灰樹花多糖D組分對細顆粒物誘導的人支氣管上皮細胞損傷的保護作用

茹　琴　熊　琪　田　香　陳　琳　徐叢玥　李超英，2▲.湖北省江漢大學武漢生物醫(yī)學研究院，湖北武漢　430056；2.湖北省漢濟生物科技（武漢）有限公司，湖北武漢　430075

灰樹花多糖D組分對細顆粒物誘導的人支氣管上皮細胞損傷的保護作用

茹琴1熊琪1田香1陳琳1徐叢玥1李超英1，2▲
1.湖北省江漢大學武漢生物醫(yī)學研究院，湖北武漢430056；2.湖北省漢濟生物科技（武漢）有限公司，湖北武漢430075

目的 研究灰樹花多糖D組分（D-fraction）對細顆粒物（SRM 2786）誘導的人支氣管上皮細胞（16HBE）損傷的保護作用。方法 利用細胞增殖實驗檢測SRM 2786或D-fraction對16HBE細胞增殖的影響，確定給藥濃度；將16HBE細胞分7組，分別為對照組、模型組（125 μg/mL SRM 2786）和不同濃度D-fraction給藥組（分別給予12.5、25、50、100、200 μg/mL D-fraction，同時給予125 μg/mL SRM 2786），細胞增殖實驗檢測細胞存活率，酶聯(lián)免疫法檢測細胞培養(yǎng)液白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和粒細胞巨噬細胞刺激因子（GM-CSF）的含量。結(jié)果31.25～500 μg/mL SRM 2786處理使細胞存活率顯著降低（P＜0.05）。125 μg/mL的SRM 2786刺激使16HBE細胞IL-1β、IL-6、TNF-α和GM-CSF釋放顯著升高（P＜0.05），D-fraction（≥100 μg/mL）顯著抑制SRM 2786誘導的炎癥細胞因子釋放（P＜0.01），且能顯著提高損傷細胞存活率。結(jié)論 細顆粒物能抑制16HBE細胞增殖、誘導炎癥因子釋放，D-fraction對細顆粒物造成的細胞損傷有顯著保護作用，其作用機制可能與抑制炎癥因子釋放有關(guān)。

細顆粒物；炎性損傷；灰樹花多糖D組分；人肺支氣管上皮細胞

［Abstract］Objective To investigate the protective effect of Grifola frondosa D fraction（D-fraction）on human bronchial epithelial（16HBE）cell damage that induced by fine particulate matter（SRM2786）.Methods MTT assay was used to detect the survival rate of 16HBE cells treated with SRM2786 or D-fraction，and the concentration of SRM2786 or D-fraction used for further experiments was selected.16HBE cells were divided into seven groups，including control group，model group（125 μg/mL SRM 2786），D-fraction group（125 μg/mL SRM 2786+12.5 or 25 or 50 or 100 or 200 μg/mL D-fraction）.MTT assay was used to detect the survival rate，and enzyme-linked immune kits were used to detect the release of interleukin-1β（IL-1β），interleukin-6（IL-6），tumor necrosis factor-α（TNF-α）and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor（GM-CSF）.Results Compared with the control group，the cell survival rates of 16HBE cells treated with SRM 2786（31.25-500 μg/mL）were decreased remarkably（P＜0.05）.Treatment with 125 μg/mL SRM 2786 could significantly increase the release of IL-1β，IL-6，TNF-α and GM-CSF（P＜0.05）.D-fraction（≥100 μg/mL）could not only significantly improve the survival rate，but also significantly inhibit the release of inflammatory cytokines（P＜0.01）.Conclusion Fine particulate matter can inhibit cell proliferation and induce the release of inflammatory cytokines.D-fraction has a significant protective effect of cell damage caused by fine particulate matter，and the mechanism may be related to inhibit the release of inflammatory factors.

