頸總動脈穿刺法制備大鼠大腦中動脈栓塞模型

劉華，劉月美，關(guān)芮，徐昭，朱文增

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京　100032；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，北京　100029；3.北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京　100875；4.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院東區(qū)，北京　101121)

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頸總動脈穿刺法制備大鼠大腦中動脈栓塞模型

劉華1，2，劉月美3，關(guān)芮1，2，徐昭4，朱文增1

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京100032；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，北京100029；3.北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京100875；4.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院東區(qū)，北京101121)

目的對頸總動脈穿刺法及傳統(tǒng)線栓法制備大鼠大腦中動脈栓塞(middlecerebralarteryocclusion,MCAO)模型的時效性、成功率、死亡率比較。方法將32只雄性大鼠隨機分為頸總動脈穿刺法組與傳統(tǒng)線栓法組，將線栓從頸總動脈插入，栓塞大腦中動脈。采用Bederson神經(jīng)功能評分標準，于術(shù)后24h進行神經(jīng)功能評分，并統(tǒng)計24h成功率及死亡率。結(jié)果頸總動脈穿刺法和傳統(tǒng)手術(shù)方法制備大鼠MCAO模型的插線栓時間、成功率、死亡率分別為(82.3±17.4)s和(164.6 ±22.0)s，差異有顯著性(P<0.01)； 87.5%和68.75%，差異無顯著性(P>0.05)； 6.25%和18.75%，差異無顯著性(P >0.05)。結(jié)論頸總動脈穿刺法制備大鼠大腦中動脈栓塞模型簡單省時，創(chuàng)傷小，可操作性強。

腦缺血；大腦中動脈栓塞；線栓法；大鼠

大鼠顱內(nèi)血管結(jié)構(gòu)與人類接近，實驗條件容易標準化，價格較低，飼養(yǎng)方便，是目前腦缺血研究常用的動物。因雌激素能降低大鼠腦梗塞的發(fā)生率和死亡率[1]，對大鼠腦缺血損傷后神經(jīng)細胞有保護作用[2]，擴張血管、增加腦血流量[3]，減輕腦損傷[4]，具有明顯的腦保護作用[5]，故選擇雄性大鼠作為實驗對象。制備MCAO模型方法有線栓法[6]、開顱電凝法[7]、血栓栓塞法[8]、光化學(xué)誘導(dǎo)法[9]、顱腦開窗法[10]等多種，線栓法制備MCAO模型具有不開顱、手術(shù)時間短、損傷小、穩(wěn)定性和可行性高等特點，且可控制缺血與再灌注的時間，是國內(nèi)外常用的方法[11]。1986年Koizumi[6]首先報道了利用線栓法制備MCAO/R模型，隨后ZeaLonga[12]于1989年在此方法上進行改進，成為了現(xiàn)今較為廣泛應(yīng)用的方法。本實驗通過對2種不同手術(shù)方法的比較分析，成功的使用了穿刺法制作了大鼠MCAO模型。現(xiàn)將制作該模型的方法及經(jīng)驗介紹如下。

1　材料與方法

1.1實驗動物

SPF級雄性成年SD大鼠32只，周齡7～8周，體重250～280g，來源于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2012-0001]。飼養(yǎng)及手術(shù)于首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物部SPF級屏障環(huán)境[SYXK(京)2010-0020]。按照隨機數(shù)字表法分為頸總動脈穿刺法組A(16只)與傳統(tǒng)線栓法組B(16只)。

