CELF1蛋白在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及臨床意義

吳斌 孫才興 馮方 夏亮★

CELF1蛋白在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及臨床意義

吳斌 孫才興 馮方 夏亮★

目的 探討CELF1在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及臨床意義。方法 采用免疫組織化學(xué)技術(shù)及Western blot檢測(cè)62例腦膠質(zhì)瘤患者中CELF1的表達(dá)情況，分析CELF1蛋白表達(dá)及臨床病理特征之間的關(guān)聯(lián)。采用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析。結(jié)果 在腦膠質(zhì)瘤中CELF1的表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)上調(diào)與腦膠質(zhì)瘤的惡性程度及預(yù)后明顯相關(guān)。結(jié)論 CELF1可能成為膠質(zhì)瘤的獨(dú)立預(yù)后因素。

膠質(zhì)瘤 CELF1 預(yù)后

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤之一，惡性膠質(zhì)瘤約占原發(fā)性惡性腦腫瘤的70%［1］，盡管外科手術(shù)水平、放療、化療技術(shù)不斷提高，但并未能顯著改善腦膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后，患者的中位生存期一般為9～12個(gè)月［2］。因此，發(fā)現(xiàn)新的分子生物學(xué)標(biāo)記物對(duì)確定膠質(zhì)瘤的分子亞型和進(jìn)行個(gè)體化治療及判斷預(yù)后具有重要意義。CELF1是CELF家族的成員之一，是一類發(fā)育調(diào)控的RNA結(jié)合蛋白質(zhì)家族。然而，CELF1與腦膠質(zhì)瘤的關(guān)系尚不清楚。本研究采用免疫組化染色和Western blot檢測(cè)62例腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本中CELF1蛋白的表達(dá)情況，并對(duì)其與臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，探討CELF1在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用及臨床意義。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取本院2005年2月至2013年6月治療并有完整隨訪資料的62例患者標(biāo)本，所有患者術(shù)前均未接受過(guò)放化療，其中男30例，女32例；年齡35～74歲，平均年齡53歲。低級(jí)別膠質(zhì)瘤（WHO I～I(xiàn)I級(jí)）25例，高級(jí)別膠質(zhì)瘤（WHO III～I(xiàn)V級(jí)）37例。另有8例腦外傷患者行顱內(nèi)減壓手術(shù)切除的正常腦組織（NB）作為對(duì)照組。所有患者均行顯微神經(jīng)外科手術(shù)治療，并獲得明確病理診斷。術(shù)后高級(jí)別膠質(zhì)瘤患者均行標(biāo)準(zhǔn)同步放化療，放療劑量54～60Gy，并給予STUPP方案替莫唑胺輔助化療6個(gè)周期；低級(jí)別膠質(zhì)瘤有高危因素的患者行術(shù)后放療，放療劑量45～54Gy。

1.2 主要材料與試劑 CELF1多克隆抗體（Abcom公司，美國(guó)），辣根過(guò)氧化物酶（HRP） 標(biāo)記的驢抗山羊IgG（H+L）（南通碧云天生物技術(shù)研究所），生物素化鼠抗山羊IgG免疫組化試劑盒 （德國(guó)漢堡Dako公司生產(chǎn)），抗β- actin單克隆抗體（南通碧云天生物技術(shù)研究所），Trizol 購(gòu)自 Invitrogen 公司；逆轉(zhuǎn)錄及半定量PCR 試劑盒購(gòu)自Ferments公司；聚合過(guò)氧化物酶標(biāo)記鼠抗山羊 IgG Western Blot 試劑盒 （南通碧云天生物技術(shù)研究所）。

