三七總皂苷對(duì)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa和HEC-1A細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的影響

譚宏偉　楚光華　胡春艷　張恩娣西北婦女兒童醫(yī)院婦科，陜西西安　710061

三七總皂苷對(duì)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa和HEC-1A細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的影響

譚宏偉楚光華胡春艷張恩娣
西北婦女兒童醫(yī)院婦科，陜西西安710061

目的 探討三七總皂苷（PNS）對(duì)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa和HEC-1A細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的影響及其作用機(jī)制。方法 應(yīng)用不同濃度的PNS分別作用于Ishikawa和HEC-1A細(xì)胞24、48、72 h，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖率；Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平；采用RT-PCR和Western blot分別檢測(cè)VEGF、PI3K、AKT的mRNA和蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果PNS可以顯著抑制Ishikawa和HEC-1A細(xì)胞的增殖。與control組比較，PNS處理的Ishikawa和HEC-1A細(xì)胞侵襲顯著下降（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.05），VEGF和PI3K的表達(dá)水平下降（P＜0.05）。結(jié)論P(yáng)NS能夠抑制Ishikawa和HEC-1A細(xì)胞的增殖和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其過程可能與VEGF/PI3K/AKT信號(hào)通路的抑制有關(guān)。

三七總皂苷；子宮內(nèi)膜癌；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；PI3K/AKT信號(hào)通路

［Abstract］Objective To investigate the effects of Panaxnotoginsengsaponins（PNS）on the cell proliferation，invasion and apoptosis in endometrial cancercell line Ishikawa and HEC-1A and its underlying mechanism.Methods Ishikawa and HEC-1A cells were treated with different density of PNS for 24，48，72 h.The MTT method was used to detect the cell proliferation rate after Ishikawa and HEC-1A；cell invasion ability was detected by Transwell method；cell apoptosis was measured by flow cytometry；the mRNA and protein expression level of VEGF，PI3K and AKT were detected by RT-PCR and Western blot，respectively.Results PNS could significantly inhibited the cell proliferation of Ishikawa and HEC-1A cells.Compared with control group，the cell invasion ability of Ishikawa and HEC-1A apparently decreased（P＜0.05），and the cell apoptosis were elevated with PNS treatment（P＜0.05），the expression of VEGF and PI3K decreased with PNS treatment（P＜0.05）.Conclusion PNS inhibits the proliferation，invasion and induces apoptosis in Ishikawaand HEC-1A cells，which may be related to the inhibition of VEGF/PI3K/AKT signaling pathway.

［Key words］Panaxnotoginsengsaponins；Endometrial cancer；Vascular endothelial growth factor；PI3K/AKT

子宮內(nèi)膜癌是三大婦科惡性腫瘤之一［1-2］。目前子宮內(nèi)膜癌的治療方法較多，以手術(shù)和放療為主，輔助化學(xué)治療或激素治療，然而化學(xué)及激素治療存在明顯的復(fù)發(fā)癥和毒副作用［3-4］。因此，尋找高效、安全、使用范圍廣的子宮內(nèi)膜癌治療新藥是現(xiàn)今的研究熱點(diǎn)。三七總皂苷（panaxnotoginsengsaponins，PNS）三七的主要有效成分，具有擴(kuò)張血管、降低血脂和抗炎等藥理作用［5-6］。已有研究表明，PNS對(duì)多種癌細(xì)胞的增值、凋亡和代謝等有影響［7-10］。但PNS在子宮內(nèi)膜癌中的作用還未見報(bào)道。本研究擬以子宮內(nèi)膜癌Ishikawa和HEC-1A細(xì)胞系為細(xì)胞模型，探討PNS對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的影響，并探討其分子機(jī)制，為PNS治療子宮內(nèi)膜癌的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)

Ishikawa和HEC-1A細(xì)胞（American Type Culture Collection，ATCC）用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素以及100 μg/mL鏈霉素的 DMEM培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖率