1.2主要實驗器材

2636-4A號線栓(北京沙東生物技術(shù)有限公司提供)，6號注射器針頭，自制鼠板，自制拉鉤。

1.3實驗試劑

水合氯醛(國藥集團化學(xué)試劑有限公司提供)、碘伏、75%乙醇。

1.4手術(shù)方法

術(shù)前大鼠禁食不禁水24h[13]，手術(shù)當(dāng)日用生理鹽水現(xiàn)配10%水合氯醛，大鼠稱重后按0.35mg/100g腹腔注射麻醉，待其完全麻醉后仰臥位將四肢及頭部固定于鼠板，充分暴露下頜角至胸骨之間的頸部區(qū)域，備皮，分別應(yīng)用不同的手術(shù)方法制備MCAO模型。A組手術(shù)方法：用碘伏將頸部正中線及周圍消毒后用75%乙醇脫碘兩次，用11號手術(shù)刀沿頸部正中線切開長約1.5cm的切口。用彎頭眼科鑷鈍性分離皮下組織、腺體，鈍性分離頸部肌肉，用自制拉鉤將右側(cè)胸骨舌骨肌、胸鎖乳突肌拉向右側(cè)，充分暴露出右側(cè)頸總動脈鞘。使用玻璃分針分離右側(cè)頸總動脈鞘及迷走神經(jīng)，游離出CCA。調(diào)整自制拉鉤的位置，使右側(cè)頸部的肌肉拉向右上方，充分暴露CCA遠心端，繼續(xù)使用玻璃分針向遠心端方向分離CCA直至頸內(nèi)動脈(ICA)與頸外動脈(ECA)分叉處。使用4-0手術(shù)縫合線結(jié)扎右側(cè)CCA及ECA近心端，并預(yù)留一段牽引線。在CCA遠心端靠近ICA與ECA分叉處套一個活結(jié)備用，用血管夾暫時夾閉ICA以阻斷血流。右手拇指、中指持預(yù)先放入栓線并消毒的6號注射器針頭，左手持CCA近心端的牽引線并輕微向近心端方向牽拉，以CCA繃直為度。將針尖斜切面朝上向CCA遠心端方向刺入。針尖斜切面完全進入CCA后，用右手食指向CCA內(nèi)推動線栓，通過分叉處的活結(jié)，直至血管夾處。左手松開CCA近心端的牽引線并持眼科鑷夾住線栓及血管，右手輕輕向后退出針頭。收緊CCA遠心端的活結(jié)但不扎死，松開血管夾，慢慢將線栓推入ICA，線栓進入分叉處(18±1)mm[14]，線栓頭部傳來輕微的抵抗感，即說明線栓頭部進入大腦中動脈(MCA)，阻斷血流。扎死CCA遠心端的活結(jié)，剪去多余的線栓尾部、線頭，也可保留線栓尾部于體外，待一定時間后向后拉出一段線栓造成再灌注模型。松開拉鉤，生理鹽水沖洗手術(shù)區(qū)域后用3-0縫合線以單純連續(xù)縫合法縫合切口，酒精消毒，手術(shù)完成。將大鼠以頭高腳低位仰臥放置于鼠籠中，待其清醒。B組手術(shù)方法：參照ZeaLonga[12]的方法并稍加改變，手術(shù)過程如下：分離結(jié)扎血管步驟同上，用眼科剪在CCA上剪一斜形開口并插入線栓，余步驟與A組手術(shù)方法相同。

1.5神經(jīng)功能評分

參照Bederson神經(jīng)功能評分標準[15]，0分無神經(jīng)功能缺損癥狀；1分不能完全伸展左前肢(提尾懸空實驗陽性)；2分左肩部側(cè)推抵抗力下降(側(cè)向推力實驗陽性)，伴左前肢屈曲；3分左肩部側(cè)推抵抗力下降，伴自發(fā)性旋轉(zhuǎn)(自由活動時向左側(cè)劃圈)；4分不能自發(fā)行走，伴有意識喪失。

1.6數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析

2　結(jié)果

兩組插線栓時間、成功率、存活率比較：動物術(shù)后24h內(nèi)存活，且神經(jīng)功能評分1分以上為手術(shù)成功。A、B兩組平均插線栓時間分別為(82.3±17.4)s、(164.6±22.0)s，差異有顯著性(P<0.01)。表1為兩組手術(shù)成功率和死亡率的情況。結(jié)果表明，A組成功率高于B組，差異無顯著性(P>0.05)；A組死亡率低于B組，但差異無顯著性(P>0.05)。

表1　兩組手術(shù)成功率和死亡率比較(n =16)