［Key words］Fine particulate matter；Inflammation damage；Grifola frondosa D-fraction；Human lung bronchial epithelial cells

細顆粒物（fine particlate matter，空氣動力學直徑≤2.5 μm的顆粒）是霧霾中的首要污染物［1］，不易被鼻腔絨毛阻擋，能抵達細支氣管壁，引發(fā)哮喘、支氣管炎和心血管病等疾?。?］。細顆粒物濃度每增加10 μg/m3，總死亡風險會上升4%，心肺疾病死亡風險上升6%，肺癌死亡風險上升8%［3］。

細顆粒物通過刺激肺泡巨噬細胞和支氣管上皮細胞，誘發(fā)炎癥導致呼吸道局部免疫力下降和肺上皮細胞纖維化［4］。Veronesi等［5］發(fā)現(xiàn)細顆粒物使人支氣管上皮細胞中Ca2+升高，白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白介素-8（IL-8）等釋放增多，推測細顆粒物中的酸性可溶成分通過辣椒素和pH敏感受體途徑刺激細胞因子釋放。此外，細顆粒物通過刺激血小板生長因子與轉(zhuǎn)化生長因子的產(chǎn)生，引起氣道壁纖維組織增厚，導致增生性炎癥發(fā)生［6］。

灰樹花（grifola frondosa）是一種藥食兼用珍稀真菌。自20世紀80年代始，國內(nèi)外學者從灰樹花子實體和菌絲體中提取了幾十種活性多糖，包括D-組分、MD-組分、X-組分等［7］。其中D-組分（D-fraction）是1984年日本學者Nanba提取的酸不溶性組分，含有以β-（1-6）結(jié)合為主鏈、β-（1-3）結(jié)合為側(cè)鏈的葡聚糖和以β-（1-3）結(jié)合為主鏈、β-（1-6）結(jié)合為側(cè)鏈的葡聚糖。D-fraction不僅能增強正常小鼠免疫功能［8］，還能通過提高免疫功能抑制腫瘤生長［9］。然而，D-fraction是否對細顆粒物引起的支氣管上皮細胞損傷具有保護作用，目前尚無文獻報道。本實驗研究D-fraction對細顆粒物誘導的人支氣管上皮細胞（16HBE）損傷的保護作用，為細顆粒物的毒性機制研究以及新功能食品的開發(fā)等提供科學依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶和青鏈霉素購自Gibco公司；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）購自Sigma公司；IL-1β、IL-6、TNF-α和粒細胞-巨噬細胞刺激因子（GM-CSF）酶聯(lián)免疫（ELISA）檢測試劑盒購自美國Biosource公司；D-fraction購自美國MushRoom Wisdom公司；其余試劑均為分析純。

1.2細胞系

16HBE細胞購自中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院細胞庫，用完全培養(yǎng)基（含10%FBS和100 U青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基）于37℃、5%CO2培養(yǎng)。

1.3細顆粒物懸液制備

細顆粒物成分復雜，且隨著季節(jié)不斷變化，對肺細胞損傷的程度和機制也不同［10］，本實驗選用的細顆粒物為美國國家標準與技術(shù)研究所提供的標準品SRM 2786，其成分分析報告可在官網(wǎng)查詢［11］。實驗所用細顆粒物懸液均為現(xiàn)用現(xiàn)配，將SRM 2786用完全培養(yǎng)基配成2000 μg/mL的儲存液，超聲振蕩混勻后用完全培養(yǎng)基稀釋成所需濃度。

1.4細胞分組

實驗一中16HBE細胞分6組，分別加入不同濃度的SRM 2786（0、31.25、62.5、125、250、500 μg/mL），細胞增殖實驗檢測細胞存活率，確定后續(xù)實驗中SRM 2786濃度。實驗二中16HBE細胞分10組，分別加入不同濃度的D-fraction（0、1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200、400 μg/mL），確定后續(xù)實驗中D-fraction濃度。實驗三中16HBE細胞分7組，分別為對照組、模型組（125 μg/mL SRM 2786）和不同濃度D-fraction給藥組（分別給予12.5、25、50、100、200 μg/mL D-fraction，同時給予125 μg/mL SRM 2786），細胞增殖實驗測定細胞存活率，ELISA檢測細胞培養(yǎng)液中IL-1β、IL-6、TNF-α和GM-CSF的含量。

1.5細胞增殖實驗

16HBE細胞消化后接種于96孔板中，細胞密度為1×104個/孔，37℃培養(yǎng)24 h，分別加入不同濃度處理物質(zhì)，每個濃度設6個平行孔，同時設立無藥對照孔和無細胞空白孔，37℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h。棄上清，每孔加入90 μL完全培養(yǎng)基和10 μL MTT溶液 （5 g/L），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜，酶標儀570 nm波長檢測吸光度值（A），按下面公式計算細胞存活率T/C（%）：T/C（%）=（A樣品組－A空白組）/ （A對照組－A空白組）×100%