細(xì)胞以6×104個(gè)/孔接種置96孔板，應(yīng)用不同濃度的PNS（50、100、150、200 μg/mL）（西安飛達(dá)生物公司）分別作用于Ishikawa和HEC-1A細(xì)胞24、48、72 h。棄去原培養(yǎng)液，每孔加入MTT（5 g/L）20 μL，37℃培養(yǎng)4 h。棄上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜，振蕩10 min使結(jié)晶充分溶解，于酶標(biāo)儀上檢測(cè)各組細(xì)胞吸光度值（A490），細(xì)胞增殖率=處理組A490/對(duì)照組A490×100%。

1.3Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲

以正常培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞為對(duì)照，以200μg/mL 的PNS處理的細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組。在Transwell上室聚碳酸酯膜上涂70 μL 1 mg/mL的matrigel膠，在37℃下靜置60 min使其在微孔濾膜上重組為基底膜。胰酶消化待測(cè)細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液后在離心半徑為10 cm的離心機(jī)中1000 r/min離心5 min。重懸細(xì)胞后接種于Transwell上室內(nèi)，并于下室中加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液500 μL，孵育24 h。隨后將濾膜上層的細(xì)胞用棉簽?zāi)ㄈィ眉状脊潭V膜，Giemsa染色15 min。于200倍光鏡下計(jì)算遷移到下層的細(xì)胞數(shù)量。

1.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將待測(cè)細(xì)胞以2×105/孔的密度接種置6孔板，消化細(xì)胞，離心后棄去上清液收集細(xì)胞。PBS洗滌后離心棄上清液收集細(xì)胞，每孔加入100 μL結(jié)合緩沖液緩慢吹打，在懸浮細(xì)胞中分別加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI進(jìn)行染色，搖勻后置于閉光孵育15 min。每管再加入400 μL結(jié)合緩沖液，于1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5RT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)

Trizol法提取待測(cè)細(xì)胞的總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的純度及濃度，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后PCR擴(kuò)增。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，自動(dòng)凝膠成像分析儀分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以目的基因灰度值/內(nèi)參灰度值表示。

1.6Western blot檢測(cè)蛋白的表達(dá)

細(xì)胞用0.05%胰蛋白酶消化后，PBS洗滌3次。加入65 μL RIPA細(xì)胞蛋白裂解液裂解細(xì)胞，隨后進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳分離蛋白。電轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉在室溫下封閉1 h，加入相應(yīng)蛋白鼠抗一抗（Pierce，Rockford，USA），4℃輕搖過夜。隨后加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗，室溫孵育1 h。最后用X線膠片曝光分析，結(jié)果用Image-Pro Plus處理。蛋白的相對(duì)表達(dá)量以目的蛋白與內(nèi)參β-actin的灰度值比值表示。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1PNS抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa和HEC-1A的生長(zhǎng)

PNS能顯著抑制Ishikawa和HEC-1A細(xì)胞的增殖，同一濃度下，隨著PNS作用時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞的增殖抑制率亦明顯升高（P＜0.05）；并且隨著PNS濃度增加，增殖抑制率明顯升高（P＜0.05）。后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用200μg/mL PNS處理進(jìn)行。見圖1。

圖1　三七總皂苷對(duì)Ishikawa和HEC-1A細(xì)胞增殖的影響

2.2PNS抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa和HEC-1A的侵襲

經(jīng) 200 μg/mL PNS處理 48 h后，Ishikawa和HEC-1A細(xì)胞的侵襲顯著降低（P＜0.05）。見圖2。

圖2　三七總皂苷對(duì)Ishikawa和HEC-1A細(xì)胞侵襲能力的影響

2.3PNS誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa和HEC-1A的凋亡

PNS處理48 h后，Ishikawa細(xì)胞的凋亡率升高至21.0%，HEC-1A的凋亡率升高至20.2%，與control比較，細(xì)胞凋亡率均顯著升高（P＜0.05）。見圖3。

2.4PNS抑制VEGF的mRNA和蛋白表達(dá)

分別檢測(cè)Ishikawa和HEC-1A細(xì)胞中VEGF的mRNA和蛋白。與control比較，PNS組的VEGF mRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4。

圖3　三七總皂苷對(duì)Ishikawa和HEC-1A細(xì)胞凋亡的影響

圖4　三七總皂苷對(duì)Ishikawa和HEC-1A細(xì)胞中VEGF mRNA和蛋白表達(dá)的影響

2.5PNS抑制PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白表達(dá)

