川芎嗪對糖尿病大鼠降血糖及腎臟保護(hù)作用的研究

宋劍飛 鄧九零 陳亮 張利棕 王輝?

川芎嗪對糖尿病大鼠降血糖及腎臟保護(hù)作用的研究

宋劍飛 鄧九零 陳亮 張利棕 王輝?

目的 探討川芎嗪對糖尿病大鼠降血糖及腎臟保護(hù)作用。方法 將經(jīng)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)成功的24只糖尿病大鼠隨機(jī)分為川芎嗪組，陽性對照組，模型組，分別以川芎嗪200mg/（kg·d）、纈沙坦25mg/（kg·d）、生理鹽水10ml/（kg ·d）灌胃，另取8只正常大鼠為正常對照組，生理鹽水10ml/（kg·d）灌胃，連續(xù)給藥6周。給藥后每周稱量大鼠體重，第2、4、6周檢測大鼠空腹血糖；第6周代謝籠法測定24h尿量，并檢測尿蛋白總量（U-TP）與尿微量白蛋白（U-ALB）；第6周末心臟取血，處死大鼠，酶聯(lián)免疫法檢測血清中胰島素的含量；取雙腎，計算腎肥大指數(shù)，光鏡下觀察腎臟病理切片。結(jié)果 模型組大鼠的血糖、24h尿量、U-TP、U-ALB、腎重、腎肥大指數(shù)較正常組均有顯著升高（P＜0.01或P＜0.05），血清胰島素顯著降低（P＜0.05），身體機(jī)能明顯下降，腎臟病理明顯加重；經(jīng)川芎嗪治療6周后，大鼠血糖、24h尿量、U-TP、腎重與腎肥大指數(shù)明顯下降（P＜0.05），但血清胰島素?zé)o明顯升高（P＞0.05），身體機(jī)能顯著改善，腎臟病理狀態(tài)有所減輕。結(jié)論 川芎嗪對糖尿病大鼠有一定的降血糖與腎臟保護(hù)作用，但其降血糖機(jī)制并非通過增加胰島素的分泌。

川芎嗪 糖尿病 降血糖 腎功能

糖尿病是威脅人類健康的第三大非傳染性疾病。糖尿病腎?。―N）是糖尿病微血管并發(fā)癥之一，為糖尿病特有的腎臟并發(fā)癥，目前已成為導(dǎo)致終末期腎病的首要致病因素。DN的基本病理改變?yōu)槟I小球系膜基質(zhì)增生、腎小球毛細(xì)血管基底膜（GBM）增厚與腎小球硬化［1］，目前西醫(yī)尚無理想的治療方法。川芎嗪是從傘形科植物川芎中提取的活性成分［2］，現(xiàn)代藥理研究表明，川芎嗪單用或聯(lián)用其他藥物對糖尿病及其相關(guān)并發(fā)癥有一定的治療作用［3～5］。2014年3月至2015 年1月作者通過實驗研究，探討川芎嗪對糖尿病大鼠降血糖及腎臟保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康SPF級雄性SD大鼠32 只，體重（270±20）g，由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供，動物許可證號為SCXK（滬）2013-0018；飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心屏障系統(tǒng)內(nèi)，使用SYXK許可證號為（浙）2013-0184。

1.2 藥物與試劑 川芎嗪（上海源葉生物科技有限公司）；纈沙坦（北京諾華制藥有限公司）；鏈脲佐菌素（Sigma）；胰島素檢測試劑盒（上海源葉生物科技有限公司）；其他有機(jī)試劑均為分析純（華東醫(yī)藥股份有限公司）。

1.3 實驗儀器 KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；血糖測試儀及血糖試劑條（羅氏）；全自動血液生化分析儀（日立7020）；DMI 3000B顯微鏡（德國Leica）。

