。結果表明：樹木修復初期(第30 d)酸堿調節(jié)劑對土壤微生物活性及其群落碳源利用表現(xiàn)出顯著的促進作用；而至修復第90 d時，酸性調節(jié)劑處理土壤的微生物活性及其群落碳源利用能力開始回落下降，甚至低于單純植入楊樹處理，而堿性調節(jié)劑的施用仍然對土壤微生物活性及其微生物群落碳源利用能力具有顯著的促進效果。但楊樹樹木修復阿特拉津污染土壤過程中根際微生物整體活性及其群落結構演變并沒有表現(xiàn)出穩(wěn)定的規(guī)律性。鑒于Biolog ECO碳源有限，并不能完全反映土壤微生物群落結構的功能多樣性，不同酸堿調節(jié)劑處理楊樹修復土壤阿特拉津污染過程中根際微生物活性及群落結構不規(guī)律變化的原因及相關機理，還有待結合更精密的分析測試手段作進一步深入研究。

楊樹；根箱；阿特拉津；微生物；平均吸光值；多樣性

2001年，美國密歇根州立大學的學者在植物修復的基礎上首創(chuàng)了樹木修復(dendroremediation)[1]。樹木修復主要是利用木本植物對污染土壤進行植物修復，樹木通過固定、揮發(fā)和吸收、植物和根際降解等形式對土壤有機物污染起凈化作用[2-4]，為真正的原位修復，在此過程中根際微生物發(fā)揮著重要的作用。作為生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，土壤中的微生物以其豐富的生物多樣性使其成為生態(tài)系統(tǒng)中最活躍和具有決定性影響的組分之一[5]。土壤微生物群落功能多樣性是土壤微生物群落狀態(tài)與功能的指標，反映土壤中微生物的生態(tài)特征[6]，對明確不同環(huán)境中微生物群落的作用具有重要意義。Biolog微平板法不僅靈敏度高，分辨力強，測定簡便，而且無需分離培養(yǎng)純種微生物[7]，能較快捷、敏感地反映土壤微生物群落特征的變化，且能獲得豐富的信息[8]，因此，廣泛應用于土壤微生物群落功能多樣性的研究[9]，為評價微生物多樣性提供了一個可行的、生態(tài)相關的測量方法[10]。

有研究表明，楊樹具有較強的去除環(huán)境中阿特拉津等有機污染物的能力[10-12]，如Burken J等將楊樹(Populusspp.)種植在含有阿特拉津的基質上，培養(yǎng)80 d后從楊樹的根、莖和葉中提取到了阿特拉津及其代謝產物，并且基質中被楊樹吸收的阿特拉津占了相當比例[13]。Chang S的試驗也同樣證實，楊樹能夠吸收阿特拉津，并水解、烷基化為毒性小的代謝物[14]。具體實踐中楊樹修復污染土壤的根際環(huán)境和微生物的研究相對較少，而國內這方面的研究則更少，為了初步探索楊樹修復阿特拉津污染土壤過程中土壤微生物的生態(tài)環(huán)境效應，本研究采用包含31種碳源的Biolog ECO微平板，研究楊樹修復阿特拉津污染土壤過程中施入不同酸堿調節(jié)劑對土壤微生物群落功能多樣性的影響，探討土壤微生物群落功能差異的可能原因，從微生物功能多樣性的角度闡明阿特拉津污染土壤樹木修復過程中的環(huán)境效應。

1　材料與方法

1.1試驗材料

供試土樣采自北京昌平區(qū)表層0～15 cm的土壤，采集帶回實驗室后及時撿去植物殘體后分成2部分。一部分土壤直接過1 mm篩，混合均勻，供盆栽試驗用；另一部分風干、研磨，過60目篩，用于土壤基本性質的測定及污染母土的制備。供試土壤基本理化性質為：粘粒32.04%，有機質17.59 g/kg，pH(H2O) 7.64，全氮1.13 g/kg，全磷(P2O5)1.99 g/kg，全鉀19.86 g/kg，速效鉀172 mg/kg，有效磷38.6 mg/kg，堿解氮80 mg/kg。根據調查分析，土樣中未檢出阿特拉津殘留。