與control比較，p-AKT的mRNA、蛋白表達(dá)水平在PNS組中顯著降低 （P＜0.05），AKT的mRNA、蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。如圖5所示，

圖5　三七總皂苷對(duì)Ishikawa和HEC-1A細(xì)胞中PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響

3　討論

現(xiàn)今全球每年新發(fā)子宮內(nèi)膜癌約14萬(wàn)例，死亡人數(shù)約4萬(wàn)人/年［11］。中藥因其較高的安全性在癌癥的治療中起重要作用［12］。PNS影響女性生殖惡性腫瘤細(xì)胞的增殖及凋亡［7，13-14］。但目前關(guān)于PNS對(duì)子宮內(nèi)膜癌的作用還未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，PNS能顯著抑制體外培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜癌Ishikawa和HEC-1A細(xì)胞的增殖和侵襲，促進(jìn)其凋亡，提示PNS對(duì)子宮內(nèi)膜癌可能具有一定治療作用。

目前中藥抗子宮內(nèi)膜癌的研究主要從抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤侵襲等方面展開。Wang等［7］研究證明PNS對(duì)乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力有抑制作用。Wang等［15］研究表明，PNS可以通過降低結(jié)直腸細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果表明，PNS能顯著抑制Ishikawa和HEC-1A細(xì)胞的增殖，并且其抑制作用具有濃度、時(shí)間的依賴性，隨著PNS濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞的增殖抑制也明顯增高。并且PNS可以有效抑制Ishikawa和HEC-1A細(xì)胞的侵襲能力，對(duì)細(xì)胞的凋亡也有一定促進(jìn)作用。以上結(jié)果表明，PNS能夠抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用。

近年來(lái)大量研究表明，VEGF是作用最強(qiáng)、特異性最高的調(diào)控因子，在腫瘤血管生成的各個(gè)環(huán)節(jié)中起到重要作用［16-17］。抑制VEGF可以達(dá)到抑制腫瘤血管新生并阻止腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的目的［18］。已有研究表明PNS可以通過降低VEGF的表達(dá)降低動(dòng)脈粥樣硬化的血管新生［16］。本研究結(jié)果表明在PNS處理Ishikawa 和HEC-1A細(xì)胞中，VEGF的表達(dá)顯著下降，提示PNS可能通過抑制VEGF影響子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡。

PI3K/AKT信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)到通路之一，其異常激活與婦科腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)［19］。研究表明VEGF可以通過激活PI3K/ AKT信號(hào)通路促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增生及轉(zhuǎn)移［20］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)PNS處理抑制PI3K/AKT信號(hào)通路在的Ishikawa和HEC-1A中的表達(dá)，與VEGF的表達(dá)趨勢(shì)一致，說明PNS可能通過抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞VEGF的表達(dá)，遏制PI3K/AKT信號(hào)通路激活。

綜上所述，本研究表明PNS能夠抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa和HEC-1A的增殖和侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，其過程可能與VEGF/PI3K/AKT信號(hào)通路的抑制有關(guān)。在以后的研究中應(yīng)進(jìn)一步對(duì)PNS在子宮內(nèi)膜癌中的作用機(jī)制進(jìn)行深入研究，為提高患者的治愈率和生存率，開發(fā)臨床有效新型治療藥物提供思路。

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Effects of Panaxnotoginsengsaponins on proliferation，invasion，apoptosis of endometrial cancercell lines Ishikawa and HEC-1A

TAN HongweiCHU GuanghuaHU ChunyanZHANG Endi
Department of Gynaecology，Northwest Women and Children Hospital，Shaanxi Province，Xi'an710061，China

R737.33

A

1673-7210（2016）05（b）-0013-04

譚宏偉（1971-），男，碩士，副主任醫(yī)師；研究方向：婦科腫瘤以及婦科腹腔鏡微創(chuàng)技術(shù)。

張恩娣（1953-），女，主任醫(yī)師；研究方向：婦科腫瘤。

2016-02-15本文編輯：蘇暢）