1.4 實驗方法 （1）糖尿病大鼠模型的制備及分組：32只SD大鼠分為糖尿病組（DM組，n=24）和正常對照組（NC組，n=8），適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，禁食12 h，按40mg/kg對DM組大鼠行一次性尾靜脈注射STZ （0.1mol/L檸檬酸鹽緩沖液，pH4.5，新鮮配制）；NC組大鼠注射等量檸檬酸鹽緩沖液。各組大鼠給予標(biāo)準(zhǔn)飲食喂養(yǎng)，自由飲水。1周后尾靜脈取血，空腹血糖≥16.7mmol/L為糖尿病大鼠。將成模的24只大鼠按照血糖和體重隨機(jī)分為川芎嗪組、模型組、陽性對照組，每組各8只。川芎嗪組給予川芎嗪200mg/（kg ·d）灌胃，陽性對照組給予纈沙坦25 mg/（kg·d）灌胃，模型組與NC組灌服等量生理鹽水，連續(xù)灌胃6周。（2） 標(biāo)本的收集與處理：實驗結(jié)束前1d，代謝籠法收集各組大鼠24h尿液，取1ml尿液置于1.5 ml離心管中，2000 r/min離心5min，取上清液；大鼠處死前稱重，以3%戊巴比妥1.5ml/kg 的劑量腹腔注射麻醉，心臟取血，置于10 ml離心管中，3500 r/min離心15min，分離血清，檢測血清中胰島素含量；取雙側(cè)腎臟，用濾紙吸干腎表面血液后稱重，取特定部位腎組織固定于10%甲醛中用于病理HE染色。（3） 實驗指標(biāo)觀察與檢測：①一般情況觀察：觀察各組大鼠的精神狀態(tài)、活動狀況、毛發(fā)、體重及排便等情況。②血糖的測定：各組大鼠分別于灌胃后第2、4、6周尾靜脈采血測定空腹血糖。③尿液生化指標(biāo)的測定：取離心后上清液置于自動生化儀中測定24h尿蛋白總量（U-TP）與尿微量白蛋白（U-ALB）。④腎肥大指數(shù)的測定：將各組大鼠麻醉后處死，迅速剖腹取雙腎，用濾紙吸干腎表面血液后稱重。腎肥大指數(shù)=兩側(cè)腎重量之和（mg）/體重量（g）。⑤胰島素的測定：酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定各組大鼠血清中胰島素的含量，操作按ELISA試劑盒說明書。⑥腎臟病理檢查：取腎皮質(zhì)，10%甲醛固定，乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、制成3μm石蠟切片，HE染色后光鏡下觀察。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，兩兩比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠身體機(jī)能比較 正常對照組大鼠精神狀況良好，毛發(fā)有光澤，動作自如、反應(yīng)靈敏。模型組大鼠精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，活動倦怠，毛發(fā)雜亂泛黃無光澤偶有脫毛，尿量多，大便稀；川芎嗪組大鼠反應(yīng)較靈敏，毛色可，尿多、大便尚可。

2.2 各組大鼠體重與血糖比較 正常組大鼠體重在實驗期間持續(xù)增長，其他各組大鼠的體重均有所增長；實驗結(jié)束時，模型組大鼠體重與正常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），與川芎嗪組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。模型組大鼠的血糖在造模成功后一直處于高血糖狀態(tài)，且逐漸上升，與正常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；川芎嗪組在藥物干預(yù)后與模型組比較，血糖下降明顯（P＜0.05）見圖1。

圖1 川芎嗪對糖尿病大鼠體重與血糖的影響

2.3 各組大鼠24h尿量及U-TP、U-ALB比較 造模6周后，模型組大鼠24h尿量及24h尿液中總U-TP、 U-ALB的含量與正常組比較上升明顯（P＜0.01）；給藥6周后，川芎嗪組大鼠24h尿量及24h尿液中總U-TP含量與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但24h總U-ALB的含量與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 川芎嗪對糖尿病大鼠24h尿量及總U-TP、U-ALB的影響

2.4 各組大鼠腎重、腎指數(shù)的比較 造模6周后，模型組大鼠的腎重與腎肥大指數(shù)與正常組比較明顯增大（P＜0.01）；給藥6周后，川芎嗪組大鼠腎重與腎肥大指數(shù)與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

