云南特有火把梨UFGT基因片段的克隆與序列分析

孟富宣　周　軍　王大瑋　陶　磅　董　嬌　徐世宏　段淋淵

(1.云南省高校林木遺傳改良與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱區(qū)生態(tài)農(nóng)業(yè)研究所，云南 元謀 651300；3.西南山地森林資源保育與利用省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；4.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南 昆明 650224；5.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所,云南 昆明 650000；6. 中華全國(guó)供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650223)

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云南特有火把梨UFGT基因片段的克隆與序列分析

孟富宣1，2,3,4周軍1,3,4王大瑋3,4陶磅5董嬌6徐世宏3,4段淋淵3,4

(1.云南省高校林木遺傳改良與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱區(qū)生態(tài)農(nóng)業(yè)研究所，云南 元謀 651300；3.西南山地森林資源保育與利用省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；4.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南 昆明 650224；5.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所,云南 昆明 650000；6. 中華全國(guó)供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650223)

為研究UFGT基因?qū)t皮梨花色素苷合成的調(diào)控機(jī)制，以云南特有火把梨為試材，克隆得到UFGT的基因片段，運(yùn)用生物信息學(xué)分析軟件對(duì)該基因序列進(jìn)行分析。結(jié)果表明：UFGT基因片段長(zhǎng)1 440 bp，編碼479個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)；該氨基酸序列與沙梨、西洋梨、白梨、蘋果和櫻桃李的同源性分別為99%、96%、94%、91%和72%；蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)，不存在導(dǎo)肽和信號(hào)肽，屬于非分泌蛋白，定位在胞液；結(jié)構(gòu)功能域分析顯示該片段含典型的GT1_Gtf_Like功能域和1個(gè)GTB型超家族蛋白的典型結(jié)構(gòu)。

火把梨；UFGT；基因克隆；生物信息學(xué)

火把梨(Pyruspyrifoliacv.‘Huobali’)是云南本地沙梨品種，云南當(dāng)?shù)厮屑t皮梨的統(tǒng)稱?；鸢牙婢哂蟹€(wěn)定遺傳的紅色果皮表型，原產(chǎn)于云南大理和周邊丘陵山地地區(qū),其適應(yīng)性較強(qiáng)，耐低溫，抗晚霜，抗黑星病、腐爛病，對(duì)梨木虱也有較強(qiáng)抗性，因其品質(zhì)優(yōu)、營(yíng)養(yǎng)保健作用明顯而受到植物學(xué)家的重視。

UFGT是花色素苷合成途徑中最后一個(gè)酶(黃酮-3-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶)的基因[1]，負(fù)責(zé)將糖基連接到不穩(wěn)定的花青素上，從而使花青素變成穩(wěn)定的花色素苷[2-3]?；ㄉ剀諏儆陬慄S酮合成途徑中一個(gè)有色末端產(chǎn)物，是存在于植物體內(nèi)的一大類重要次生物質(zhì)；此外，花色素苷廣泛存在于被子植物表皮細(xì)胞的液泡中，賦予植物花、葉、果實(shí)等器官各種色澤。

Kondo等人認(rèn)為UFGT與花色素苷的表達(dá)密切相關(guān)[4]。目前，對(duì)于UFGT的克隆、表達(dá)及功能分析，國(guó)內(nèi)外學(xué)者作了很多工作，已經(jīng)從蘋果(Malussylvestrisvar.domestica)[5]、葡萄(Vitisamurensis)[6]、海棠(Maluscrabapple)[7]、馬鈴薯(Solanumtuberosum)[8-9]、荔枝(Litchichinensis)[10-11]中克隆得到了UFGT基因，并進(jìn)行了相應(yīng)的表達(dá)分析。目前,已經(jīng)證明UFGT是葡萄[12]和蘋果花色素苷合成的關(guān)鍵基因[5,13]。對(duì)葡萄的研究顯示，白皮葡萄及其紅色突變種中均有UFGT基因，且編碼區(qū)結(jié)構(gòu)相同；黃皮葡萄中也存花色素苷合成相關(guān)基因，只是其表達(dá)豐度較紅色品種弱[2]。胡福初等[14]對(duì)‘糯米糍’荔枝研究發(fā)現(xiàn)，綠果果皮中未檢測(cè)到UFGT基因的表達(dá)，轉(zhuǎn)黃期少量表達(dá)，果實(shí)成熟時(shí)該基因表達(dá)量增加，并初步確定UFGT在荔枝果皮花色素苷合成過程中起著重要的作用。李俊才等[15]從紅巴梨果皮中克隆了UFGT基因，發(fā)現(xiàn)隨著果實(shí)的成熟該基因的表達(dá)強(qiáng)度降低，成熟期是幼果期的50%，在果肉中則不表達(dá)。Fischer等人[16]從西洋梨(Pyruscommunis)中克隆到了花色素苷合成途徑中的部分基因。而有關(guān)火把梨UFGT基因克隆的研究還鮮有報(bào)道。

