lncRNA SPRY4-IT1在肝癌中的作用研究

李培磊 展洋洋 張銘健 劉芳 殷鵬 傅志仁★

lncRNA SPRY4-IT1在肝癌中的作用研究

李培磊 展洋洋 張銘健 劉芳 殷鵬 傅志仁★

目的 研究長鏈非編碼RNA SPRY4-IT1（lncRNA SPRY4-IT1）在肝細胞肝癌（HCC）中的表達，及其對肝癌細胞系Hep G2惡性生物學表型的調控作用。方法 收集2013年9月至2014年12月60例肝癌及癌旁組織樣本，利用熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）檢測lncRNA SPRY4-IT1在肝癌組織中的表達，并檢測lncRNA SPRY4-IT1在人源性肝癌細胞系Hep G2、HHCC、SK-HEP-1中的表達；利用小干擾RNA沉默Hep G2細胞內lncRNA SPRY4-IT1表達，分別進行Transwell 細胞遷移、侵襲及CCK8細胞增殖實驗；建立肝癌裸鼠成瘤模型，觀察干擾lncRNA SPRY4-IT1表達后荷瘤小鼠腫瘤生長的情況。結果 比較癌旁組織，lncRNA SPRY4-IT1肝癌組織中的表達顯著上升（P=0.0109）；比較正常人肝細胞系L02，lncRNA SPRY4-IT1在肝癌細胞系Hep G2、HHCC、SK-HEP-1中表達明顯升高（P均＜0.01），且在Hep G2中上調尤為顯著。干擾lncRNA SPRY4-IT1表達后，Hep G2細胞的遷移和侵襲并未受到明顯影響（P＞0.05），然而其體外增殖活性受到顯著抑制（P＜0.01）；荷瘤小鼠的腫瘤生長也明顯受到抑制（P＜0.01）。結論 長鏈非編碼RNA SPRY4-IT1在HCC中高表達，并通過促進肝癌的增殖而發(fā)揮重要的生物學功能，可能是HCC潛在的治療靶點。

肝細胞肝癌 長鏈非編碼RNA SPRY4-IT1 增殖 遷移 侵襲

肝癌是世界上最為常見的腫瘤之一，在我國的惡性腫瘤中位居第三［1］。肝癌根據細胞類型分為肝細胞肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）和肝膽管細胞肝癌，其中HCC所占比例高達90%［2］。HCC是一種多基因突變的疾病，其發(fā)生發(fā)展中伴隨復雜的分子機制。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一種長度約為200nt的非編碼RNA，是基因轉錄的“垃圾產物”［3］。多項研究表明lncRNA SPRY4-IT1在黑色素瘤、胃癌、腎透明細胞癌、乳腺癌中高表達，且與惡性腫瘤的生長、轉移和預后等具有緊密相關性［4～7］。而關于lncRNA SPRY4-IT1在HCC中所發(fā)揮的生物學功能研究仍未見報道。本文將對lncRNA SPRY4-IT1在肝癌中的表達情況及其所發(fā)揮的生物學效應做進一步研究，以期為HCC治療尋找新的分子靶點。

1 臨床資料

1.1 一般資料 經患者知情同意，收集2013年9月至2014年12月本中心60例HCC患者手術切除標本（癌旁及癌組織）。其中男43例，女17例；年齡40～75歲，平均（53.02±2.3）歲。所有患者術前未行放化療及介入等干預措施，手術均為根治性切除術，留取腫瘤組織及距離腫瘤組織＞5cm的癌旁組織。腫瘤基本情況：腫瘤直徑1.3～7.1cm，平均（4.6±1.7）cm。術后病理結果顯示均為HCC。腫瘤標本取下后立即放入液氮中凍存。

1.2 試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)液及胎牛血清購自美國Gibco公司。lncRNA SPRY4-IT1干擾序列（siSPRY4-IT1）、陰性對照序列（siNC）及GAPDH引物序列由上海吉瑪公司合成。RNA轉染試劑INTERFERin購自美國Polyplus-tansfection公司。in vivo-JetPEI購自法國Polyplus Transfection公司。Trizol試劑購自美國Invitrogen公司。RNA逆轉錄試劑盒購自美國GeneCopoeia公司。相對熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）試劑盒購自日本Takra公司。Transwell細胞遷移檢測試劑盒購自美國Chemicon公司。CCK8細胞增殖檢測試劑盒購自美國Yeasen公司。ABI-7500實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司、5424R冷凍離心機購自德國Eppendorf公司。Epoch96孔板微量分光光度儀購自美國Biotek公司。BX53 奧林巴斯顯微鏡購自日本Olympus 公司。Tissuelyser-192全自動樣品快速研磨儀購自上海凈信科技有限公司。