2.5 各組大鼠血清胰島素含量的比較 造模6周后，模型組大鼠血清中胰島素的含量與正常組比較下降明顯（P＜0.05）；給藥6周后，川芎嗪組大鼠血清中胰島素的含量與正常組比較亦下降明顯（P＜0.05），但模型組、陽性組、川芎嗪組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）見圖4。

圖4 川芎嗪對糖尿病大鼠血清胰島素含量的影響

2.6 各組大鼠腎臟病理切片的比較 腎組織HE染色結(jié)果顯示，正常組大鼠腎臟組織中腎小球、腎小管基本結(jié)構(gòu)和形態(tài)均未見異常，囊腔內(nèi)無滲出，上皮細(xì)胞形態(tài)正常；造模6周后，模型組大鼠腎小球肥大，腎小管擴(kuò)張及炎性細(xì)胞浸潤，毛細(xì)血管基底膜增厚，系膜基質(zhì)增生，部分管腔蛋白滲出；給藥6周后，川芎嗪組大鼠僅有少量腎小管上皮細(xì)胞空泡樣變，毛細(xì)血管基底膜增厚不明顯，少量管腔蛋白滲出。見圖5。

圖5 川芎嗪對大鼠腎組織病理變化的影響（HE，×400）

3 討論

糖尿病是由多種因素引起的胰島素分泌絕對或相對不足所致機(jī)體代謝紊亂的綜合征。隨著人民生活水平的不斷提高，城市化和老齡化日益加劇，糖尿病患病率逐漸上升。高血糖是糖尿病發(fā)病過程中的主要特征之一，可致多種臟器損傷的慢性并發(fā)癥。DN是糖尿病引起的嚴(yán)重和危害性最大的一種慢性并發(fā)癥，是糖尿病全身性微血管病變表現(xiàn)之一。早期DN表現(xiàn)為尿微量白蛋白排泄增加，腎小球濾過率增高及腎臟體積增大，隨著病情的發(fā)展惡化，一旦出現(xiàn)臨床蛋白尿，提示病情已進(jìn)入中晚期，腎功能衰竭將不可逆轉(zhuǎn)，成為糖尿病患者死亡的主要原因之一。因此，早期控制、減少尿蛋白，對延緩DN的發(fā)生、發(fā)展，提高生存率有著重要的意義。西醫(yī)認(rèn)為本病的發(fā)生與慢性高血糖所致的糖代謝異常、脂代謝紊亂、腎臟血流動力學(xué)改變、高血壓、腎小球足細(xì)胞凋亡、細(xì)胞因子、氧化應(yīng)激、遺傳等因素有關(guān)，其病理改變?yōu)槟I小球毛細(xì)血管基底膜增厚、腎小球系膜基質(zhì)增生、腎小球硬化與腎小管間質(zhì)增生。中醫(yī)認(rèn)為DN既屬消渴病，又歸屬于腎病范疇內(nèi)的水腫，尿濁，脹滿，關(guān)格等疾中，病機(jī)則以腎虛為主，初期精微外泄，久則氣化不利，水濕內(nèi)停，甚則濁毒內(nèi)蘊(yùn)，臟氣虛衰，易生變證，總屬本虛標(biāo)實之病。

川芎嗪主要來源于傘形科植物川芎的根莖、大戟科植物痛風(fēng)麻瘋樹的莖及姜科植物溫郁金的根莖，且可進(jìn)行人工合成［6］?，F(xiàn)代藥理研究表明川芎嗪具有抑制血小板聚集、拮抗Ca2+、清除自由基、保護(hù)心腦血管、增加腎流量、利尿等作用［7］。同時，在臨床，川芎嗪單用或聯(lián)用其他藥物對糖尿病及其并發(fā)癥的治療亦有重要作用。