3　討論

3.1器材

采用自制拉鉤及鼠板，比市售商品廉價實用，且可以在充分暴露術(shù)野的前提下盡量減小傷口，對大鼠刺激減小，節(jié)約手術(shù)時間，降低感染風(fēng)險。

3.2麻醉

水合氯醛溶液不穩(wěn)定，久置、光照、高溫均可促進其分解，需現(xiàn)配現(xiàn)用，否則易引起大鼠死亡；術(shù)前禁食不禁水24h，否則食物影響體重易導(dǎo)致水合氯醛給藥不精確造成死亡；腹腔注射時針頭進入大鼠腹腔后需注意將針頭退出些許，防止麻醉藥注射入腸腔造成麻醉不足及術(shù)后腸梗阻。

3.3吸痰

水合氯醛麻醉會造成呼吸道分泌物增多，易導(dǎo)致大鼠窒息而死，固定大鼠后將大鼠舌頭拉向一側(cè)，術(shù)中需隨時關(guān)注大鼠呼吸狀態(tài)，呼吸道分泌物增多時可用注射器吸痰。

3.4備皮

盡量備皮干凈且不傷到皮膚，嚴格執(zhí)行外科手術(shù)消毒標準，降低術(shù)后感染的風(fēng)險。

3.5分離

分離頸動脈鞘及迷走神經(jīng)時盡量采用玻璃分針，減少對迷走神經(jīng)的刺激。

3.6結(jié)扎

結(jié)扎血管、動脈夾夾閉ICA時需遠離頸動脈竇及迷走神經(jīng)節(jié)，防止大鼠猝死，且建議都結(jié)扎準備完畢最后再用血管夾夾閉ICA，減少金屬刺激血管及迷走神經(jīng)節(jié)的時間。結(jié)扎完血管后線頭保留適當(dāng)長度，當(dāng)線栓進入血管后在入顱部分難以推進時，可以充當(dāng)牽引線，適當(dāng)調(diào)整血管及線栓角度，可提高成功率。

3.7線栓

根據(jù)大鼠的體重選擇合適的線栓。最初線栓多是實驗人員以魚線為原材料自己手工燒制而成，線栓品質(zhì)不穩(wěn)定，現(xiàn)在多采購機械化生產(chǎn)的成品線栓，保證線栓的穩(wěn)定性；朱繼[16]等研究發(fā)現(xiàn)，通過將線栓預(yù)設(shè)為弧形，與ICA走行一致，通過調(diào)整推送線栓角度而不會進入翼腭動脈(PPA)，避免對PPA的結(jié)扎操作，減小刺激，提高成功率。課題組通過多次實驗發(fā)現(xiàn)，線栓凹面向內(nèi)向上彎曲時更易進入ICA。

3.8手法

穿刺時盡量將針頭與CCA保持平行，以免刺穿血管，且穿刺孔盡量靠近CCA近心端，以防一次穿刺不成功后找不到針眼，可以繼續(xù)向遠心端尋找穿刺點。如若多次調(diào)整血管及線栓角度仍未成功，建議退出線栓并用血管夾夾閉ICA，更換不同弧度的線栓再次嘗試插入，可大大提高成功率。切不可蠻力硬插入線栓，否則易導(dǎo)致腦出血。退出針頭前需用眼科鑷夾住固定線栓及血管，防止在退出針頭時將線栓也一并退出血管。

3.9深度

線栓插入約16mm時應(yīng)當(dāng)放開牽引線，放松血管至正常生理形態(tài)，然后緩慢推進線栓，至手下有輕微抵抗感即可，此時插入深度約(18±1)mm[14]。若牽拉血管會導(dǎo)致血管正常形態(tài)改變，線栓插入成功后放松血管會導(dǎo)致其位置改變，影響梗塞效果。