1.3 方法 （1）細胞培養(yǎng)及RNAi干擾：所有細胞均使用含10%濃度胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在5%CO2、37℃、相對濕度90%條件下進行培養(yǎng)。Hep G2細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期時采用INTERFERin轉染試劑并按試劑說明書進行l(wèi)ncRNA SPRY4-IT1干擾序列（siSPRY4-IT1）及陰性對照序列（siNC）的轉染。siSPRY4-IT1序列為：5'-CCCAGAATGTTGACAGCTGCCTCTT-3'，以無義序列siNC作為陰性對照。（2）RNA提取以及實時熒光定量PCR（qRT-PCR）：取100mg凍存的組織，采用全自動樣品快速研磨儀充分研磨，加入1ml Trizol試劑進行RNA的提取。取1×107個細胞，加入1ml Trizol試劑進行RNA提取。抽提后的RNA采用96孔板微量分光光度儀在波長260nm及280nm下進行濃度及純度的檢測，A260/A280為1.8～2.1說明樣品純度合格。采用RNA逆轉錄試劑盒并按照操作說明書進行RNA的逆轉錄。qRT-PCR按照SYBR Green試劑盒說明書進行反應體系的配制，以GAPDH作為內參，每個樣本設置3個復孔。引物序列如下：lncRNA SPRY4-IT1：Forward：5'-AGCCACATAAATTCAGCAGA-3'；Reverse：5'-CGATGTAGTAGGATTCCTTTCA-3'；GAPDH：Forward：5'-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3'；Reverse：5'-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3'。（3）Transwell檢測Hep G2細胞遷移和侵襲：在遷移分析中，各組細胞以3×104個/孔接種于24空Transwell小室，每組設置3個復孔，上室加入100μl DMEM無血清培養(yǎng)液，下室加入600μl含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后取出上室，吸取下室中培養(yǎng)液，加入結晶紫染色液100μl/孔，染色15min，PBS洗滌2遍，100倍顯微鏡下選取5個視野觀察細胞并計算平均值。在侵襲分析中，小室以基質膜包被，后續(xù)步驟同遷移分析。（4）CCK8檢測Hep G2細胞增殖：取對數(shù)期生長的Hep G2細胞，以2×105/孔接種于96孔板，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液200μl/孔，每組設置6個復孔，以不含細胞的空白培養(yǎng)基作為對照。加入CCK8試劑1次/d 37℃孵育30min后，于450nm波長下測定吸光光度值。連續(xù)測定72h。（5）肝癌裸鼠移植瘤模型的建立：取對數(shù)生長期的Hep G2細胞，消化細胞后采用DMEM調整細胞濃度為2×107/ ml。取16只裸鼠，于每只裸鼠右后肢外側皮下注射100μl Hep G2細胞懸液成瘤。自第2周開始使用游標卡尺測量瘤體的長徑（a）和短徑（b），并計算瘤體體積，公式為：瘤體體積=4/3×π×r3［r=（a+b）/4］。（6）動物分組及處理：Hep G2細胞接種1周后，將16只裸鼠隨機平均分為siNC對照組和siSPRY4-IT1處理組。siNC對照組：瘤體內多點注射jetPEI/siNC復合物（15μg siNC及 2.4μl JetPEI）；siSPRY4-IT1處理組：瘤體內多點注射jetPEI/siSPRY4-IT1復合物（15μg siSPRY4-IT及 2.4μl JetPEI）。復合物均采用0.9%生理鹽水稀釋至20μl。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 lncRNA SPRY4-IT1在HCC中的表達及RNAi干擾效果 采用qRT-PCR對60例肝癌及相對應的正常癌旁組織中l(wèi)ncRNA SPRY4-IT1的內源性表達進行檢測。與相應正常癌旁組織比較，肝癌組織中l(wèi)ncRNA SPRY4-IT1相對表達發(fā)生顯著上調（P=0.0109）。同樣采用qRT-PCR對lncRNA SPRY4-IT1在人來源的肝癌細胞系中的表達進行檢測，與L02人正常肝細胞系比較，lncRNA SPRY4-IT1在Hep G2、HHCC、SK-HEP-1肝癌細胞系中的表達均顯著上升（P＜0.01），且在Hep G2中上調最為顯著（P=0.0001）。采用lncRNA SPRY4-IT1的干擾小RNA siSPRY4-IT1轉染Hep G2細胞，檢測siSPRY4-IT1的干擾效率，轉染siSPRY4-IT1后，lncRNA SPRY4-IT1的表達發(fā)生顯著下調（P＜0.01）。