試驗用楊樹(Populusdeltoids×nigra，DN34)由美國密蘇里-羅拉大學的Burken博士提供。

1.2試驗方法

1.2.1土樣制備參照文獻[15]制備濃度為10 mg/kg的阿特拉津污染土壤，每個根箱(rhizobox)的用土量為10 kg；選擇升華硫和氫氧化鈣作為酸堿調節(jié)劑調節(jié)土壤pH[16]：。試驗設置：1)CK(不種樹不調節(jié)pH)；2)A處理(種樹不調節(jié)pH)；3)S處理(種樹+外源添加升華硫)；4)Ca處理(種樹+外源添加氫氧化鈣)。處理的基本情況見表1，每個處理重復5次。

表1　試驗處理的基本情況

1.2.2根箱栽培修復試驗參照文獻[17]設計、制備根箱。該裝置用PVC板加工制成，箱長30 cm、寬30 cm、高25 cm，中室(即楊樹生長室)寬10 cm。中室兩邊分別插入2張<25 μm尼龍撩網制成的1 mm厚插片將植物根系限制于室內生長，實現(xiàn)根際(G)、近根際(J)及遠根際(Y)土壤樣品的分室采樣。因試驗布置時供試土壤充分混合且CK處理不種樹不加酸化劑，故該處理根箱不進行分室處理。

根箱栽培修復試驗于2009年于中國林業(yè)科學研究院溫室進行，該溫室為可控溫度和水分的現(xiàn)代化大型科研溫室，光照充足，能夠滿足楊樹的正常生長發(fā)育。2009年4月開始試驗，10月結束。試驗過程中定量澆水，確保盆內水不外溢，防治污染物隨水流失影響試驗結果。分別在楊樹移栽后第0、30、90天取樣分析測定。

1.3測試方法

參照Girvan M等[18]的方法，采用Biolog Eco(BiologIne.，Hayward，CA，US)測試盤來評價土壤微生物的功能多樣性。為保證相同質量的土樣用于分析，準確稱取相當于10.0 g干質量(按含水量換算)的新鮮土樣，加入到裝有90 mL無菌水的三角瓶中，封口后在搖床上震蕩(200 r/min)30 min，按照10倍稀釋法將無菌水稀釋3次(10-3)，取上清液用8通道加樣器將稀釋液接種到Biolog Eco微孔板的微孔內，每孔為150 μL。每處理1板，重復3次。接種后的測試盤在25 ℃下培養(yǎng)7 d，期間每隔24 h用Biolog ELX808(Hayward，CA，USA)自動讀盤機在590 nm下測定吸光值，使用 Mierolog 3.4.2軟件(BiologInc.)轉化數(shù)據。選取96 h的數(shù)據進行主成分分析。

1.4數(shù)據分析

申圭植這位把一生獻給了韓國民族獨立的革命家，對韓國青年的厚望，也寄托在云南陸軍講武堂上。而這些學生，也確實很爭氣。學員之一的閔石麟說：“先生的語聲很低，卻象鐵錘似的擊著聽者的耳鼓。”而李范奭也用行動表示自己的決心?！捌疵霉Γ瑢以囕m獲第一。軍校規(guī)矩，熄燈后照例不準有火燭，他則想盡辦法，偷點蠟燭，通宵苦讀，至于鼻子流血，苦讀仍不輟?！?/p>

利用SPSS 16.0及DPS統(tǒng)計軟件分析數(shù)據。研究微生物群落的差異和分析不同處理間的關系需要聯(lián)系環(huán)境因子進行分析，最常用的是相關分析和回歸分析。平均吸光值(AWCD)、多樣性指數(shù)、主成分分析(PCA)等特征參數(shù)均可作為由Biolog原始數(shù)據抽提的新變量，分析其與環(huán)境因子的關系[19]。

2　結果與分析

2.1土壤微生物的平均吸光值

平均吸光值(AWCD)可以作為土壤微生物整體活性的有效指標[20]，AWCD 值的變化速度(斜率)和最終能達到的AWCD值反映了土壤微生物利用某一碳源物質的能力。