3.10其他方法

本課題組成員在實驗初期嘗試不分離頸動脈鞘及迷走神經(jīng)直接結(jié)扎血管插入線栓，以期減小對血管及神經(jīng)的刺激，同時縮短手術(shù)時間。但通過多次預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)一次插入線栓不成功時，血管塌陷，很難區(qū)分頸動脈鞘及血管，難以再次插入線栓；且插入后因頸動脈鞘遮擋，難以看清線栓上的標記，難以準確掌握線栓插入的深度，失敗率較高，故未采用。亦嘗試過按照備皮、分離、插線栓、縫合四個步驟多人員流水作業(yè)方法，每個成員負責(zé)自己最擅長的部分，大大節(jié)省造模時間。但是當(dāng)大批量造模時，人和機器不同，疲倦現(xiàn)象嚴重，不利于長時間造模手術(shù)的進行。

3.11B組劣勢

采用B組手術(shù)插線栓方法時，模型成功率較低，且死亡率較高。本課題組成員討論后認為可能原因如下：(1)用眼科剪剪開的斜形開口，在插入線栓時開口部分容易被拽斷，改變了血管原有的生理形態(tài)，所以難以將線栓送入顱內(nèi)。(2)即使勉強將線栓送入顱內(nèi)，也因血管斷開，其生理形態(tài)改變而不確定線栓插入的深度，故模型的穩(wěn)定性及成功率較低。(3)手術(shù)時間較長，且反復(fù)推送線栓不得進入，對血管壁有刺激，術(shù)中出血量增多，易引起大鼠死亡。(4)反復(fù)推送線栓易導(dǎo)致血管壁被刺穿，造成腦出血。

3.12不足與展望

本方法滿足再灌注的需求，但因后續(xù)實驗需要永久性腦梗塞模型，故未做再灌注模型的成功率及存活率的統(tǒng)計。其次，因樣本量小，可能對數(shù)據(jù)會有誤差，對手術(shù)成功率及存活率的意義，有待進一步大數(shù)據(jù)實驗分析。最后，因后續(xù)實驗對大鼠治療，故未計算梗死體積變異系數(shù)，模型穩(wěn)定性未知，有待進一步驗證。

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A modified method for common carotid artery puncture in theestablishmentofaratmodelofmiddlecerebralarteryocclusion

LIUHua1，2,LIUYue-mei3,GUANRui1,2,XUZhao4,ZHUWen-zeng1

(1.Guang’anmenHospital,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100032,China;2.BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029; 3.BeijingNormalUniversity,Beijing100875;4.DongzhimenHospitalEasternDistrict,AffiliatedtoBeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing101121)

ObjectiveTocomparethetimeliness,successandmortalityratesbetweenthemodifiedcarotidarterypuncturemethod(MCAPM)andstandardsuturemethod(SSM)intheestablishmentofratmodelofamiddlecerebralarteryocclusion(MCAO).MethodsThirty-twomaleratswererandomlyandequallyassignedintoMCAPMgroupandSSMgroup.TheMCAOmodelswereestablishedbyinsertingathreadintothecommoncarotidartery(CCA). 24haftermodeling,theratsofthetwogroupswereevaluatedwithBedersonneurologicalscores,andthemodelingsuccessrateandmortalityratewereanalyzed.ResultsThesutureinsertiontimes,successratesandmortalityratesoftheMCAPMvs.SSMgroupswere(82.3±17.4)sversus(164.6 ±22.0)s(P<0.01), 87.5%versus68.75% (P>0.05),and6.25%versus18.75% (P>0.05).ConclusionsMCAPMcanbeusedtoestablishtheratmodelofMCAOduetoitssimplicity,mildwoundandfeasibility.

Cerebralischemia;Middlecerebralarteryocclusion,MCAO;Standardsuturemethod;Rat

ZHUWen-zen.E-mail:zhuwenzeng530@163.com

國家自然科學(xué)基金面上項目(81273841)。

劉華(1991年-)，男，碩士研究生，研究方向：中醫(yī)學(xué)專業(yè)。E-mail：liuhua@bucm.edu.cn

朱文增，博士后，主任醫(yī)師。E-mail：zhuwenzeng530@163.com

研究報告

Q95-33

A

1005-4847(2016)04-0399-04

10.3969/j.issn.1005-4847.2016.04.012

2016-01-19