2.2 lncRNA SPRY4-IT1對肝癌細胞遷移和侵襲的影響 采用Tanswell實驗，對轉染siNC以及轉染siSPRY4-IT1的Hep G2細胞遷移和侵襲能力進行檢測。如圖1所示，與未轉染組及轉染siNC組比較，轉染siSPRY4-IT1組細胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結果提示lncRNA SPRY4-IT1對肝癌細胞的遷移無影響。

圖1 1ncRNA SPRY4-IT1對肝癌細胞遷移和侵襲的影響

圖3 采用CCK8細胞增殖實驗檢測干擾1ncRNA SPRY4-IT1表達后細胞增殖情況

圖4 轉染siNC以及si SPRY4-IT1的Hepa G2細胞種植于裸鼠后的瘤體大小

2.3 lncRNA SPRY4-IT1對肝癌細胞增殖的影響 為進一步探究lncRNA SPRY4-IT1在肝癌中發(fā)揮的生物學效應，采用CCK8細胞增殖實驗檢測了干擾lncRNA SPRY4-IT1表達后，細胞增殖的情況。比較未轉染組和轉染siNC組，轉染siRNA SPRY4-IT1組細胞增殖數(shù)目顯著降低（P＜0.01），細胞增殖速度也受到抑制。

2.4 lncRNA SPRY4-IT1對裸鼠移植瘤生長的影響 將轉染siNC以及si SPRY4-IT1的Hep G2細胞分別種植于裸鼠皮下，構建裸鼠移植瘤模型，觀察裸鼠瘤體的生長情況。與siNC組小鼠比較，si SPRY4-IT1組裸鼠移植瘤生長受到顯著抑制，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

3 討論

生物基因組中數(shù)量龐大的非編碼序列的功能一直備受關注，隨著生物技術的不斷進步，逐漸發(fā)現(xiàn)非編碼RNA在細胞正常生理代謝及調控中所具有的重要作用，并且其表達的異常與多種疾病，尤其是與腫瘤發(fā)生發(fā)展有著緊密的關系［8］。近年來，多種lncRNA在調控腫瘤惡性生物學表型中發(fā)揮著重要的功能，是腫瘤最具潛力的治療靶點。因此探究HCC中異常表達的lncRNA及其發(fā)揮的生物學功能，對于尋找肝癌的分子治療靶點，改善患者預后具有重要的科研價值和臨床意義。

lncSPRY4-IT1是一種706個堿基序列的轉錄產物，研究顯示其位于SPRY4基因序列的內含子中，但其轉錄調控及作用功能與SPRY4基因相互獨立［9］。本資料中，lncSPRY4-IT1在肝癌中的表達上升，進一步在細胞中檢測lncSPRY4-IT1發(fā)現(xiàn)其在肝癌細胞系中表達也顯著高于正常肝細胞，提示lncSPRY4-IT1在肝癌中的異常過表達可能在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的調控作用。有研究報道，lncSPRY4-IT1在胃癌［4］、膀胱癌［10］以及黑色素瘤［5］中發(fā)生顯著的上調表達，干擾其表達后可以顯著抑制細胞的遷移。作者在肝癌中干擾lncSPRY4-IT1的表達后，同樣對細胞的遷移進行了檢測，但細胞的遷移并未受到明顯抑制。因此作者推測lncSPRY4-IT1雖然在多種類型的腫瘤中發(fā)生異常表達，但在不同類型的腫瘤中發(fā)揮著不同的生物學功能。本資料中，干擾lncSPRY4-IT1表達后，肝癌細胞的增殖亦明顯受到抑制。利用肝癌裸鼠移植瘤模型，在體內進一步驗證lncSPRY4-IT1的促腫瘤作用，結果顯示干擾lncSPRY4-IT1后，裸鼠移植瘤的生長也受到顯著抑制。說明肝癌中過表達的lncSPRY4-IT1對腫瘤細胞的增殖有明顯的促進作用。

隨著分子生物學技術的不斷突破，關于深入研究lncRNA的作用機制成為可能。目前推測lncRNA的作用機制有：（1）lncRNA可以結合轉錄因子蛋白，調控轉錄因子活性，進而調控基因的表達。（2）lncRNA可以作用于染色體的空間構象或者結合mRNA從而調控基因的表達。（3）lncRNA可以通過吸附內源性microRNA，通過調控microRNA的功能而達到調控基因的表達目的等。lncRNA不同于研究比較成熟、作用機制較為明確的microRNA，其研究尚處于早期階段，作用機制復雜，本資料肝癌中l(wèi)ncRNA發(fā)生上調的分子機制以及其促進腫瘤增殖的作用機制仍有待于進一步研究。