1.6細胞因子含量測定

ELISA試劑盒檢測各組細胞培養(yǎng)液中IL-6、IL-1β、TNF-α和GM-CSF含量。16HBE細胞消化后接種于24孔板中，細胞密度為1×105個/孔，37℃培養(yǎng)24 h。分別加入不同濃度處理物質(zhì)，每個濃度設3個平行孔，同時設立無藥對照孔，37℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集上清，按照試劑盒說明書操作步驟檢測各組細胞培養(yǎng)液中細胞因子含量。

1.7統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 16.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，實驗所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，各組之間進行單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1SRM 2786對16HBE細胞增殖的影響

與對照組比較，31.25 μg/mL SRM 2786處理組細胞存活率顯著降低（P＜0.05），62.5～500 μg/mL SRM 2786處理組細胞存活率極顯著降低（P＜0.01），表明細顆粒物能顯著抑制16HBE細胞增殖。見表1。

表1　SRM 2786對16HBE細胞增殖的影響（±s）

表1　SRM 2786對16HBE細胞增殖的影響（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；SRM2786：細顆粒物；16HBE：人支氣管上皮細胞

細胞存活率（%）對照組SRM2786處理組組別　SRM 2786濃度（μg/mL）吸光度值（A）0 31.25 62.5 125 250 500 0.38±0.01 0.29±0.01 0.24±0.01 0.24±0.01 0.22±0.02 0.20±0.01 100±1.28 76.30±1.57*62.02±1.68**61.41±0.79**57.06±2.06**52.70±1.66**

2.2D-fraction對16HBE細胞增殖的影響

D-fraction濃度在1.56～50 μg/mL范圍內(nèi)，對16HBE細胞增殖無明顯影響（P＞0.05），在100～400 μg/mL范圍內(nèi)，細胞存活率與對照組比較顯著增加 （P＜0.01），表明高濃度D-fraction（≥100 μg/mL）能顯著促進16HBE細胞增殖。見表2。

表2　D-fraction對16HBE細胞增殖的影響（±s）

表2　D-fraction對16HBE細胞增殖的影響（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.01；D-fraction：D組分；16HBE：人支氣管上皮細胞

組別　D-fraction濃度（μg/mL）　吸光度值（A）　細胞存活率（%）對照組給藥組0 1.56 3.125 6.25 12.5 50 100 200 400 1.67±0.15 1.55±0.16 1.59±0.35 1.71±0.35 1.85±0.34 1.81±0.12 1.88±0.23 2.32±0.29 2.50±0.27 100±4.76 95.71±10.78 102.62±10.47 110.98±10.33 108.65±3.70 112.89±6.89 139.58±8.85*150.13±8.05*184.26±12.40*

2.3D-fraction對SRM2786損傷的16HBE細胞增殖的影響

D-fraction對SRM2786造成的細胞損傷有一定保護作用，D-fraction濃度在25～200 μg/mL范圍內(nèi)，隨著D-fraction濃度的升高，細胞存活率逐漸升高。見表3。

表3　D-fraction對SRM2786損傷的16HBE細胞增殖的影響（±s）

表3　D-fraction對SRM2786損傷的16HBE細胞增殖的影響（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.01；D-fraction：D組分；SRM2786：細顆粒物；16HBE：人支氣管上皮細胞

組別　SRM2786濃度（μg/mL）D-fraction濃度（μg/mL）吸光度值（A）細胞存活率（%）對照組模型組給藥組0 125 125 125 125 125 125 00 12.5 25 50 100 200 1.77±0.02 0.93±0.02 0.97±0.01 1.33±0.07 1.50±0.04 1.59±0.05 1.60±0.12 100.00±1.15 53.10±1.06 54.67±0.29 75.09±3.92*84.60±2.04*90.05±2.61*90.22±7.05*

2.4D-fraction對SRM2786損傷的16HBE細胞細胞因子釋放的影響

與對照組比較，125 μg/mL的SRM2786作用24 h后，16HBE細胞培養(yǎng)液中4種炎癥因子含量均顯著升高（P＜0.01）。D-fraction對SRM2786造成的炎癥細胞釋放有明顯抑制作用，高濃度（100、200 μg/mL）D-fraction共處理組4種炎癥因子均顯著降低 （P＜0.01）。見表4。