本試驗(yàn)以云南火把梨為試材，采用同源克隆的方法克隆得到了UFGT基因片段，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以期為UFGT全長(zhǎng)的克隆、結(jié)構(gòu)功能分析以及該基因在火把梨花色素苷生物合成途徑中的作用等研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1植物材料

試驗(yàn)所需植物材料采自云南安寧市清水河紅皮梨種質(zhì)基地和昆明市團(tuán)結(jié)鎮(zhèn)大河果園，采摘成熟且著色均勻的火把梨帶回實(shí)驗(yàn)室后立即用刀削下果皮，用液氮作保鮮處理，并保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2試驗(yàn)方法1.2.1RNA的提取與cDNA合成采用購自Sigma公司的OMEGA提取試劑盒(E.Z.N.A.TMPlant RNA Kit) 對(duì)火把梨總RNA進(jìn)行提??；cDNA第一鏈的合成使用北京天根生化科技有限公司的TIANscript cDNA 第一鏈合成試劑盒。

1.2.2引物設(shè)計(jì)與基因克隆通過對(duì)GenBank中多個(gè)UFGT同源基因序列進(jìn)行比對(duì)后設(shè)計(jì)引物，UFGT(f1)：5’- ATGCTACTTCAAAAGGGTCGGCTC -3’，UFGT(r1)：5’-CTATGCTTTCTTGGATCCTGATAT-3’；UFGT(f2)：5’-ATGGCAGCGCCGCTGCCCATCG-3’，UFGT(r2)：5’-CTATGCTTTCTT GGATCCTG-3’。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。1.2.3序列分析UFGT基因測(cè)序由上海生物工程股份有限公司完成，序列的生物信息學(xué)分析軟件見表1。

表1　序列分析相關(guān)軟件及分析內(nèi)容

2　結(jié)果與分析

2.1總RNA的提取

本試驗(yàn)提取了火把梨果皮的總RNA，電泳檢測(cè)結(jié)果見圖1。從圖1可看出：所提取RNA的25S和18S條帶均清晰可見，將RNA于-80 ℃冰箱保存，用于cDNA第1鏈的合成。

2.2UFGT基因片段的克隆

以火把梨果皮的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物約為1 500 bp(圖2)，該片段大小與預(yù)期一致。PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序結(jié)果拼接后得到1 440 bp的片段，編碼479個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(圖3)。與其他物種的氨基酸序列進(jìn)行BLAST同源比對(duì)結(jié)果顯示：與沙梨(Pyruspyrifolia,AFQ92055)、西洋梨(AGL81353)、白梨(Pyrusbretschneideri, AGZ15304)、蘋果(Malusdomestica,XP_008357063)、櫻桃李(Prunuscerasifera,AKV89253)的同源性分別是99%、96%、94%、91%、72%；與桃(Prunuspersica,XP_007217952)和梅(Prunusmume,XP_008234582)的同源性均為71%；與甜櫻桃(Prunusavium,AHL45018)、野草莓(Fragariavesca,XP_004307876)、美洲葡萄(Vitislabrusca,ABR24135)、荔枝(Litchichinensis,AED02461)和擬南芥(Arabidopsisthaliana,NP_197207)的同源性為70%、61%、56%、53%、52%。

2.3序列生物信息學(xué)分析

2.3.1UFGT序列的多重比對(duì)與聚類分析用Clustal W2軟件將克隆得到的火把梨UFGT氨基酸序列與沙梨、西洋梨、中國(guó)白梨、蘋果、桃、梅子的氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)，結(jié)果見圖4。采用軟件MEGA5構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，確定UFGT的進(jìn)化地位(圖5)。從圖5可知：火把梨與沙梨、西洋梨、中國(guó)白梨、蘋果、櫻桃李、桃、梅、草莓均在一個(gè)大類群中；同科植物梨和蘋果在一個(gè)亞類上，其親緣關(guān)系較近；獼猴桃(Actinidiachinensis)、荔枝單獨(dú)聚為一類，美洲葡萄、擬南芥聚在同一類群中，這與分類學(xué)上的結(jié)論相符合。