本實驗以血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑纈沙坦為陽性對照，觀察川芎嗪對糖尿病大鼠降血糖及腎臟保護(hù)作用。實驗采用STZ復(fù)制糖尿病大鼠模型，川芎嗪灌胃，HE染色觀察腎臟病理改變。本資料顯示，SD大鼠經(jīng)STZ尾靜脈注射后1周血糖即顯著上升，＜6周可見模型組大鼠身體機(jī)能明顯下降，體重增長緩慢，血糖持續(xù)上升，24 h尿量、尿液U-TP、U-ALB較正常組均有顯著性升高，血清胰島素含量較正常組顯著降低，光鏡下可見腎臟病理改變明顯加重，這表明DN模型的制作是成功的。經(jīng)藥物干預(yù)6周后，川芎嗪組大鼠與模型組比較，身體機(jī)能明顯改善，體重明顯增長，血糖、24h尿量、U-TP、腎重、腎肥大指數(shù)均明顯下降，腎臟病理改變明顯減輕，U-ALB與血清胰島素含量均無明顯變化，表明川芎嗪對糖尿病大鼠具有一定的降血糖及腎臟保護(hù)作用。然而大鼠血清胰島素含量并未明顯增加，表明川芎嗪降血糖的作用機(jī)制并非通過增加胰島素的分泌，故其降血糖的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，川芎嗪對糖尿病大鼠具有一定的降血糖及腎臟保護(hù)作用，但其降血糖機(jī)制并非通過增加胰島素的分泌，值得今后進(jìn)一步研究。

1 陸再英，鐘南山.內(nèi)科學(xué).第七版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2010：770.

2 高學(xué)敏.中藥學(xué).第二版.中國中醫(yī)藥出版社，2009，428.

3 宋春紅，李莉，張永歡，等.川芎嗪與氨基胍聯(lián)合治療對新生鏈脲佐菌素糖尿病大鼠肝功能的影響.中國病理生理雜志，2013，29（7）：1322～1326.

4 李會娟，沈和榮，邵桂芳，等.川芎嗪對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變IL-1β和ICAM-1表達(dá)的影響.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012，21（36）：4016～4017.

5 陳群，陳少強(qiáng).氨基胍與川芎嗪對糖尿病大鼠胰島B細(xì)胞的保護(hù)作用.實用臨床醫(yī)藥雜志，2010，14（12）：1～3.

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7 徐廣俠.川芎嗪的藥理作用及臨床應(yīng)用觀察.中國衛(wèi)生產(chǎn)業(yè)，2014，11（35）：187～188.

Objective To research the effect of blood sugar reduction and renal protection of ligustrazine on diabetic rats. Methods 24 diabetic rats successfully induced by streptozotocin （STZ） were randomly divided into ligustrazine group， positive control group， model group （DM group），and treated with ligustrazine 200 mg·kg-1·d-1， valsartan 25 mg·kg-1·d-1， physiological saline 10 ml·kg-1·d-1 respectively. 8 healthy rats were served as normal control group （NC group， physiological saline 10ml/kg·d）. All rats were treated for 6 weeks continuously. The rats weighed weekly after treating，the blood sugar was measured on 2th， 4th， 6th week. The 24h total urine was measured by metabolic cage， total urine protein （U-TP） and total micro albumin（U-ALB） were measured on 6th week； The blood sample was obtained from the heart by puncture， and rats were executed at the end of 6th week，， serum insulin（INS） was detected by Enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）. Kidney hypertrophy index was calculated and pathological changes of kidneys were also observed under light microscope. Results In DM group， blood glucose， total urine， U-TP and U-ALB， kidney weight and kidney hypertrophy index were signifi cantly higher than that in NC group （P<0.01， P<0.05）， the serum INS was signifi cantly lower， the physical conditions were signifi cantly decreased， and renal pathological status was signifi cantly serious. After ligustrazine intervention， blood glucose， total urine and U-TP， kidney weight and kidney hypertrophy index were signifi cantly lower（P<0.05）， but serum INS had no signifi cant change， the physical conditions and renal pathological status were signifi cantly improved. Conclusion Ligustrazine has some effect on reducing blood sugar and protecting kidney on diabetic rats， and its mechanism of reducing blood sugar was irrelevant with INS.

Ligustrazine Diabetes Protective effect of kidney Blood sugar reducing

國家自然科學(xué)基金（81403373）；浙江省中醫(yī)藥科技計劃（2013ZB033）；浙江省教育廳研究項目（Y201226091）

310053 浙江中醫(yī)藥大學(xué)