表4　D-fraction對SRM2786損傷16HBE細胞細胞因子釋放的影響（±s）

表4　D-fraction對SRM2786損傷16HBE細胞細胞因子釋放的影響（±s）

注：與對照組比較，#P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；D-fraction：D組分；SRM2786：細顆粒物；16HBE：人支氣管上皮細胞；IL-1β：白介素-1β；IL-6：白介素-6；TNF-α：腫瘤壞死因子

組別　SRM2786濃度（μg/mL）D-fraction濃度（μg/mL）IL-1β濃度（ng/mL）IL-6濃度（ng/mL）TNF-α濃度（ng/mL）GM-CSF濃度（ng/mL）對照組模型組給藥組0 125 125 125 125 125 125 00 12.5 25 50 100 200 43.92±2.94 58.33±0.89#57.15±1.51 55.98±0.33*54.01±0.16**55.29±0.58**54.80±0.94**15.21±0.36 21.91±0.31#21.87±0.50 20.95±0.14 21.16±0.16 17.95±0.14**17.12±0.21**43.61±0.83 66.48±0.64#55.64±1.39**48.51±0.16**45.18±0.69**43.14±0.16**41.38±0.48**458.33±16.07 657.5±11.45#536.67±11.27**495.83±2.89**462.50±2.50**464.17±11.27**467.16±10.10**

3　討論

流行病學調(diào)查顯示細顆粒物的濃度與心肺系統(tǒng)疾病的發(fā)病率和死亡率存在密切關(guān)聯(lián)［3］。體外實驗顯示細顆粒物能導致肺巨噬細胞凋亡［12］，顯著抑制人肺成纖維細胞增殖，并誘導細胞DNA損傷［13］。本實驗結(jié)果顯示細顆粒物SRM 2786能顯著抑制16HBE細胞增殖，細胞存活率隨著細顆粒物濃度增加而降低，與前期研究結(jié)果一致［12-13］。

近年研究表明，D-fraction具有抗腫瘤及改善免疫功能的作用［15］，本實驗結(jié)果顯示高濃度D-fraction（≥100 μg/mL）對16HBE細胞增殖具有促進作用，還能顯著提高細顆粒物損傷細胞的存活率，表明D-frac tion對細顆粒物造成的細胞損傷有顯著保護作用。

顆粒物過度沉積對呼吸道產(chǎn)生刺激，使IL-1、IL-6釋放增加，進而引起炎性細胞浸潤，同時，顆粒物可導致氣道上皮細胞及血管內(nèi)皮細胞表達相關(guān)黏附分子，促進炎性細胞聚集，進一步加強呼吸系統(tǒng)炎性反應［15-16］。邵國軍等［17］研究顯示大鼠長期暴露于顆粒物環(huán)境后呼吸系統(tǒng)粘膜出現(xiàn)水腫、增生并有大量炎癥細胞滲入，肺巨噬細胞能會通過分泌IL-6、TNF-α等吸引更多炎癥細胞向顆粒物引起的炎癥部位聚集。本研究結(jié)果顯示，125 μg/mL細顆粒物刺激可使16HBE細胞IL-1β、IL-6、TNF-α和 GM-CSF合成釋放增加，表明細顆粒物對機體具有潛在炎性損傷毒性。D-fraction與細顆粒物共處理對細顆粒物造成的炎癥細胞因子釋放有明顯抑制作用，其中高濃度（100、200 μg/mL）D-fraction組 4種炎癥細胞因子均顯著降低（P＜0.01），進一步表明 D-fraction是通過降低細顆粒物對16HBE細胞造成的炎性損傷而起到保護作用的。

綜上所述，細顆粒物刺激可使人支氣管上皮細胞細胞存活率降低，IL-1β、IL-6、TNF-α和GM-CSF4種炎癥細胞因子釋放增加，D-fraction與對細顆粒物造成的炎癥細胞因子釋放具有明顯的抑制作用，能顯著提高損傷細胞的存活率，表明D-fraction對細顆粒物造成的細胞損傷具有顯著的保護作用，其作用機制可能與抑制炎癥因子表達釋放有關(guān)，為灰樹花多糖在細顆粒物損傷防治研究提供實驗基礎(chǔ)。

［1］Cao C，Jiang W，Wang B，et al.Inhalable Microorganisms in Beijing's PM2.5 and PM10 Pollutants during a Severe Smog Event［J］.Environ Sci Technol，2014，48（3）：1499-1507.