不同酸化劑對土壤阿特拉津污染楊樹修復過程中微生物的生理活性及群落碳源利用能力造成了很大影響，且不同階段有所區(qū)別。分析結果見圖1。

由圖1可知，第30天取樣分析的AWCD值大小順序為：Ca處理﹥S處理﹥A處理﹥CK；第90天時AWCD值大小順序變?yōu)椋篊a處理﹥A處理﹥CK﹥S處理。第30天時酸堿調節(jié)劑處理的AWCD值均高于對照CK，方差分析結果表明，Ca處理和S處理的AWCD值與CK差異極顯著(P<0.01)?？赡苁且驗闂顦渲踩牒髮е赂H微環(huán)境的變化[21]，提高了土壤微生物群落碳源利用的能力，土壤微生物表現(xiàn)出較高的活性；另外，酸堿調節(jié)劑的施入對土壤微生物的活性造成了明顯影響，大大增加了微生物的數(shù)量和整體活性。已有研究表明，外源物質的施用會對土壤微生物活性及數(shù)量等產生影響[22]。

各處理不同取樣時段不同根際區(qū)域AWCD的方差分析結果表明：CK的AWCD值在不同根際區(qū)域的差異不顯著；Ca處理，第30天和第90天時根際區(qū)域G的AWCD值均小于J、Y，且其值差異顯著(P﹤0.05)。

總體而言，在試驗中根際區(qū)域的AWCD值沒有表現(xiàn)出穩(wěn)定的規(guī)律性。有研究表明，土壤微生物群落的酶鏈反應速度和最終能達到的程度，與群落能利用單一碳底物的微生物數(shù)目和種類有關[23]，Biolog Eco并不能完全反映整個土壤微生物群落的功能多樣性[24]，其中發(fā)現(xiàn)31種培養(yǎng)基存在選擇培養(yǎng)問題，只有能夠利用Biolog Eco微孔板上碳源的微生物才能反映出來，因此只代表了整個微生物群落的一部分；另外，酸堿調節(jié)劑改變了土壤的微環(huán)境，微生物的群落結構和數(shù)量也將相應發(fā)生變化，以適應新的環(huán)境；加之，可被土壤微生物作為碳源、氮源利用的阿特拉津及其代謝產物含量的變化，也不同程度地影響了不同根際區(qū)域微生物的活性及數(shù)量[25]。因此，酸化劑處理楊樹修復土壤阿特拉津污染過程中，根際區(qū)域微生物活性及群落結構不規(guī)律變化的原因及相關機理還有待進一步深入研究。

2.2土壤微生物碳源利用多樣性的主成分分析

運用主成分分析(principal component analysis，PCA)方法展示土壤微生物對不同碳源利用能力的差異，有助于更全面地了解微生物群落代謝功能特性[8]。本研究采用培養(yǎng)96 h的31種碳源吸光值降維后進行主成分分析，重點討論PCA1和PCA2信息反映的結果。第30天和第90天的主成分分析結果見圖2。

由圖2可知，CK與A處理在PCA1軸上的得分非常接近，說明第30天時楊樹對阿特拉津污染土壤的修復效果仍不理想；Ca處理和S處理與CK在PCA1軸上的得分值之間有較好的分離，且得分值分離較好。也就是說，第30天時不同土壤酸堿調節(jié)劑對土壤微生物的刺激效應顯著，增強了土壤微生物對碳源的利用能力，且堿性調節(jié)劑對增強土壤微生物的碳源利用能力效應最為明顯。

由圖2還可知，CK與S處理在PCA1軸上的得分非常接近，而Ca處理和A處理在PCA1軸上的得分值分離較好。分析結果表明，第9天時土壤酸性調節(jié)劑處理土壤微生物對碳源的利用能力降低，其微生物活性與CK相當；堿性調節(jié)劑對土壤微生物具有較為明顯的激活效應。研究結果表明，農藥可以間接通過改變根際滲出物的化學性質或直接引起根際微生物群落的顯著變化[26]。通過比較Ca處理不同根際區(qū)域在PCA1軸上的得分情況，發(fā)現(xiàn)根際區(qū)域G與J、Y有很好的分離，由此表明，Ca處理各區(qū)域間差異較為顯著，根際區(qū)域G的土壤微生物對碳源利用力較區(qū)域J、Y低；同時通過對比不同修復時段區(qū)域間的變化發(fā)現(xiàn)，區(qū)域G在PCA1軸上的得分值上升最為迅速。導致此結果的可能原因為：一方面楊樹的大量根系生長在根室有限的空間，吸附的較多阿特拉津及其代謝產物對微生物產生較其他區(qū)域大的生物毒性，總體降低了該區(qū)域土壤微生物對碳源利用能力；另一方面，伴隨可供土壤微生物利用根系分泌物的量增加，該區(qū)域土壤微生物的活性及數(shù)量會逐漸增強，從而導致在取樣后期土壤微生物對對碳源利用能力上升的現(xiàn)象。