1.3 方法 （1）免疫組織化學(xué)法：選取材料（5μm）制備載玻片，并用10%聚賴氨酸覆蓋。用梯度乙醇溶液進(jìn)行脫蠟，并且將切片浸泡在0.3%過(guò)氧化氫溶液中30min以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。為了重新得到抗原，將切片置于10 mmol/L pH 6.0 的檸檬酸緩沖液中，并加熱至121℃保持20min。PBS（pH7.2）沖洗以阻止任何非特異性反應(yīng)，然后在室溫下加入驢血清（10%）反應(yīng)1h，再與山羊抗人CELF1多克隆抗體（1：100稀釋；Abcam公司，美國(guó)）在4℃下一起溫育過(guò)夜。根據(jù)過(guò)氧化物酶-抗過(guò)氧化物酶方法（Dako公司，德國(guó)）處理每個(gè)載玻片。PBS溶液沖洗后，將玻片與二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽一起置于0.05mol/L pH7.6的Tris緩沖液進(jìn)行孵育，該緩沖液中含有0.03%的過(guò)氧化氫，然后發(fā)生過(guò)氧化物酶反應(yīng)。每個(gè)玻片都進(jìn)行蘇木染色，隨后脫水并蓋片。為了評(píng)估CELF1在不同分級(jí)腫瘤中的表達(dá)，每個(gè)玻片選取10個(gè)隨機(jī)視野放大400倍進(jìn)行檢查，并用萊卡光學(xué)顯微鏡（ Wetzlar，德國(guó)）進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，并檢測(cè)核染色。選擇＞500個(gè)細(xì)胞 進(jìn)行計(jì)數(shù)計(jì)算平均百分比，即染色細(xì)胞的百分比。如果核染色＞5%定義CELF1蛋白表達(dá)為陽(yáng)性（胞漿染色不算）。如果核染色分別＜5%、5%～30%、30%～70% 或＞70%，蛋白表達(dá)分別定義為（-）、（+）、（++）或 （+++）。（2）蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）：提取總蛋白，并用牛血清白蛋白的方法檢測(cè)蛋白濃度（碧云天生物技術(shù)研究所，南通）。每一個(gè)樣品提取40μg蛋白質(zhì)裂解物，以10%丙烯酰胺凝膠進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后在350 mA下將其轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（Millipore公司，美國(guó)）反應(yīng)2.5h。采用脫脂牛奶（5%）阻斷反應(yīng)膜，利用針對(duì)CELF1（1：500，Abcam公司，美國(guó)），CDKN1B （1：1000，Sigma，美國(guó)），caspase-3 （1：1000，Abcam公司，美國(guó)），裂解的 caspase-3 （1：1000，Abcam公司，美國(guó)） 或 β-肌動(dòng)蛋白 （1：2000，碧云天生物技術(shù)研究所，南通）的第一抗體在4℃下一起孵育過(guò)夜。接著，加入HRP綴合的第二抗體（1：500，碧云天生物技術(shù)研究所，南通）進(jìn)行溫育。去除封閉液和抗體后，采用超增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL，碧云天生物技術(shù)研究所，南通）的Western印跡檢測(cè)試劑重新標(biāo)記含有β-肌動(dòng)蛋白的膜（1：2000，碧云天生物技術(shù)研究所，南通）。在ECL系統(tǒng)（碧云天生物技術(shù)研究所，南通）下觀察蛋白質(zhì)。每個(gè)蛋白條帶都可由光密度進(jìn)行量化，以柱狀圖表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法和log-rank檢驗(yàn)評(píng)估CELF1表達(dá)和患者生存的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化 免疫組化結(jié)果表明CELF1蛋白定位于細(xì)胞核中，具有較高的表達(dá)（圖1）。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的總陽(yáng)性率可達(dá)87.10%。在不同分級(jí)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤中均可觀察到由低至高的CELF1表達(dá)，而在正常腦組織中僅檢測(cè)到3例CELF1弱陽(yáng)性（+）表達(dá)。54例腦膠質(zhì)瘤組織中檢測(cè)到不同水平的CELF1陽(yáng)性表達(dá)（+，++，+++）； 其中31例高級(jí)別腦膠質(zhì)瘤中可檢測(cè)到CELF1的陽(yáng)性（++）或強(qiáng)陽(yáng)性（+++）表達(dá)；低級(jí)別腦膠質(zhì)瘤中有4例檢測(cè)到CELF1的陽(yáng)性（++）或強(qiáng)陽(yáng)性（+++）表達(dá)。表明CELF1表達(dá)隨著腫瘤等級(jí)的上升而增加。

2.2 Western blot 在不同分級(jí)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織中均檢測(cè)出CELF1蛋白的表達(dá)。CELF在不同分級(jí)（I～I(xiàn)V）的膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)（1.06±0.15）顯著高于正常腦組織（0.36±0.08）（P＜0.01）。同時(shí)其表達(dá)在低等級(jí)膠質(zhì)瘤組織（I～I(xiàn)I）（0.83±0.11）和高等級(jí)（III～I(xiàn)V）膠質(zhì)瘤組織（1.26±0.14）中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 CELF1表達(dá)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的臨床病理特征之間的相關(guān)性 根據(jù)CELF1的表達(dá)譜，神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織的表達(dá)水平可分為高表達(dá)（+++++）或低表達(dá)（+，-）。實(shí)驗(yàn)表明，CELF1表達(dá)水平與患者性別、年齡、腫瘤體積或起源部位之間無(wú)顯著相關(guān)性（P＞0.05）。然而，CELF1的表達(dá)水平與腫瘤的病理分級(jí)具有顯著相關(guān)性（P=0.002）。在患者的總生存方面，高表達(dá)組和低表達(dá)組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001）。比較于CELF1表達(dá)較低的患者，CELF1表達(dá)上調(diào)患者的總生存時(shí)間更短。因此，CELF1表達(dá)可能成為神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的獨(dú)立預(yù)后因素。