2.3.2UFGT蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)的的預(yù)測(cè)ProtParam分析顯示，UFGT蛋白的分子量大約為52.0 kDa，等電點(diǎn)為6.08。溶液中的不穩(wěn)定指數(shù)是38.11，低于域值40，因此，在體外UFGT可能屬于穩(wěn)定蛋白。此外，預(yù)測(cè)顯示，UFGT的脂肪系數(shù)、平均疏水性分別為98.68、0.018。UFGT有負(fù)電荷殘基(Asp+Glu)50個(gè)，正電荷殘基44個(gè)。在線軟件SignalP 4.1分析結(jié)果顯示，UFGT無信號(hào)肽，屬于非分泌蛋白。WoLF PSORT亞細(xì)胞定位顯示，UFGT為細(xì)胞質(zhì)蛋白，分析認(rèn)為UFGT蛋白極有可能合成于細(xì)胞質(zhì)，通過信號(hào)肽定位于細(xì)胞液。

2.3.3UFGT蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)用PredictProtein在線服務(wù)器對(duì)云南火把梨UFGT氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)(圖6)，結(jié)果顯示：UFGT基因所編碼的蛋白由39.33%的α-螺旋(alpha helix)、13.18%的β-轉(zhuǎn)角(beta turn)和47.49%的無規(guī)則卷曲(random coil) 組成；α-螺旋和無規(guī)則卷曲是云南火把梨UFGT蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要結(jié)構(gòu)元件，β-轉(zhuǎn)角散布于整個(gè)蛋白質(zhì)序列中。由于蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)與其功能緊密相關(guān)，采用Swiss-Model Workspace同源建模預(yù)測(cè)火把梨UFGT的三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖7)，結(jié)果處理采用Pymol軟件?；赟wiss Model的Ramachandran圖(圖8)表明，預(yù)測(cè)的UFGT蛋白質(zhì)殘基，有90%以上的二面角是位于黃色的核心區(qū)域內(nèi)，推測(cè)其空間結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，且空間障礙較小。

2.3.2UFGT蛋白功能域預(yù)測(cè)用NCBI提供的Conserved Domains Search service對(duì)云南火把梨UFGT蛋白功能域進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果見圖9。結(jié)果表明：該蛋白含有1個(gè)GT1_Gtf_Like功能域和1個(gè)GTB型超家族蛋白的典型結(jié)構(gòu)。GT1_Gtf_Like功能域包括Gtfs等一類糖基轉(zhuǎn)移酶，參與生物合成的最后階段，Gtfs催化1個(gè)被活化的NDP-糖供體轉(zhuǎn)移一部分糖受體分子，形成糖苷；GTB型超家族蛋白家族擁有相同的GTP拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，GTB蛋白有不同的N-和C-末端結(jié)構(gòu)域，且都包含1個(gè)典型的Rossman折疊，2個(gè)結(jié)構(gòu)域序列同源性較低，但具有較高的結(jié)構(gòu)同源性，一個(gè)呈‘V’字的凹陷把它們分割成催化中心和一個(gè)靈活多變的區(qū)域。

3　結(jié)論與討論

類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶(UFGT)是花色素苷生物合成途徑中的最后一個(gè)酶，且必不可少，負(fù)責(zé)將糖基連接到不穩(wěn)定的花色素上，從而使花色素變成穩(wěn)定的花色素苷[17]，花色素苷具有潛在的抗氧化、抗癌與抗動(dòng)脈硬化功能[16]。試驗(yàn)通過同源克隆的方法得到了云南火把梨UFGT基因片段，經(jīng)生物信息學(xué)分析認(rèn)為該基因片段是UFGT的一部分，該UFGT片段與沙梨UFGT的同源性高達(dá)99%，BLAST分析表明，此蛋白是糖基轉(zhuǎn)移酶家族的一員。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，與火把梨親緣關(guān)系最近的是沙梨，其次是西洋梨和白梨，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)的是擬南芥。該片段含典型的GT1_Gtf_Like功能域和一個(gè)GTB型超家族蛋白的典型結(jié)構(gòu)。