3　結　語

Biolog微平板法廣泛應用于土壤微生物群落功能多樣性的研究，為評價微生物多樣性提供了一個可行的、生態(tài)相關的測量方法。研究結果表明，阿特拉津污染土壤修復過程中施用不同酸堿調節(jié)劑的楊樹處理在修復第30天時對土壤微生物整體活性及其群落碳源利用能力表現(xiàn)出顯著的促進作用；而修復第90天時，酸性調節(jié)劑處理的微生物活性及其群落碳源利用能力開始回落下降，甚至低于單純植入楊樹處理，而堿性調節(jié)劑的施用仍然對微生物活性及其微生物群落碳源利用能力具有顯著的促進效果。總體而言，修復過程中楊樹根際區(qū)域微生物整體活性及其群落結構演變并沒有表現(xiàn)出穩(wěn)定的規(guī)律性。鑒于Biolog ECO碳源有限，并不能完全反映土壤微生物群落結構的功能多樣性的事實，楊樹不同酸堿調節(jié)劑處理樹木修復土壤阿特拉津污染過程中根際區(qū)域微生物活性及群落結構不規(guī)律變化的原因及相關機理，還有待結合更精密的分析測試手段作進一步深入研究。

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(責任編輯韓明躍)

Microbial Community Characteristics in the Rhizosphere of Atrazine-Contaminated Soil by Dendroremediation of Poplar

Yao Bin1,Zhang Jingru1，2,Wei Xiuwen3,Liu Fang2,Chan Cancan4

(1. Institute of Desertification studies, Chinese Academy of Forestry, Beijin 100091, China;2. College of Resource and Environment Engineering, Guizhou University, Guiyang Guizhou 550025, China;3.Hainan Research Academy of Environmental Sciences, Haikou Hainan 570206, China;4.Wan Fang College of Sciences and Technology, HPU, Zhengzhou Henan 451400, China)

The change of microbial community characteristics in the different rhizosphere zero of hybrid poplars(Populusdeltoids×nigra,DN34) under atrazine stress were investigated by rhizo-box and Biolog system in a green house experiment，with sublimed sulfur and calcium hydroxide as soil pH regulators. Data from measure by Biolog ECO plate demonstrated that the value of average well color development (AWCD) and the carbon source utilization of microorganism in soil amending soil pH regulators was promoter than CK during the initial 30 days; While the results from the 90 days indicated that the activity and the carbon source utilization of soil microbe in acid regulator treatment began to fall down, even lower than that of poplar implant treatment, then the alkaline treatment still stimulated and promoted the activity and the carbon source utilization ability of soil microbe. Overall, the activity and community structure of soil microbe in rhizosphere regional of atrazine-contaminated soil did not show steady regularity during the phytoremediation process by using hybrid poplars(Populusdeltoids×nigra，DN34). For the reason that the Biolog ECO plate, which only had 31 kinds of carbon sources, could not really indicate the detail information about the function diversity of community structure of soil microbe. So it’s essential for us to take more sophisticated analysis tools for further study.

poplar; rhizo-box; atrazine; edaphon; microbe; diversity

2015-03-02

國家自然科學基金項目(30700637)資助；中央公益型科研院所基本科研業(yè)務費專項資金項目(CAFRIF200706)資助。

劉方(1964—)，男，博士，教授，博士生導師。研究方向：喀斯特生態(tài)環(huán)境。Email：lfang6435@163.com。

10.11929/j.issn.2095-1914.2016.01.006

S718.8

A

2095-1914(2016)01-0033-05

第1作者：姚斌(1973—)男，博士，副研究員。研究方向：生態(tài)恢復及荒漠化防治。Email：acmn21@caf.ac.cn。