［2］Weichenthal SA，Godri-Pollitt K，Villeneuve PJ.PM2.5，oxidant defence and cardiorespiratory health：a review［J］. Environ Health，2013，12（5）：40.

［3］Pope CA，Burnett RT，Thun MJ，et al.Lung cancer，cardiopulmonary mortality，and long-term exposure to fine particulate air pollution［J］.JAMA，2002，287（9）：1132-1141.

［4］李仰瑞，趙云峰.PM2.5對呼吸系統(tǒng)的影響［J］.中華肺部疾病雜志：電子版，2013，6（4）：372-374.

［5］Veronesi B，Oortgiesen M，Carter JD，et al.Particulate matter initiates inflammatory cytokine release by activation of capsaicin and acid receptors in a human bronchial epithelial cell line［J］.Toxicol Appl Pharmacol，1999，154（1）：106-115.

［6］ChurgA，BrauerM，delCarmenAvila-CasadoM，etal.Chronic exposure to high levels of particulate air pollution and small airway remodeling［J］.Environ Health Perspect，2003，111（5）：714-718.

［7］MayellM.Maitakeextractsandtheirtherapeuticpotential［J］. Altern Med Rev，2001，6（1）：48-60.

［8］Kodama N，Murata Y，Nanba H.Administration of a polysaccharide from Grifola frondosa stimulates immune function of normal mice［J］.J Med Food，2004，7（2）：141-145.

［9］Kodama N，Murata Y，Asakawa A，et al.Maitake D-Fraction enhances antitumor effects and reduces immunosuppression by mitomycin-C in tumor-bearing mice［J］.Nutrition，2005，21（5）：624-629.

［10］Becker S，Dailey LA，Soukup JM，et al.Seasonal variations in air pollution particle-induced inflammatory mediator release and oxidative stress［J］.Environ Health Perspect，2005，113（8）：1032-1038.

［11］Technology NIoSa.Certificate of analysis，Standard Reference Material，fine particulate matter［Online］. National Institute of Standards and Technology 2013. https：//www-s.nist.gov/srmors/view_cert.cfm？srm=2786.Accessed August 13 2013.

［12］Xiong Q，Ru Q，Chen L，et al.Combined effects of fine particulate matter and lipopolysaccharide on apoptotic responses in NR8383 macrophages［J］.Journal of toxicology and environmental health Part A，2015，78（7）：443-452.

［13］姜薇，趙曉紅，米生權(quán)，等.番茄紅素對大氣可吸入顆粒物致人肺成纖維細胞DNA損傷的保護作用［J］.環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學，2008，25（6）：568-571.

［14］李?；?灰樹花多糖的免疫作用實驗研究［J］.中華中醫(yī)藥學刊，2007，25（2）：365-366.

［15］Cai L，Chen H，Miao Q，et al.Binding capability of the enediyne-associated apoprotein to human tumors and constitution of a ligand oligopeptide-integrated protein［J］.J Biotechnol，2009，144（2）：142-150.

［16］蔡冬春.小兒纖維支氣管鏡檢查后并發(fā)癥分析［J］.中國醫(yī)藥導報，2013，10（35）：65-67.

［17］邵國軍.大氣顆粒物PM2.5對大鼠呼吸系統(tǒng)免疫損傷機制研究［D］.蘭州：蘭州大學，2006.

Protective effects of Grifola frondosa D fraction on human bronchial epithelial cells damage induced by fine particulate matter

RU Qin1XIONG Qi1TIAN Xiang1CHEN Lin1XU Congyue1LI Chaoying1，2▲
1.Wuhan Institutes of Biomedical Sciences，Jianghan University，Hubei Province，Wuhan430056，China；2.Hanjea Biological Technology（Wuhan）Co.，Ltd.，Hubei Province，Wuhan430075，China

R962

A

1673-7210（2016）05（b）-0021-04

2016-01-25本文編輯：趙魯楓）