目前，已經(jīng)從紅巴梨[15]、葡萄[6]、荔枝[18]、玉米(Zeamays)[19-20]、野草莓[21]、葡萄[22]、小麥(Triticumaestivum)[23]以及矮牽牛(Petuniahybrid)[24]等植物中克隆得到了UFGT基因。在葡萄[25]、蘋果[5]、荔枝[26]等果樹上對(duì)UFGT基因的功能研究已經(jīng)比較深入。研究顯示UFGT是決定蘋果花色素苷積累的重要酶類[27]，也是葡萄果肉色素合成的關(guān)鍵酶[28]；研究PAL、CHI、DFR和UFGT 4種酶在‘妃子笑’荔枝果實(shí)成熟過程中的活性變化，只有UFGT與花色素苷含量的變化趨勢(shì)吻合，其他3種均沒有明顯的相關(guān)性[29]。在觀賞海棠的研究中發(fā)現(xiàn)葉片中的McUFGT對(duì)其葉色的形成具有重要作用，主要通過催化無色的矢車菊色素生成紅色的矢車菊色素苷，使植物葉片出現(xiàn)紅色表型。對(duì)不同品種觀賞海棠花色素苷物質(zhì)含量變化的研究發(fā)現(xiàn)，色素沉積與基因UFGT表達(dá)有明顯一致性[7]。對(duì)柑橘(Citrusreticulata)的研究顯示，在紅色柑橘果汁囊泡中檢測(cè)到UFGT基因的表達(dá)，但在黃色柑橘中沒有檢測(cè)到[30]。上述研究顯示，UFGT既是花色素苷合成的重要酶類，又是關(guān)鍵酶，表達(dá)量與花色素苷積累量呈正相關(guān)關(guān)系，而花色素苷的積累量與植物葉片及果實(shí)的著色程度相關(guān)，因此，研究UFGT基因的調(diào)控模式對(duì)品種著色不良和果實(shí)品質(zhì)偏差有重要意義。

云南火把梨花色素苷合成途徑中UFGT基因調(diào)控方式及其功能尚不明確。本研究?jī)H從云南特有火把梨中克隆到了UFGT基因片段，應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行火把梨UFGT全長(zhǎng)序列的克隆，研究該基因在火把梨各個(gè)發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量、表達(dá)模式，開展火把梨花色素苷生物合成關(guān)鍵基因研究，以及后續(xù)應(yīng)用于紅皮梨的轉(zhuǎn)基因育種上。

致謝：在本試驗(yàn)進(jìn)行中得到唐軍榮老師、付海輝先生的幫助，謹(jǐn)此致謝！

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(責(zé)任編輯張坤)

Cloning and Analysis of UFGT Gene Sequence fromPyruspyrifoliacv. Huobali of Specific in Yunnan

Meng Fuxuan1,2,3,4,Zhou Jun1,3,4,Wang Dawei3,4,Tao bang5,Dong Jiao6,Fu Haihui7,Xu Shihong3,4,Duan Linyuan3,4

(1. Key Laboratory for Forest Genetic and Tree Improvement & Propagation in Universities of Yunnan Province, Kunming Yunnan 650224, China；2. Institute of Tropical Eco-agricultural Sciences, Yunnan Academy of Agricultural, Yuanmou Yunnan 651300, China;3. Key Laboratory for Forest Resource Conservation and Use in the Southwest Mountains of China, Kunming Yunnan 650224, China；4. College of Forestry, Southwest Forestry University, Kunming Yunnan 650224, China；5.Horticultural Research Institute Yunnan Acudemy of Agricultural Sciences,Kunming Yunnan,650000,China;6. Kunming Edible Fungi Institute, All China Federation of Supply and Marketing Cooperatives, Kunming Yunnan 650223, China)

In order to researchUFGTgene for regulation mechanism of anthocyan synthesis in red pear,Pyruspyrifolia cv. Huobali of specific in Yunnan was used as experimental material and the cDNA fragment ofUFGTgene was obtained by homologous cloning. Then, bioinformatics analysis ofUFGTgene and its deduced protein was done by using the related biological software. The results showed that length of UFGT is 1 440 bp, and it encodes 479 amino acids. The homology at amino acids level ofUFGTwith UFGT inPyruspyrifolia(AFQ92055)、Pyruscommunis(AGL81353)、Pyrusbretschneideri(AGZ15304)、Malusdomestica(XP_008357063) andPrunuscerasifera(AKV89253) are 99%, 96%, 94%,91% and 72%, respectively. The results of amino acid sequence analysis indicated that theUFGThad no signal peptide and trans-membrane domain, belonged to the non secreted protein and located in cytosol. The protein predication ofUFGTshowed that there were a function domains GT1_Gtf_Like and typical structure of GTB super family.

Pyruspyrifoliacv. Huobali;UFGT;gene cloning;bioinformatics

2015-05-12

云南省教育廳科學(xué)研究基金項(xiàng)目 (2012J050)資助；西南林業(yè)大學(xué)科研啟動(dòng)基金資助。

周軍(1962—)，男，博士，教授。研究方向：果樹分子生物學(xué)與林木遺傳育種的研究。Email：zhoujunbo@163.com。

10.11929/j.issn.2095-1914.2016.01.004

S718.46

A

2095-1914(2016)01-0021-07

第1作者：孟富宣(1989—)，女，碩士，實(shí)習(xí)研究員。研究方向：林木遺傳育種。Email：616967560@qq.com。