圖1 正常腦組織和不同分級(jí)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤中CELF1免疫組化的代表性切片（×400）

3 討論

目前的研究表明膠質(zhì)瘤是由多個(gè)基因之間的相互作用引起的復(fù)雜疾病，涉及多種癌基因的激活和抑癌基因的失活［3］。CELF1是CELF家族的成員之一（CUGBP 和ETR樣因子），是一類發(fā)育調(diào)控的RNA結(jié)合蛋白質(zhì)家族，在人類基因組中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CELF1、CUGBP2、CELF3、CELF4、CELF5及CELF6等6個(gè)家族成員［4］。這些蛋白質(zhì)的功能是多方面的，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞核中，CELF1至CELF6通過(guò)刺激非連續(xù)性外顯子的保留或刪除而調(diào)節(jié)一些mRNA［5］。此外還可通過(guò)RNA編輯酶而調(diào)節(jié)一些mRNA的編輯［6］。在細(xì)胞質(zhì)中，通過(guò)結(jié)合靶向mRNA的特定序列而調(diào)節(jié)一些mRNA的翻譯或降解前體的選擇性剪接［7］。利用這些調(diào)節(jié)途徑又進(jìn)一步對(duì)機(jī)體的生物學(xué)功能產(chǎn)生廣泛的影響。Timchenko LT等［8］于1996年首先在幾個(gè)強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良癥（DM）細(xì)胞系、HeLa細(xì)胞和正?；颊叱杉〖?xì)胞系中分離出（CUG）n mRNA前體/mRNA結(jié)合蛋白，并利用其在體外特異性結(jié)合（CUG）8寡核苷酸的特性而從HeLa細(xì)胞中純化2個(gè)蛋白質(zhì)、CELF1和CUGBP2。CELF1是正常細(xì)胞中主要的（CUG）8結(jié)合活性蛋白，而CUG-BP2水平在DM細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)是升高的。這兩種蛋白是一種異基因核內(nèi)核糖核酸蛋白（hnRNP），hNab50的不同亞型，主要定位在細(xì)胞核，并且可能與體內(nèi)多聚腺苷酸化RNA的降解相關(guān)聯(lián)。myotonin蛋白激酶（Mt-PK）mRNA的（CUG）n重復(fù)區(qū)是CUGBP/hNab50的結(jié)合位點(diǎn)，并且能吸附該hnRNP到突變Mt-PK轉(zhuǎn)錄物上。

已有研究表明，CELF1可能影響胚胎發(fā)育包括心臟發(fā)育，骨骼和脂肪組織分化以及生殖細(xì)胞形成［9］。最近研究已經(jīng)表明，CELF1在許多人類惡性腫瘤中均存在過(guò)度表達(dá)，例如非小細(xì)胞肺癌、肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、口腔癌、急性骨髓性白血病和急性B細(xì)胞淋巴瘤［10～15］。但CELF1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中發(fā)生、發(fā)展中的作用尚不清楚。

本研究通過(guò)免疫組化染色和Western blot證實(shí)了在不同分級(jí)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤中均存在由低至高的CELF1表達(dá)，而在正常腦組織中僅檢測(cè)到3例CELF1弱陽(yáng)性（+）表達(dá)。表明在腦膠質(zhì)瘤組織中存在CELF1的過(guò)表達(dá)，且CELF1的表達(dá)程度與腦膠質(zhì)瘤患者的病理分級(jí)明顯相關(guān)，而與年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、KPS評(píng)分無(wú)相關(guān)性，表明CELF1在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。在患者的總生存方面，CELF1高表達(dá)組和低表達(dá)組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001）。相比較于CELF1表達(dá)較低的患者，CELF1表達(dá)上調(diào)患者的總生存時(shí)間更短。提示CELF1可以作為腦膠質(zhì)瘤患者一種可能的治療靶點(diǎn)和一個(gè)有價(jià)值的預(yù)后因素。而CELF1在腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)上調(diào)的分子機(jī)制目前仍有待于進(jìn)一步的研究。

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Objective To discuss the clinical significance of the expression of CELF1 in glioma. Methods We examined CELF1 expression in 62 glioma patients by immunohistochemistry and Western blot.Analysing the association between the expression of CELF1 protein and clinicopathological characteristics. Survival analyses were performed using the Kaplan-Meier method.Result Our results showed that CELF1 protein was frequently up-regulated in human glioma tissues. The expression level of this protein was positively correlated with glioma World Health Organisation grade and inversely correlated with patient survival （P＜ 0.05）.Conclusion CELF1 may be a novel independent prognostic predictor of survival for glioma patients

Glioma CELF1 Prognosis

310022 浙江省腫瘤醫(yī)院神經(jīng)外科