1 Zuo TT，Zheng RS，Zhang SW，et a1.Incidence and morta1ity of 1iver cancer in China in 2011.Chin J Cancer，2015，34（3）：56.

2 Wanqing Chen，Rongshou Zheng，Hongmei Zeng，et a1.The updated incidences and morta1ities of major cancers in China，2011.Chin J Cancer，2015，34（3）：1～6.

3 Ponjavic J，Ponting CP，Lunter G.Functiona1ity or transcriptiona1 noise？ Evidence for se1ection within 1ong noncoding RNAs.Genome Res，2007，17（5）：556～565.

4 Wei Peng，Guoqiu Wu，Hong Fan，et a1.Long noncoding RNA SPRY4-IT1 predicts poor patient prognosis and promotes tumorigenesis in gastric cancer.Tumour Bio1，2015，36（9）：1～8.

5 Mazar J，Zhao W，Kha1i1 AM，et a1.The functiona1 characterization of 1ong non-coding RNA SPRY4-IT1 in human me1anoma ce11s.Oncotarget，2014，5（19）：8959～8969.

6 Zhang HM，Yang FQ，Yan Y，et a1.High expression of 1ong non-coding RNA SPRY4-IT1 predicts poor prognosis of c1ear ce11 rena1 ce11 carcinoma.Int J C1in Exp Patho1，2014，7（9）：5801～5809.

7 Shi Y，Li J，Liu Y，Ding J.The 1ong noncoding RNA SPRY4-IT1 increases the pro1iferation of human breast cancer ce11s by upregu1ating ZNF703 expression.Mo1 Cancer，2015，14（1）：1～13.

8 Shi X，Sun M，Liu H，et a1.Long non-coding RNAs： A new frontier in the study of human diseases.Cancer Lett，2013，339（2）：159～166.

9 Divya Khaitan，Marce1 E Dinger，Joseph Mazar1.The Me1anoma-Upregu1ated Long Noncoding RNA SPRY4-IT1 Modu1ates Apoptosis and Invasion.Cancer Res，2011，71（11）：3852～3862.

10 Hai-Wei Xie，Qing-Quan Wu，Bin Zhu，et a1.Long noncoding RNA SPRY4-IT1 is upregu1ated in esophagea squamous ce11 carcinoma and associated with poor prognosis.Tumor Bio1，2014，35（8）：7743～7754.

Objective This research aimed to observe the expression of long non-coding RNA SPRY4-IT1 in hepatocellular carcinoma（HCC）and its regulation on malignant biological functions of HepaG2. Methods Quantitative real-time polymerase chain reaction（qRT-PCR）was used to detect the lncRNA SPRY4-IT1 expression in HCC on 60 paired cancerous and adjacent tissue samples，also we observed the lncRNA SPRY4-IT1 expression in Hep G2、HHCC、SK-HEP-1；Small interfering RNA was used to suppress lncRNA SPRY4-IT1 expression in Hep G2；then we used CCK-8 assays and Transwell experiment to investigate the function of lncRNA SPRY4-IT1 in HCC；nude mice model was performed to observed the tumor size after interfering lncRNA SPRY4-IT1 expression. Results We found remarkable elevated lncRNA SPRY4-IT1 expression in cancerous tissues compared with adjacent non-cancerous tissues（P=0.0109）；lncRNA SPRY4-IT1 expression markedly increase in Hep G2、HHCC、SK-HEP-1 （P＜0.01），especially in Hep G2；the migration and invasion had not been obviously affected（P＞0.05）while the proliferation was significantly inhibited（P＜0.01）after silence the expression of lncRNA SPRY4-IT1 in HepG2 cells；the tumor size of nude mice was also suppressed after interfering lncRNA SPRY4-IT1 expression. Conclusion Long non-coding RNA SPRY4-IT1 is highly expressed in hepatocellular carcinoma.It plays an important role in biological function by promoting the proliferation of hepatocellular carcinoma.Long non-coding RNA SPRY4-IT1 may be an important molecular marker and a potential therapeutic target of hepatocellular carcinoma.

Hepatocellular carcinoma Long non-coding RNA SPRY4-IT1 Proliferation Migration Invasion

200010 上海市長征醫(yī)院器官移植中心